Aula 4. Microscopia e técnicas de coloração

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Microscopia e técnicas de 
coloração
Observação de microrganismos: o Microscópio
“ Instrumento utilizado para observar os microrganismos” 
Existem duas categorias de microscópios:
a) Microscópio ótico: feixes de luz / sistema lentes
b) Microscópio eletrônico: feixes de elétrons
Microscópio ótico composto:
 sistema composto : oculares + objetivas 
 Campo claro, campo escuro, contraste de fase, fluorescência
 imagem duas dimensões
 mais comum no laboratório de microbiologia 
 ampliação até 1.000 - 2.000 x 
Poder de resolução: 
 capacidade do sistema em distinguir dois pontos muito próximos
Resolução:
 depende comprimento de onda da luz e abertura numérica (A.N.) da 
objetiva 
 Abertura numérica : capacidade de concentrar a luz
 Lentes de maior aumento: maior AN
 poder de resolução máximo em microscópio ótico: 0,2 μm
 Olho ~ 0.1 mm; MEV ~ 1-3 nm; MET ~ 0.2–0.4nm
Principais características das objetivas do microscópio óptico :
Ampliação 
linear da 
objetiva
Diâmetro 
aprox. do 
campo(mm)
Abertura 
'Númerica
Dist. de trabalho 
aprox.(mm)
Poder de 
resolução 
(µm)
Máxima 
ampliação 
aprox. (ocular 
10x)
10x (o de 
pequeno 
aumento)
1.5 0.25 4.50 2.0 100 vezes
40-45x 
(objetiva à 
seco de 
grande 
aumento)
0.34 0.65 0.65 0.7 450 vezes
90-100x 
(objetiva de 
imersão)
0.15 1.25 0.13 0.4 1000 vezes
Poder de ampliação (magnificação): aumento da ocular X aumento objetiva 
Objetiva imersão: meio (óleo de imersão) com o mesmo índice de 
refração do vidro da lâmina, para evitar refração dos raios de luz 
seguindo diretamente para a objetiva, aumentando o poder de resolução 
Informações encontradas nas objetivas do microscópio 
1. Microscopia campo claro
 Pouco contraste 
 permite observação de células absorvem e dispersam luz grau variável
 células pigmentadas, leveduras 
 maioria das bactérias não podem ser vistas em campo claro
Para resolver este problema  coloração das células
 coloração facilita a visualização dos m.o. no microscópio ótico 
Tipos de corantes usados em microbiologia:
1) Corantes básicos (catiônicos): cromóforo carga +
2) Corantes ácidos (aniônicos) : cromóforo carga -
Corantes básicos
 azul de metileno
 cristal violeta
 safranina
 verde malaquita
 fucsina básica 
Corantes ácidos
 eosina
 vermelho congo
 sudan black
Mais usados: superfícies celulares apresentam 
em geral cargas negativas 
Coloração de fundo 
Tipos de coloração :
a) Coloração simples: 1 corante
Ex: azul de metileno, iodo (grânulos amido)
Técnica de coloração de microrganismos
b) Coloração diferencial: mais de um corante. Permite diferenciar células
Ex: coloração de Gram, coloração Ziehl - Neelsen
Técnica de coloração de Gram
 Desenvolvida por Christian Gram em 1884
 Coloração de Gram é uma das mais usadas em bacteriologia 
 Gram + ou Gram – : diferenças na composição da parede celular
 Essencial na identificação de bactérias
 variável se células estão mortas ou velhas: cultura jovem (24 h) 
Coloração de Gram
http://highered.mheducation.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::530::530::/sit
es/dl/free/0073525502/930300/Gram_Stain.swf::Gram%20Stain
2. Microscopia da contraste de fase 
 Grande contraste entre as células e o meio
 células apresentam IR diferente do meio 
 luz atravessa o m.o. IR diferente: sofre retardo  amplificação efeito
 formação imagem escura do m.o. em fundo claro
 permite visualizar células não coradas ou seja, vivas
 células coradas estão “mortas” e muitas vezes apresentam distorções
3. Microscopia de campo escuro
 Espécime é atingido lateralmente pela luz
 única luz que atinge a lente é a dispersa pelo espécime 
 m.o. aparece claro sob fundo escuro 
 permite observar m.o. vivos e não corados : espiroquetas
 possui maior resolução que campo claro ou contraste de fase
4. Microscopia de fluorescência:
 Utilizado para observação de m.o. que apresentam fluorescência
 fluorescência natural ou marcadores fluorescentes
 luz UV (λ curto) atinge m.o. e molécula fluorescente emite luz (λ longo) 
 muito útil na detecção de m.o. patogênicos: imunofluorescência 
IMPORTÂNCIA DA MICROSCOPIA:
 Morfologia e coloração : IDENTIFICAÇÃO
cocos Gram + Arranjo em 
cachos Staphylococcus
bastonetes Gram + Presença de endosporos
Bacillus
Clostridium
Outros tipos de microscopia: imagens tridimensionais
- Contraste por interferência diferencial (CID) : luz polarizada permite 
visualizar estruturas internas em células não coradas (núcleo, esporos, 
grânulos)
- Força atômica: observação superfícies e morfologia celular (varredura)
- Laser varredura confocal: laser acoplado ao sistema ótico. Permite 
visualizar diferentes camadas de m.o. em uma superfície. Útil em ecologia 
microbiana. Utiliza corantes fluorescentes. 
Microscópio ótico simples (estereoscópico ou lupa)
- Ampliação entre 10 a 125x
- não possui objetivas apenas oculares
- imagem tridimensional e direta
- campo amplo de visualização
- ampla profundidade de foco (zoom)
- observação de colônias 
- macro estruturas de fungos filamentosos
- baixa resolução
Microscopia eletrônica : feixe de elétrons
 permite estudo detalhado das estruturas celulares 
 vantagem diante do ótico: poder de resolução 100 X maior, em virtude 
do comprimento de onda muito curto dos raios eletrônicos
 Produz aumentos úteis de 200.000 a 400.000
Principais tipos de microscópio eletrônico: 
1) Transmissão (MET) : estruturas internas PR: 0.2–0.4nm
2) Varredura (MEV): estruturas externas PR : 1-3 nm
MEV
MET
Desvantagens da microscopia eletrônica: 
 alto custo aquisição, manutenção e preparo de amostras
 baixo poder de penetração
 amostra deve ser cortada em “fatias” muito finas (MET)
 recobrimento com ouro (MEV)
Imagem do mesmo m.o. visto por três tipos de microscópio
a) Campo claro
b) MET
c) MEV