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01/06/2016
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Técnicas de Biologia molecular
Natalia Bernardi Videira
nataliabvideira@gmail.com
BG515 – Prof. Gonçalo
TÉCNICAS PARA ESTUDO DO DNA E 
RNA
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Gel de Agarose
• Objetivo: visualização da presença ou ausência do DNA
• Princípio: Após aplicação de uma corrente elétrica, o DNA 
(carga negativa) migra para o polo positivo.
• Através da comparação com um marcador de peso 
molecular conhecido é possível comparar o tamanho do 
DNA da amostra
Gel de Agarose
• Material:
– Gel de agarose (0,8 a 2%)
– Tampão TAE (tris-acetato-EDTA) ou TBE (tris-borato-EDTA)
– Intercalante de DNA para visualização (brometo de etídeo, 
gel red)
– Marcador de peso molecular (DNA ladder)
– Amostra de DNA
• Aplicações:
– Visualização do tamanho do DNA
– Qualidade do DNA (x degradação)
– Permite extração do DNA após purificação do gel
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Southern Blotting
• Objetivo: detectar um 
DNA específico em uma 
mistura
• Princípio: uso de sondas 
marcadas (de DNA ou 
RNA, complementar a 
sequencia de interesse) 
que hibridizam com o 
DNA de interesse
• Técnica desenvolvida 
por Edwin Southern.
Southern Blotting
1) DNA é 
fragmentado
E aplicado em gel 
de eletroforese
2)DNA é 
desnaturado
3,4,5,6) DNA é 
transferido do 
gel para 
membrana
7)A membrana 
Northern Blotting: Localização de RNA através de sondas
Western Blotting: Localização de proteínas através de anticorpos
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Enzimas de Restrição
Histórico: 
• Werner Abner: descobriu a enzima de restrição (“tesouras 
moleculares”)
Estudo com bacteriófagos → bactérias digeriam o DNA viral
• Hamilton Smith: Descreve mecanismo de ação das enzimas de 
restrição
�O corte gera um par de extremidades coesivas idênticas e as 
enzimas clivam as mesmas sequências em qualquer DNA
• Daniel Nathans: primeiro a mostrar 
a aplicação tecnológica
Enzimas de restrição : são produzidas
naturalmente por bactérias como 
mecanismo de defesa à infecção de DNA viral
Enzimas de Restrição
• Objetivo: clivagem de uma região específica do DNA.
• Princípio: Reconhecem e fazem cortes bifilamentares na 
ligação açúcar-fosfato das moléculas de DNA em 
sequencias específicas.
• Sítio de restrição: 4 a 6pb – regiões palindrômicas
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Enzimas de Restrição
• Extremidades coesivas (Sticky-ends) ex: EcoRI, HindIII, 
BamHI
• Extremidades cegas (Blunt-ends) Ex: NsbI, HaeIII, AluI.
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1982-56762009000200006
Vetores
Vetores: molécula de DNA usada como 
veículo para transportar artificialmente 
um material genético exógeno para 
outra célula, onde ele pode ser replicado 
e/ou expresso.
Um vetor contendo o inserto de DNA 
exógeno é chamado DNA recombinante.
Um vetor contém:
- sítio múltiplo de Clonagem (com sítios
para várias enzimas de restrição), 
- marcador de seleção
- origem de replicação adequada
ao hospedeiro (célula que recebe o vetor)
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Exemplo de tipo de Vetor
Plasmídeos:
�Encontrados naturalmente em bactérias 
�Pequena molécula de DNA circular dentro
da célula
�Se replica de forma independente.
�Fisicamente separada do DNA cromossomal 
� Na natureza, os plasmídeos frequentemente carregam 
informação adicional que pode beneficiar a sobrevivência 
do organismo, por exemplo genes de resistência a 
antibióticos. 
Plasmídeos artificiais são usados na biologia molecular como vetores, 
transportando sequências de DNA recombinante em organismos hospedeiros
Clonagem de DNA
Inserção de um fragmento de DNA em um vetor.
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Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
• Objetivo: amplificação do número de cópias do DNA em 
bilhões de vezes
• Princípio: reação enzimática de polimerizaçãodo DNA in 
vitro – utiliza DNA polimerase
• Material: 
– Amostra de DNA
– DNA polymerase
– Primer Forward e Reverse
– Tampão da enzima
– MgCl2
– dNTP
Tempo
Temp (C)
Desnaturação
95°- 30s
Anelamento
55°- 1min
Extensão
72°- 1min
*Repete ciclo 
35 vezes
Ciclo PCR
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
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Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
• Aplicações: 
– Diagnóstico de patógenos e doenças hereditárias
– Identificação de anormalidades cromossomais
– Identificação de mutações
– Mutagênese
– Clonagem de genes
– Sequenciamento
– Genotipagem
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
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• Limitações: 
– Baixa sensibilidade
– Colorações não quantitativas
– Pobre discriminação entre o 
tamanho dos produtos de 
PCR
– Resultados não são expressos 
em número
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
PCR Real Time
• Objetivo: método quantificativo baseado no PCR
• Princípio: análise da fase exponencial do PCR
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PCR Real Time
• Uso de sondas fluorescentes para quantificar o número de 
cópias
PCR Real Time
• Aplicações
– Análise da expressão gênica
– Identificação de polimorfismos e mutações
– Quantificação da carga viral ou outras infecções
– Identificação de translocações genéticas (ex em leucemia 
mielóide crônica)
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Produção de cDNA
Objetivo: Como o RNA é muito instável, é 
interessante produzir cDNA (DNA complementar) a 
partir do mRNA
Princípio: Utiliza a enzima Transcriptase Reversa 
que é capaz de realizar a síntese de DNA a partir 
de um molde de RNA
Transcriptase Reversa: enzima encontrada nos vírus
de RNA (retrovírus). Quando o vírus infecta seu
hospedeiro ele utiliza a Transcriptase Reversa para
produzir cDNA a partir do seu material genético de RNA,
para depois integrar o cDNA no genoma do hospedeiro
Funciona como se fosse uma reação de PCR no 
qual ocorre o anelamento do primer oligo-dT 
(TTTTT) com o RNA e síntese do cDNA com a 
Transcriptase Reversa, e depois a síntese da 
segunda fita do DNA com a DNA polimerase
Sequenciamento de DNA
Objetivo: Obter a sequência de nucleotídeos de uma molécula de 
DNA
Princípio: Síntese de cópia do DNA de interesse utilizando-se 
nucleotídeos modificados
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Sequenciamento de Sanger
� Desenvolvido na década de 1980
� Utiliza ddNTP (trifosfato de didesoxinucleotideo)
� Nucleotídeo modificado com capacidade de bloquear a síntese 
contínua do DNA
� Não possui o grupo 3’-hidroxila, portanto a DNA polimerase não 
consegue adicionar outro nucleotídeo após o ddNTP
� A reação de síntese da fita de DNA é interrompida quando a 
polimerase adiciona o ddNTP
� São criadas fitas de DNA com diferentes tamanhos dependendo de 
quando o ddNTP foi incorporado
� Essas fitas de DNA são aplicadas num gel de acrilamida e “correm” 
de acordo com seu tamanho (da menor para a maior)
� O equipamento lê a fluorescência dos diferentes ddNTP e indica a 
ordem em que eles foram incorporados
Sequenciamento de Sanger
Método inicial era manual
A reação era realizada em quatro tubos separados,
um para cada tipo de ddNTP (ddATP, ddTTP,
ddGTP, ddCTP)
O resultado era visto numa eletroforese em gel
GATC
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Sequenciamento de Sanger automatizado
Sequenciamento de nova geração
Também conhecido como: Next-generation sequencing (NGS),
high-throughput sequencing.
Termo usado para descrever diferentes novas tecnologias de 
sequenciamento:
� Illumina (Solexa) sequencing
� Roche 454 sequencing
� Ion torrent: Proton / PGM sequencing
� SOLiD sequencing
Essas técnicas novas permitem sequenciar DNA e RNA de 
maneira muito mais rápida e barata, e revolucionaram o 
estudo de genômica e biologia molecular.
� RNA – seq : sequenciamento de todo o mRNA transcrito na 
célulanaquele momento.
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Illumina
https://youtu.be/HMyCqWhwB8E
1) o DNA é fragmentado
2) o DNA é ligado a adaptadores
3) Através do adaptador, o DNA se liga na 
placa
4) Através de um PCR de ponte, o número 
de cópias do DNA de interesse é aumentado
5) Ocorre o sequenciamento do DNA de 
interesse. A polimerização da fita é contínua 
e o equipamento consegue ler a 
fluorescência de cada base que é 
adicionada
http://www.illumina.com/content/dam/illumina-
marketing/documents/products/illumina_sequencing_introduction.pdf
Exemplo 
Produção de insulina humana em bactéria
Região Codante
Região não-codante
Extração RNA
Células beta
Do pâncreas
Síntese de 
cDNA de 
Todo mRNA
PCR do cDNA
Da insulina
Clonagem no vetor
Sequenciamento 
do vetor 
recombinante
Inserção do vetor
(transformação)
da bactéria
Expansão do 
número de 
bactérias 
Produção de 
insulina
Extração DNA
humanoX
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