AULA 9 M TODOS DE AN LISE

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MÉTODOS DE ANÁLISE
Docente: Ma. Aline Ozana de Souza
ETAPAS DA ANÁLISE MICROBIOLÓGICA
1. Amostragem; 
2. Preparação da amostra; 
3. Contagem de microrganismos.
ANÁLISE MICROBIOLÓGICA
• Para que os resultados da análise microbiológica de um alimento reflitam de
forma fiel as condições microbiológicas do alimento analisado, vários
requisitos devem ser atendidos.
• Além do uso de métodos analíticos adequados, é necessário assegurar que as
amostras analisadas representam o alimento como um todo.
AMOSTRAGEM
AMOSTRAGEM
• Especificação de dados; 
• Planos de amostragem
• Evitar contaminação com outros alimentos; 
• Transporte:
- alimentos perecíveis: 0-4ºC;
- alimentos congelados: < 18ºC
• Análise no máximo em 36 horas.
PLANOS DE AMOSTRAGEM
• Podemos fazer a análise microbiológica do produto todo ou de um lote inteiro de
produtos?
• Por razões de custo e pelo caráter destrutivo deste tipo de análise, analisa-se amostras
retiradas do alimento ou do lote.
• A determinação do número de amostras a serem analisadas e os critérios de decisão
compõem o que se denomina um plano de amostragem.
• Planos de amostragem foram inicialmente propostos pela Comissão Internacional de
Especificações Microbiológicas para Alimentos em 1974.
• 15 categorias distintas
• De acordo com o grau de risco que os microrganismos contaminantes nos alimentos
oferecem ao consumidor.
• Este grau de risco é determinado por:
- tipo de microrganismo presente;
- quantidade no alimento;
- probabilidade de seu número aumentar, diminuir ou se manter estável no alimento
até o momento de ser consumido.
PLANOS DE AMOSTRAGEM
• Em relação à análise microbiológica de alimentos, é necessário definir alguns
conceitos importantes, como lote, n, c, m e M.
• Lote: total de unidades de um produto produzido, manuseado ou armazenado em
condições idênticas, dentro de um determinado período;
• n: número de unidades retiradas de um lote que serão analisadas independentemente
(unidades amostrais)
• c: número máximo aceitável de unidades do lote em que as contagens microbianas
estão acima do limite mínimo (m) e abaixo do limite máximo tolerado (M) para o
microrganismo investigado (unidades defeituosas).
PLANOS DE AMOSTRAGEM
• Os planos de amostragem podem ser de duas ou de três classes.
• Plano de duas classes = o produto analisado é classificado como aceitável
ou inaceitável, ou seja, o resultado está abaixo ou acima de um critério pré-
estabelecido, respectivamente.
• Plano de três classes = o alimento analisado pode pertencer ainda a uma
terceira categoria, denominada marginal, definida por resultado que se
encontra entre os limites m e M
PLANOS DE AMOSTRAGEM
• Plano de 3 classes
PLANOS DE AMOSTRAGEM
• O poder discriminatório de um plano aumenta com o aumento de n para um mesmo
valor de c.
• Exemplo da pesquisa de Salmonella em uma linguiça crua.
• Se o produto será congelado, portanto o risco tende a diminuir, o plano de
amostragem do produto congelado é da categoria 10, ou seja, devem ser analisadas 5
amostras do mesmo lote (n = 5), e nenhuma pode ser positiva para este patógeno (c
= 0).
PLANOS DE AMOSTRAGEM
• Se a linguiça for mantida em refrigeração, sendo pouco provável que o
patógeno se multiplique, deve-se aplicar o plano da categoria 11, ou seja, n =
10, c = 0;
• Se o produto for mantido em temperatura ambiente, com alta probabilidade
de multiplicação de Samonella, deve-se aplicar a categoria 12, ou seja, n = 20 e
c = 0.
PLANOS DE AMOSTRAGEM
• Considerando que as decisões de aprovar ou rejeitar um lote são baseadas
nos resultados das unidades retiradas deste lote, deve-se levar em conta que
este resultados não necessariamente indicam a situação exata do lote.
• Existe sempre a possibilidade de rejeitar um lote que esteja satisfatório, assim
como aprovar um lote insatisfatório.
PLANOS DE AMOSTRAGEM
• Na legislação brasileira sobre requisitos microbiológicos em alimentos:
• Portaria no 146/1996, do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento;
• Resolução RDC-12, 2001, da Agencia Nacional de Vigilância Sanitária do Ministério
da Saúde
• Determinam os valores de n, c, m e M nos critérios microbiológicos para aprovação
de alimentos disponibilizados para a população, adotando n = 5 para todos os planos
de amostragem, e valores de c, m e M que variam de acordo com o alimento e o
microrganismo considerado.
PLANOS DE AMOSTRAGEM
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
• Homogeneização da amostra;
* Água peptonada a 1%
* Em alimentos ricos em lipídios, deve-se usar agentes tensoativos para
promover a emulsificação.
• Cuidado: velocidade e tempo ⇒ evitar aquecimento da amostra e danos aos
microrganismos;
• Melhor método: Stomacher.
STOMACHER
STOMACHER
• Homogeneizador: esmagar, extrair, misturar, homogeneizar e preparar as
amostras que serão analisadas.
- Mantem em suas condições originais;
- Evita qualquer tipo de contaminação cruzada, pois nenhuma parte do
equipamento entra em contato direto com a amostra, tornando portanto
desnecessária a limpeza do equipamento entre os processos.
CONTAGEM DE MICRORGANISMOS
• MÉTODOS DIRETOS: 
1) Contagem por plaqueamento;
2) Método do Número Mais Provável 
CONTAGEM POR PLAQUEAMENTO
• Plaqueamento de alíquotas do alimento homogeinizado e de suas diluições 
em meios de cultura sólidos adequadamente selecionados em função do(s) 
microrganismo(s) a ser(em) enumerado(s).
- Semeadura em superfície = amostra transferida para placa contendo meio de 
cultura.
- Semeadura em profundidade = amostra transferida 
para placa vazia e depois adiciona-se o meio de cultura.
TIPOS DE MEIO DE CULTURA
• Sólidos: usa-se o ágar (polímero de galactose) como agente solidificante, em 
concentração de 1,35 a 2%
• Semi-sólidos: usa-se o ágar em concentrações de 0,2 a 0,75% (tubos de 
ensaio)
• Líquidos: não tem ágar (tubos de ensaio)
• Técnicas de semeadura
CONTAGEM POR PLAQUEAMENTO
CONTAGEM POR PLAQUEAMENTO
EXERCÍCIO
• Placa 1 = 12 colônias; diluição 10 elevado a 4
• Placa 2 = 52 colônias; diluição 10 elevado a 5
• Placa 3 = 198 colônias; diluição 10 elevado a 2
DETERMINAÇÃO DO NÚMERO MAIS 
PROVÁVEL
• Também conhecida como técnica dos tubos múltiplos
• Estimar a contagem de alguns microrganismos: 
- Coliformes totais
- Coliformes fecais
- E. coli
- S. aureus
• A análise por NMP é recomendada quando:
a) É esperado, no alimento em análise, um baixo número do microrganismo
alvo (<100/g ou mL) ou quando, em função de limitações do método e das
diluições necessárias para o alimento específico, o padrão de
aceitação/rejeição não pode ser atendido por meio de provas de contagem.
b) Quando, devido ao processo tecnológico sofrido pelo alimento, as células
presentes estejam lesadas fisiologicamente (células estressadas), não tendo
portanto condições de formar colônias em meios sólidos seletivos.
DETERMINAÇÃO DO NÚMERO MAIS 
PROVÁVEL
• Etapas
- Homogeneização da amostra
- 3 diluições decimais seriadas
- De cada diluição, alíquotas iguais são transferidas para 3 ou 5 tubos contendo 
meio de cultura escolhido e um tubo coletor de gás (tubos de Durhan)
- Incubação
- Identifica-se os positivos
DETERMINAÇÃO DO NÚMERO MAIS 
PROVÁVEL
• Identificação dos positivos
- Coliformes e E. coli = turvação do meio e produção de gás
- S. aureus = turvação do meio
• Quantificação
- Pelo número de tubos positivos determina-se o Número mais provável por grama
de produto, tendo como base a tabela estatística de Hoskins para 3 ou para 5 tubos.
DETERMINAÇÃO DO NÚMERO MAIS 
PROVÁVEL
Coliformes TotaisAs bactérias do grupo coliforme são consideradas os principais indicadores de
contaminação fecal.
O grupo coliforme = inclui os gêneros de bactérias Klebsiella, Escherichia,
Serratia, Erwenia e Enterobactéria.
Todas as bactérias coliformes são gram-negativas, de hastes não esporuladas
que estão associadas com as fezes de animais de sangue quente e com o solo.
Coliformes Termotolerantes
• O grupo dos coliformes termotolerantes tem a mesma definição dos
coliformes totais, porém restringem-se a bactérias capazes de fermentar a
lactose produzindo gás, em 24 horas a 44,5-45,5ºC.
Coliformes fecais
• As bactérias coliformes fecais reproduzem-se ativamente a 44,5 ºC e são capazes
de fermentar o açúcar.
• O uso da bactéria coliforme fecal para indicar poluição sanitária mostra-se mais
significativo que o uso da bactéria coliforme "total", porque as bactérias fecais
estão restritas ao trato intestinal de animais de sangue quente.
• A determinação da concentração dos coliformes assume importância como
parâmetro indicador da possibilidade da existência de microrganismos
patogênicos, responsáveis pela transmissão de doenças de veiculação hídrica, tais
como febre tifóide, febre paratifóide, disenteria bacilar e cólera.
CONTAGEM DE MICRORGANISMOS
• MÉTODOS INDIRETOS
- Técnicas de Impedância-Condutância: baseada na propriedade que o
microrganismo tem de alterar a impedância e/ou a condutância de um meio.
Essas alterações ocorrem como consequência da mudança da composição
química desse meio devido à atividade metabólica dos microrganismos
presentes.
• Técnicas de Bioluminescência: baseada no princípio de que a quantidade
de ATP presente em um sistema será relacionada ao número de células
metabolicamente ativas, inclusive microrganismos.
• Uma das formas mais simples de se medir a quantidade de ATP é através do
sistema luciferina-luciferase, obtido da cauda de vaga-lumes. O ATP reage
com a luciferase, na presença de luciferina, formando um complexo que, em
contato com o oxigênio e com o íon magnésio, sofre uma descarboxilação,
com emissão simultânea de luz. A quantidade de luz emitida é medida, sendo
proporcional a quantidade de ATP presente, que por sua vez, é proporcional
à quantidade de microrganismos viáveis presentes.
CONTAGEM DE MICRORGANISMOS
• Microcalorimetria: baseada na produção de calor produzida pelos
microrganismos ao se multiplicarem.
• Radiometria: baseado no monitoramento da produção de CO2 radioativo por
microrganismos em um caldo suplementado com substrato radioativo (glicose,
formato, glutamato, etc). Os microrganismos metabolizam esses componentes
liberando CO2 radioativo, cuja quantidade é proporcional à quantidade de
microrganismos presentes.
CONTAGEM DE MICRORGANISMOS