RELATÓRIO: ANÁLISE E INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS DE PCR

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ – UESC
	
RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA
DAVID MINÁ HAFNER
ANÁLISE E INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS DE PCR
 
Relatório de aula prática solicitado e orientado pelo professor Priminho da disciplina de Genética Molecular do Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Santa Cruz.
Ilhéus BA, 04 de abril de 2015.
INTRODUÇÃO
 A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica da área da Biologia Molecular que permite replicação in vitro do DNA de forma extremamente rápida. A técnica PCR permite que pequenas quantidades de material genético possam ser amplificadas milhões de vezes em pouquíssimas horas, sendo que essa técnica passou a ser utilizada na década de 1980. O uso dessa técnica foi realizado em tubos de ensaio contendo o DNA e mais alguns compostos necessários, como primers (DNA iniciadores) e a enzima que faz a replicação do DNA, sendo ela a DNA polimerase. A PCR está desenhada de acordo com o princípio natural de replicação de DNA. Este é um processo que decorre em três passos, que em conjunto se designam como um ciclo e que se repete um número específico de vezes. 
Assim, um ciclo de PCR consiste nos seguintes passos: 
Desnaturação 
A temperatura elevada (geralmente >90ºC) separa a cadeia dupla de DNA em dois filamentos, sendo este processo conhecido como “desnaturação”. 
Os dois filamentos ou cadeias de DNA são mantidos juntos por ligações de hidrogénio que, por serem relativamente fracas, quebram-se a altas temperaturas, ao passo que as ligações entre as moléculas de fosfato e desoxirribose, por serem ligações covalentes mais fortes, permanecem intactas.
Hibridização ou Anelamento
Como o objetivo da PCR não é replicar a cadeia inteira de DNA, e sim somente replicar a sequência de interesse. Os iniciadores (ou primers) marcam as extremidades da sequência alvo: estes iniciadores são curtas sequências sintéticas de nucleotídeos, entre 20 e 30 bases. 
Numa reação de PCR são incluídos dois primers, um para cada cadeia simples de DNA que foi produzida durante o passo de desnaturação. O início da sequência de DNA alvo é marcada pelos primers que se ligam (hibridizam) com a sequência  complementar. Sendo assim, acontece o resfriamento para permitir que os primers formem pontes de hidrogênio com as sequências alvo do DNA.
Extensão
Após a ligação dos primers , a temperatura eleva-se a aproximadamente 72 ºC e a enzima Taq polimerase replica a cadeia de DNA. A Taq polimerase é uma polimerase de DNA termoestável recombinante do organismo Thermus aquaticus, que, ao contrário de outras polimerases, se mantém ativa a temperaturas elevadas. O processo de síntese é iniciado numa zona com cadeia dupla (onde estão ligados os primers), incorporando os nucleotídeos complementares à sequência alvo e utilizando os dNTPs em solução. A extensão inicia-se sempre no extremo 3’ do primer, criando uma cadeia dupla a partir de cada uma das cadeias simples. A Taq polimerase sintetiza exclusivamente na direção 5’ para 3’.
   
OBJETIVOS
Facilitar o aprendizado tanto na análise como na interpretação da PCR;
Estimular o aprendizado sobre a aplicabilidade da técnica da PCR;
Estimular nosso raciocínio quanto ao uso de marcadores moleculares;
MATERIAIS E EQUIPAMENTOS
• Pipetas automáticas de 2, 10, 20, 100, 200 e 1.000 uL e as ponteiras correspondentes; 
• Água ultrapura autoclavada; 
• Microtubos de 1,5 mL;
 • Microtubos de 0,2 uL; 
• Suporte para microtubos 1,5 mL;
 • Gelo picado; • MgCl2 25 mM; 
• Tampão Tris 100 mM/KCl 500 mM pH 8,0; 
• dNTPs;
 • Primers; 
• Taq Polimerase; 
• DNA molde; 
• DNA controle; 
• Termociclador;
PROCEDIMENTO
Foi utilizado 5 eppendorfs, sendo que um eppendorf de volume maior continha o mix. Os eppendorfs foram nomeados da seguinte maneira: CO (controle); C2;C3 e C4.
Eppendorf contendo o mix: Foi pipetado 72,0µL de H2O (autoclavado), em seguida foi adicionado 12,5µL de tampão, 20µLde DNTP, 5 µL de primer (R) e 5 µL de Taq;
Foi adicionado no CO e C2 1µL do primer 1, em seguida no C3 1µL do primer 2 e 1µL do primer 3 no C4.
Feito a adição dos primers nos eppendors CO,C2,C3 e C4, foi então adicionado 2µL de DNA em todos eles, exceto no CO (controle). (foi adicionado 2µL por não ter tido a pipeta de 1µL).
E por fim, foi transferido 23µL do eppendorf que contém o mix para os eppendorfs: CO,C2,C3 e C4. Em seguida foram todos levados para a geladeira. 
OBS: É importante saber que para realização desse procedimento ser mais eficiente, seria necessário realizarmos tudo em baixa temperatura (manusearmos os eppendorfs no gelo), pois, todo procedimento dito anteriormente foi realizado a temperatura ambiente. 
QUESTIONÁRIO
Compare as etapas da reação da PCR (desnaturação, hibridização e extensão) com as etapas da replicação do DNA na célula, destacando as diferenças e semelhanças.
Fase de desnaturação térmica: Separação dos dois filamentos que compõem uma molécula de DNA, sendo que essa separação também ocorre no processo de replicação. Logo, na reação da polimerase em cadeia a alta temperatura é a responsável pela separação desses filamentos.
 Processo de replicação: As helicases quebram as pontes de hidrogênio que estão entre as bases, para que ocorra a separação das duas fitas de DNA.Na fase de hibridização da PCR, o objetivo não é replicar a cadeia inteira de DNA, mas apenas uma sequencia alvo, enquanto que na replicação, toda uma cadeia é replicada, sendo que como produto final há a existência de uma nova fita, sendo que essa nova fita é idêntica a fita molde. 
Por que a PCR resulta em um fragmento de DNA de tamanho determinado? 
Por conta da presença dos primers. Os iniciadores (ou primers) marcam as extremidades da sequência alvo: estes iniciadores são curtas sequências sintéticas de nucleotídeos, entre 20 e 30 bases. 
Em uma PCR convencional, partindo de uma molécula de DNA, qual o número de moléculas após 30 ciclos? 
De acordo com a formula, 2 nº de ciclos, sendo assim são 30 ciclos. Resultando, 230, que será igual a 1073741824 moléculas de DNA. 
A Taq polimerase pode ser substituída por outra(s) enzima(s)? Discuta.
 Não. Por ela suportar altas temperaturas usadas em PCR, tendo uma semi-vida enzimática de 40 minutos (a 94°C). 
Cite algumas aplicações do produto final de PCR.
Medicina forense; genotipagem; taxonomia; identificação de patologias (infecciosas ou genéticas); sequenciamento de genes e clonagem de genes.
CONCLUSÃO
 Foi possível ao término deste relatório, aumentar o aprendizado e a percebermos a grande importância da PCR, Sendo assim, podemos utilizar esta técnica em diversas situações, como por exemplo: medicina forense; genotipagem; taxonomia; identificação de patologias (infecciosas ou genéticas); sequenciamento de genes e clonagem de genes. Foi permitido então observar o uso diversificado dessa técnica, além de ser uma técnica com uma replicação do DNA in vitro de uma maneira muito rápida e eficaz e de grande importância para a genética molecular.