ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ALIMENTOS

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ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ALIMENTOS
· As análises são fundamentais para verificar as condições de higiene do preparo, verificar o risco à saúde do consumidor, estimar a vida útil do alimento, identificar agentes etiológicos mais prováveis na toxinfecção alimentar e verificar a adequação dos padrões e especificações microbiológicas. Mais precisamente, investiga a presença ou a ausência de microrganismos no produto, quantifica os microrganismos presentes, identifica e caracteriza as diferentes espécies microbianas.
· Muitos métodos podem ser utilizados para detecção qualitativa e quantitativa de microrganismo em alimentos, variando de acordo o tipo de alimento e do microrganismo escolhido como indicador. O importante é que sejam métodos aprovados por órgãos reguladores.
· Métodos convencionais: São aqueles desenvolvidos a muitos anos e empregados como oficiais.
· Métodos rápidos: Foram desenvolvidos pra diminuição de custo e geram resultados mais rápidos. Mesmo sendo aprovados por órgãos oficiais, podem ser utilizados somente para controle, sendo que resultados negativos são considerados como definitivos, mas resultados positivos são considerados presuntivos e devem ser confirmados por métodos convencionais.
· O sucesso de uma análise microbiológica depende também da amostragem, que são as etapas de coleta, transporte, estocagem, preparação das amostras e, por fim, as técnicas de análises. Todas essas etapas são fundamentais para a exatidão dos resultados.
Conceitos importantes
· Lote: Quantidade de alimentos de mesma composição e características físicas, químicas e sensoriais, produzida e manuseada nas mesmas condições e mesmo período.
· Amostras de lote: É uma fração do total produzido, retirada do acaso, para avaliar as condições do lote.
· Unidades de amostra: São as embalagens individuais ou alíquotas individuais e, para avaliação do lote, são analisados separadamente.
· Unidade analítica: Quantidade de alimento efetivamente utilizada na realização de um ou mais ensaios da unidade da amostra.
AMOSTRAGEM
· A RDC n° 331 é, atualmente, a legislação vigente para padrões microbiológicos para alimentos. Ela traz que deverão ser utilizadas as metodologias para coleta, armazenamento, transporte e análise de amostras dos alimentos estabelecidas em, pelo menos, uma das referências trazidas na regulamentação.
· O plano de amostragem é definido pelo número de unidades a serem coletadas para análise e os critérios adotados para aprovação ou reprovação do produto. Considerar os objetivos da análise microbiológica, natureza do produto, método analítico a ser empregado e quais os critérios microbiológicos serão adotados.
· O plano de amostragem de lotes classifica o plano em duas classes (aceitável ou inaceitável) ou três classes (aceitável, intermediário, mas aceitável ou inaceitável). Ele será por atributos (qualitativo, conceito “passo ou não passo”) ou por variáveis (quantitativo, características expressas por um número considerando m e M). 
Instrução normativa n° 60/2019
· Na IN n° 60/2019, a pesquisa de coliformes foi substituída pela pesquisa de Escherichia coli ou Enterobacteriaceae e houve substituição do parâmetro de Clostrídeos Sulfito Redutores à 46°C por Clostridium perfringens para atualização frente às metodologias internacionalmente conhecidas.
· Por que a IN não estabelece padrões para todos os indicadores higiênico-sanitários? Segundo a ANVISA, é porque seu foco é a saúde pública, portanto a IN teve como objetivo estabelecer limites, principalmente para microrganismos patogênicos ou que indicam contaminação ou falha de processamento.
· Perigo (hazard): O agente como causa potencial de danos à saúde.
· Risco(risk): A probabilidade de ocorrência de dano, combinada à gravidade desse dano como consequência da ação de um perigo.
COLETA DE AMOSTRAS
· A coleta de alimentos em embalagens individuais deve ter, no mínimo, 200 g ou ml e deve ser a embalagem comercial, individual, fechada e intacta. Para a coleta de alimentos acondicionados em tanque ou grandes embalagens, deve transferir porções representativas para frascos ou bolsas estéreis, sempre em condições assépticas.
· Alimentos acondicionados em tanque ou grandes embalagens: Misturar a massa do alimento antes da coleta, se não for possível, as amostras devem ser retiradas em diferentes partes. O frasco utilizado para coleta não deverá ser introduzido diretamente no produto.
· Alimentos envolvidos em casos de doenças de origem alimentar: Nesse caso, podem ser aplicadas unidades amostrais menores. Coletar e analisar amostras de todos os alimentos suspeitos o mais cedo possível; não adianta coletar amostras de alimentos que tenham sofrido abuso de temperatura ou que já se encontram em deterioração; se não houver sobras das refeições suspeitas deve ser coletada amostras de refeições similares preparadas sobre as mesmas condições; coletar amostras de ingredientes e matéria-prima utilizadas na preparação das refeições suspeitas; coletar os vasilhames onde as refeições suspeitas se encontravam acondicionadas.
· Alimentos que passam pelo processo de esterilização comercial: Cada unidade amostral deve ser composta de, no mínimo, três unidades do mesmo lote. Quando se tratar da aplicação do plano de amostragem estatística, devem ser coletadas, no mínimo, três conjuntos de unidades amostrais. Produtos alterados ou deteriorados não são coletados.
· Água engarrafada: Deve ser coletada em embalagem original e lacrada, homogeneizar e coletar volumes menores. Desprezar o volume inicial e coletar a amostra em um frasco estéril adequado.
· Água de torneiras e tubulações: Limpar área externa, abrir totalmente a torneira e deixar a água fluir por 2/3 minutos. Reduzir o fluxo para coletar a amostra sem respingos para fora do frasco.
· Água de poço ou cisterna com bomba: Bombear a água por 5 a 10 min para estabilizar temperatura. Cuidado para não contaminar a amostra com material acumulado na superfície da água. Se não houver bomba, introduzir o fraco diretamente no poço.
· Água de rios, lagos ou reservatórios: Mergulhar frasco com boca para baixo, direcionar a boca para a correnteza e elevar ligeiramente. 
· Água clorada: Deve ter cloro residual neutralizado imediatamente após a coleta para impedir a contaminação de seu efeito bactericida sobre a microbiota presente.
Transporte e estocagem
· Alimentos com baixa atividade de água: Inclui alimentos desidratados, secos ou concentrados e são estáveis microbiologicamente. Podem ser transportados e estocados à temperatura ambiente, deve-se ter cuidado para proteger a umidade do alimento.
· Alimentos congelados: Transportar e manter congeladores até o momento da análise; não pode sofrer descongelamento parcial ou total durante o transporte; o transporte deve ser feito em caixas de isopor com gelo seco; o produto não pode ter contato com o gelo seco; recomenda-se a temperatura de estocagem a 18°C negativos.
· Alimentos refrigerados: Transportar e manter na forma refrigerada; recomenda-se a temperatura entre 0 e 4,4°C e intervalo de 36 horas entre coleta e análise; transportar em caixas de isopor com sachês de gelo em gel ou gelo comum acondicionado em bolsas plásticas. Se não puder cumprir, deve-se congelar a amostra.
· Alimentos comercialmente estéreis em embalagens herméticas: Podem ser transportados e estocados em temperatura ambiente; proteger de temperaturas superior a 40°C; embalagens estufadas devem ser acondicionadas em bolsas plásticas devido ao perigo de vazamento de material de alto risco microbiológico sob refrigeração para evitar explosão.
· Água engarrafada na embalagem original: à temperatura ambiente; sem refrigeração.
· Embalagens abertas: Sob refrigeração; intervalo entre coleta e análise de 8h; não ultrapassar 48h para análise.
· Para avaliação da conformidade da água potável: Sob refrigeração; intervalo entre coleta e análise menor que 30h (coliformes) ou 6h (contagem de mesófilos).
· Para avaliação da conformidade da água não potável: Sob refrigeração; intervalo entre coleta e análise menor a 6h.RECEPÇÃO DA AMOSTRA
· Quando chegar ao laboratório, deve-se analisar as condições da embalagem e transporte da amostra. Se a embalagem está íntegra e lacrada, aceitamos a amostra; se rasgada, furada, violada, com corpos estranhos, rejeitamos a amostra. Se as condições de transporte foram adequadas, aceita amostra; se transporte inadequado, rejeita a amostra.
· Se o interessado estiver encaminhado a amostra violada, pode prosseguir a análise dependendo do tipo de embalagem, produto, microrganismo, porém, no laudo deve constar as condições em que foi recebida.
Preparação da amostra para análise
· Para isso deve ser usadas técnicas corretas de assepsia em todas as etapas, realizar homogeneização prévia da amostra e, em casos de amostras sólidas, elas devem ser representativas da amostra inteira. 
· A porção da amostra a ser analisada deve corresponder a 25g, 50g ou 100g (ou ml), os produtos sólidos ou semissólidos devem ser homogeneizados com diluente apropriado (água fosfata tamponado com pH 7,2 ou água peptonada a 0,1%). Alimentos ricos em gordura devem ser adicionados de agentes tensoativos para promover a emulsificação.
· A homogeneização pode ser através de homogeneizadores de laboratório ou liquidificadores convencionais. O tempo e a velocidade devem ser controlados a fim de evitar aquecimento das amostras e consequente dano aos microrganismos. Deve ser evitada a formação de aerossóis. 
Métodos de contagem de microrganismos
· Contagem por plaqueamento: Método convencional de contagem de microrganismo que consiste no plaqueamento de alíquotas do alimento homogeneizado e de suas diluições em meios de cultura sólidos adequadamente selecionados em função do microrganismo a ser enumerado. Pode ser realizado através da semeadura de superfície, semeadura de profundidade ou plaqueamento por espiral. Por fim, a contagem das colônias poderá ser manual ou automática.
· Técnica de membrana filtrante: O produto é homogeneizado e filtrado através de membranas filtrantes de acetato de celulose ou nitrocelulose, de porosidade adequada(0,45mg), que permite a passagem de líquidos retendo os microrganismos. Após a filtração e retenção dos microrganismos, a membrana é transferida para a superfície das placas de Petri contendo o meio de cultura. Após a incubação, as colônias são enumeradas, visualmente ou através de contadores eletrônicos.
· Técnica de epifluorescência direta: Os microrganismos retidos na superfície de membranas de policarbonato são submetidos à coloração com um corante nucleofílico. Depois, são observados ao microscópio de epifluorescência onde, células de fluorescência laranja, avermelhada ou marrom correspondem a células viáveis e, células verdes são mortas.
· Contagem em placas Petrifilm: Método avançado para contagem de microrganismos em alimentos que já vem com o microrganismo desidratado, precisando apenas inocular 1ml da amostra diluída e incubar.
· Determinação do número mais provável: Estima a contagem de microrganismos, como coliformes totais, coliformes e S. aureus. Após homogeneização, o produto é submetido a pelo menos três diluições decimais seriadas. Alíquotas iguais de cada diluição são transferidas para três ou para cinco tubos contendo o meio de cultura escolhido e um tubo coletor de gás. Todos os tubos são incubados e, em seguida, os positivos são identificados através da turvação e produção de gás ou apenas turvação (S. aureus).
· Métodos indiretos: impedância-condutância, bioluminescência, microcalorimetria e radiometria.
· Técnicas de impedância-condutância: Se baseiam na propriedade que os microrganismos têm de alterar a impedância e/ou a condutância de um meio. A formação e o acúmulo dos metabólitos finais na multiplicação microbiana alteram a condutância (mensurado pelo sistema Malthus) e na impedância elétrica no meio (mensurado pelo Bactometer).
· Bioluminescência: Se baseia no princípio de que a quantidade de ATP presente em um sistema está relacionado ao número de células metabolicamente ativas, inclusive microrganismos. A quantidade de ATP é medida através do sistema luciferina-luciferase, onde o ATP reage com a luciferase quando tem luciferina presente formando um complexo que, em contato com o O2 e com o magnésio é descarboxilado e emite luz. A quantidade de ATP e luz é proporcional à quantidade de microrganismos viáveis presentes. 
· Microcalorimetria: Na multiplicação de microrganismos há geração de calor, que é proporcional à quantidade de microrganismos presentes em um sistema. Instrumentos muito sensíveis são capazes de detectar mínimas alterações de calor e consequentemente estimar a carga microbiana na amostra.
· Radiometria: Método desenvolvido para o monitoramento da produção de CO2 radioativo, por microrganismos em um caldo suplementado com substrato radioativo. Os microrganismos metabolizam esses componentes, liberando CO2 radioativo, cuja quantidade é proporcional ao número de microrganismos. 
Isolamento e identificação de microrganismos patogênicos
· Para isso são utilizados métodos convencionais que usam técnicas bioquímicas miniaturizadas, imunológicas e genéticas.
· Técnicas bioquímicas miniaturizadas: Utilizam sistemas prontos para identificação de microrganismos não-fermentadores, Gram-positivos, anaeróbios, bactérias láticas, bolores e leveduras. Os meios de cultura podem estar na forma desidratada ou liofilizada, impregnado em tiras ou disco de papel ou prontos para uso.
· Técnicas imunológicas: Baseadas em reações entre antígenos e anticorpos específicos, onde são utilizados os anticorpos policlonais (mistura de anticorpos) ou anticorpos monoclonais (aqueles secretados por hibridomas). Podem ser subdivididas em 5 técnicas: imunocaptura, imunoenzimáticas, imunoimobilização, Co-aglutinação e imunofluorescêcnia. 
· Técnicas genéticas: Podem ser divididas em hibridização de DNA e reação de polimerase em cadeia (PCR). Os de hibridização de DNA podem ser em base líquida ou sólida e são realizados com sondas genéticas que são segmentos de DNA de fita simples, capazes de reconhecer e formar com fitas complementares de DNA ou RNA. O PCR são ciclos que podem se repetir de 20 a 30 vezes e, em cada ciclo, ocorre a desnaturação do DNA e separação em fitar simples, ligação dos oligonucleotídios iniciadores e a polimerização com formação de fita complementar. Após sintetizada a primeira cópia, o processo recomeça.
Considerações finais
· A metodologia a ser adotada, na realização de análises microbiológicas de um produto qualquer, deve ser norteada pelos seguintes parâmetros: precisão pretendida, custo, tempo de análise, simplicidade de operação, treinamento e qualificação do analista, disponibilidade de reagentes, meios de cultura e outros suprimentos, aceitabilidade do método pelos órgãos oficiais e comunidade científica, reputação e assistência técnica dos fabricantes e disponibilidade do laboratório.