Avaliação laboratorial bioquímica I sobre cinética enzimática

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José Salgado Nº112435 M.I. Ciências Farmacêuticas 
ISCSEM 
 
 
Caracterização cinética da fosfatase ácida 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2016/2017 
 
 
1 
 
Resumo 
Na introdução vou explicar os conteúdos teóricos que tive por base para 
a realização da atividade experimental para poder fundamentar na discussão de resultados. 
Nos métodos vou identificar os materiais e reagentes utilizados e o procedimento da 
atividade experimental. 
Apresentarei posteriormente os resultados e a respetiva discussão. 
Farei por fim a conclusão, onde concluirei os conhecimentos adquiridos ao longo da feitura 
do relatório. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Introdução 
Os enzimas são proteínas que têm como funcionalidade aumentar a velocidade com que se 
atinge o estado de equilíbrio da reação, não interferindo no próprio equilíbrio da reação. As 
estruturas tridimensionais dos enzimas, são muito complexas, sendo que esta estrurura 
resulta do enrolamento espontâneo de uma ou mais cadeias polipeptídicas, permitindo-lhes 
assim uma elevada eficiência e especificidade. 
Os enzimas, catalisadores, são eficazes em quantidades mínimas em relação à quantidade 
dos reagentes e permanecem inalterados após a libertação dos produtos. As reações 
enzimáticas, ocorrem a uma velocidade de 104 − 1017 superior a velocidade correspondente 
da reação na ausência da enzima. 
 
 
 
 
 
 
Os enzimas são mais específicos em relação aos reagentes, sendo designados por substratos. 
 
Uma reação enzimatica pode ser representada por: 
𝐸 + 𝐴 ↔ 𝐸𝐴 ↔ 𝐸𝑃 ↔ 𝐸 + 𝑃 
 
A ligação do substrato ao centro ativo do enzima conduz à formação de complexos EA 
intermediários EA e EP que originam produtos. 
REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DE UMA REAÇÃO COM E 
SEM ENZIMA (IMAGEM RETIRADA DO MOTOR DE 
BUSCA GOOGLE) 
 
 
 
3 
 
O mecanismo que leva os enzimas a ligarem-se aos substratos pode ser determinado com 
base na velocidade da reação em função da concentração de substrato e enzimas utilizados. 
Isto é representado pela equação de Michaelis-Menten: 
𝑉 =
𝑉𝑚á𝑥.×[𝑆]
𝐾𝑚 + [𝑆]
 
Este trabalho consiste na na determinação dos parâmetros cinéticos da fosfatase ácida, 
catalisadora da hidrólise de monoésteres de fosfato produzindo fosfato inorgânico. 
O pnpp vai ser utilizado como substrato, que será convertido em fosfato inorgânico. 
Os inibidores são moléculas com estrutura semelhante ao substrato que diminuem a atividade 
de uma enzima, quando se associam, sendo possível distinguir diversos tipos de inibição 
reversível, diferenciados pelos gráficos Lineweaver-Burk. 
Os inibidores competitivos são aqueles que competem com o substrato pelo centro ativo, 
formando complexos enzima-inibidor. Este tipo de inibição é o mais frequente. 
Os inibidores anticompetitivos são aqueles que se ligam em exclusivo ao complexo enzima-
substrato, num local que não é o centro ativo. 
Os inibidores mistos, são aqueles que se ligam tanto à enzima livre como como ao complexo 
enzima-substrato ou num local onde a enzima apresenta duas formas estruturais diferentes, 
uma ativa e uma inativa. É exemplo de uma inibição mista, a inibição competitiva, uma vez 
que os valores de Ki são iguais tanto na enzima livre como substrato. 
 
 
 
 
 
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Métodos 
Materiais: 
• Micropipetas de 20, 100, 200, 1000 µL, Labnet; 
• Caixa de pontas amarelas para as respetivas micropipetas; 
• Caixa de pontas azuis para as respetivas micropipetas; 
• Espectrofotómetro (visível), Thermo Scientific; 
• Banho térmico, Precisterm; 
• Cuvettes de plástico; 
• Vortex, VELP Scientific; 
• Tubos de ensaio; 
• Gobelés; 
 
 
Reagentes: 
• Fosfatase ácida 0,1 U/ml em PBS; 
• KOH a 0,5M; 
• pNPP a 4,5mM; 
• Tampão acetado de sódio 1M,pH=5.7; 
• Água destilada; 
 
 
 
 
 
 
5 
 
Procedimento 
1. Ligar o banho térmico a 37ºC; 
2. Preparar os seguintes ensaios enzimáticos; 
 
Solução 
(ml) 
Tubo nº 
1 2 3 4 5 6 7 8 
Tampão de 
acetato de 
Sódio 1M 
pH 5.7 
0,250 0,250 0,250 0,250 0,250 0,250 0,250 0,250 
pNPP 10 
4,5mM 
- 0,0125 0,025 0,0625 0,125 0,250 0,625 1,250 
Água 
destilada 
2,15 2,1375 2,125 2,0875 2,025 1,9 1,525 0,9 
3. Iniciar o ensaio através da adição da enzima 
Fosfatase 
ácida 0,10 
U/ml 
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 
4. Incubar os tubos a 37ºC, durante um intervalo de tempo indicado 
Tempo de 
inicio de 
ensaio 
(min) 
0 1 2 3 4 5 6 7 
Tempo de 
incubação 
(min) 
10 
Tempo final 
do ensaio 
(min) 
10 11 12 13 14 15 16 17 
 6 
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5. Parar a reação através da adição de KOH 
KOH 0,5M 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 
 
6. Medir a absorvância de cada um dos tubos de ensaio preparado a 405nm, fazendo o 
zero com o espectrofotómetro com a solução do tubo de ensaio 1; 
7. Repetir todo o processo, substituindo a fosfatase ácida (solução de enzima), por água 
destilada; 
 
Resultados: 
 Valores registados da absorvância medida a 405nm 
 
Tubo de Ensaio 
Ensaio com 
Fosfatase Ácida 
0,1U/ml 
Ensaio com Água 
destilada 
Absorvância 
1 0,000 0,000 
2 0,013 0,002 
3 0,024 0,003 
4 0,044 0,010 
5 0,066 0,012 
6 0,115 0,037 
7 0,223 0,060 
8 0,367 0,160 
 
 
 
 
7 
 
• Cálculo da concentração de produto dos vários tubos de ensaio, recorrendo 
a equação de Lambert-Beer 
𝐴𝑏𝑠 = 𝜀×𝐿×𝐶 
 Sendo o coeficiente de extinção molar da metabolização do pNPP (produto) de 
18000 𝑀−1𝑐𝑚−1 
 
• Cálculo da velocidade da reação de cada tubo de ensaio, com recurso a 
seguinte formula 
𝑣 =
𝑐𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑡𝑜
∆𝑡
 
 Considerando ∆t=10 
 
Resultados Obtidos: 
 
 
 
 
Tubo 
de 
ensaio 
Ensaio com Fosfatase Ácida 0,1U/ml Ensaio com Água destilada 
Concentração 
de produto 
(𝑀) 
Velocidade 
da reação 
(𝑀. 𝑚𝑖𝑛−1) 
𝟏
𝒗
 
Concentração 
de produto 
(𝑀) 
Velocidade 
da reação 
(𝑀. 𝑚𝑖𝑛−1) 
𝟏
𝒗
 
1 0 0 0 0 0 0 
2 7,22×10−7 7,22×10−8 1,39×107 1,111×10−7 1,111×10−8 9,0×107 
3 1,33×10−6 1,33×10−7 7,52×106 1,667×10−7 1.667×10−8 5,99×107 
4 2,44×10−6 2,44×10−7 4,09×106 5,556×10−7 5,556×10−8 1,8×107 
5 3,667×10−6 3,667×10−7 2,73×106 6,667×10−7 6,667×10−8 1,5×107 
6 6,389×10−6 6,389×10−7 1,57×106 2,0556×10−6 2,0556×10−7 4,86×106 
7 1,238×10−5 1,238×10−6 8,08×105 3,333×10−6 3,333×10−7 3,0×106 
8 2,0389×10−5 2,0389×10−6 4,9×105 8,889×10−6 8,889×10−7 1,12×106 
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] 
• Cálculo da concentração de substrato dos vários tubos 
 Sendo que a concentração de pNPP se encontra em mM tem de ser convertida 
para M de modo a ficar todos os valores com as mesmas unidades, sendo que: 
4.5𝑚𝑀 = 4.5×10−3𝑀 
Calculando então depoisa concentração de substrato em cada tubo com recurso a 
seguinte equação: 
𝐶𝑖×𝑉𝑖 = 𝐶𝑓×𝑉𝑓 ↔ 𝐶𝑓 =
𝐶𝑖×𝑉𝑖
𝑉𝑓
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
0
0,0000005
0,000001
0,0000015
0,000002
0,0000025
0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014 0,0016
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R
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ão
[s]
Tubo de ensaio 
Concentração de 
Substrato 
𝟏
𝑪
 
1 0 0 
2 0.000015 66666,7 
3 0.00003 33333,3 
4 0.000075 13333,3 
5 0.00015 6666,67 
6 0.0003 3333,33 
7 0.00075 1333,33 
8 0.0015 666,67 
Gráfico 1 ( Fosfatase ácida ) – Representação da 
velocidade da reação em função da concentração de 
substrato 
 
 
9 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
y = 199,41x + 810574
R² = 0,9884
0
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
12000000
14000000
16000000
0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000
1/
V
1/[S]
0
0,0000001
0,0000002
0,0000003
0,0000004
0,0000005
0,0000006
0,0000007
0,0000008
0,0000009
0,000001
0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012 0,0014 0,0016
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R
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[S]
Gráfico 2 (Fosfatase ácida) – Representação 
do inverso da velocidade de reação em 
função do inverso da concentração de 
substrato 
Gráfico 3 (H20 destilada) - Representação da 
velocidade da reação em função da 
concentração de substrato 
 
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• Cálculo da velocidade máxima (𝑣𝑚á𝑥.) e da constante de Michaelis (𝐾𝑚), para 
o ensaio com fosfatase ácida 
Utilizando a seguinte equação conseguimos calcular a velocidade máxima (𝑣𝑚á𝑥.): 
• Ensaio da fosfatase ácida 
1
𝑣0
=
1
𝑉
+
𝐾𝑚
𝑉
.
1
[𝐴]
↔ 𝑦 = 810574 + 199,41.
1
[𝐴]
 
1
𝑉
= 810574 ↔ 𝑉 =
1
810574
↔ 𝑉 = 0.00000123 𝑚𝑖𝑛. 𝑀−1 
• Ensaio da água destilada 
1
𝑣0
=
1
𝑉
+
𝐾𝑚
𝑉
.
1
[𝐴]
↔ 𝑦 = 10000000 + 274,12.
1
[𝐴]
 
1
𝑉
= 10000000 ↔ 𝑉 =
1
10000000
↔ 𝑉 = 0,0000007 𝑚𝑖𝑛. 𝑀−1 
 
Sendo que 𝐾𝑚 corresponde à concentração de substrato com a qual a velociade inicial 
da reação enzimática atinge a metade da sua velocidade máxima: 
• Ensaio da fosfatase ácida 
𝐾𝑚
𝑉
= 𝑚 ↔
𝐾𝑚
𝑉
= 199,41 ↔ 𝐾𝑚 = 0,000245𝑀 
y = 274,12x + 1E+07
R² = 0,1068
0
10000000
20000000
30000000
40000000
50000000
60000000
70000000
0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000
1/
V
1/[S]
Gráfico 4 (H2O destilada) – 
Representação do inverso da 
velocidade de reação em função do 
inverso da concentração de substrato 
 
 
11 
 
• Ensaio da água destilada 
𝐾𝑚
𝑉
= 𝑚 ↔
𝐾𝑚
𝑉
= 274,12 ↔ 𝐾𝑚 = 0,000192 𝑀 
 
Discussão 
Numa preparação de ensaios enzimáticos com a fosfatase ácida estamos perante uma reação 
enzimática, enquanto que quando substituímos por H2O destilada estamos perante uma 
reação química. 
Como o tubo 1 foi usado como branco, desprezei-o na feitura das tabelas. 
Ao ser efetuado o gráfico de velocidade da reação vs. concentração de substrato vê-se que o 
𝑟2 no ensaio com a fosfatase ácida é muito superior ao do gráfico correspondeste ao ensaio 
com água. 
O 𝑟2 no ensaio com a água destilada tinha apresenta um valor muito distante de 1, ou por 
erro de pipetagem ou medição das absorvâncias. 
Comparando os ensaios e as velocidades calculadas, percebemos que a velocidade da reação 
com enzima presente é muita mais rápida, que no ensaio sem a presença desta, sendo a 
produção de produto mais alta. 
Posso ainda constatar que na atividade experimental, o fator de maior dependência é a 
concentração do substrato. 
A H2O destilada não pode ser considerada um inibidor visto que não compete com o substrato 
pelo centro ativo. 
 
Conclusão 
Após a conclusão da atividade experimental pude comprovar que os resultados foram os 
esperados, ou seja, foi concluída com sucesso. 
Durante a atividade experimental e o seu respetivo relatório, pude adquirir mais 
conhecimentos àcerca da atividade enzimática e dos cálculos a ela associados. 
 
 
 
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 Bibliografia 
HALPERN, Manuel Júdice; FREIRE, Ana Ponces; QUINTAS, Alexandre. Bioquímica- 
Organização molecular da vida. Lidel. 2008. 
Protocolo experimental fornecido pelo professor.