Microbiologia Geral - Diagnostico Indireto

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MÓDULO VIROLOGIA - Aula 05
Métodos de diagnóstico indireto 1
Métodos Indiretos
Métodos IndiretosMétodos Indiretos
Métodos IndiretosMétodos Indiretos
Métodos IndiretosMétodos Indiretos
Métodos Indiretos
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS MÉTODOS DIAGNÓSTICOS 
PARA AS INFECÇÕES VIRAISPARA AS INFECÇÕES VIRAIS
� Métodos Indiretos
� Pesquisa de anticorpos específicos contra 
um determinado antígeno.
� Detecção da resposta do hospedeiro 
contra a infecção. 
• Princípio básico dos testes: detectar a interação do 
Anticorpo com o Antígeno específico.
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS INDIRETOSMÉTODOS DIAGNÓSTICOS INDIRETOS
� Métodos Indiretos (outras denominações)
� Sorologia
� Diagnóstico sorológico
� Exs. de técnicas diagnósticas indiretas
� ELISA indireto
�Soroneutralização
�Teste de inibição da hemaglutinação (HI)
� Imunofluorescência Indireta (IFI)
� Imunodifusão em gel de ágar (IDGA)
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS INDIRETOSMÉTODOS DIAGNÓSTICOS INDIRETOS
� RECORDANDO ....
Resposta Imune Humoral: resposta mediada 
por Anticorpos � eficiente para bloquear o 
antígeno no meio extra-celular (Ex: vírus fora 
da célula)
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS INDIRETOSMÉTODOS DIAGNÓSTICOS INDIRETOS
Amostra a ser analisada:
• Soro sanguíneo (detecção de Ac)
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS INDIRETOSMÉTODOS DIAGNÓSTICOS INDIRETOS
� 1. 
1. 1. 
1. soroneutralização
soroneutralizaçãosoroneutralização
soroneutralização
� princípio: neutralizar a infectividade do vírus em 
culturas celulares;
� Material
� placas de 96 cavidades fundo chato
� soro suspeito (amostra a ser testada)
� vírus padrão previamente conhecido 
� cultura de células específicas (cujo vírus possui 
tropismo)
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS INDIRETOSMÉTODOS DIAGNÓSTICOS INDIRETOS
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Métodos de diagnóstico indireto 2
� 1. 
1. 1. 
1. soroneutralização
soroneutralizaçãosoroneutralização
soroneutralização
Com Ac
Sem Ac
1. Adicionar o soro a ser testado
2. Adicionar o vírus padrão conhecido 
3. Incubar 1 hora estufa a 37ºC
(tempo necessário para que haja a 
interação específica do Anticorpo 
com o Antígeno viral)
Com Ac
Sem Ac
4. Adicionar o tipo celular específico 
para o vírus, ou seja, a célula 
susceptível com receptor específico 
para o vírus. 
� 1. 
1. 1. 
1. soroneutralização
soroneutralizaçãosoroneutralização
soroneutralização
Com Ac
Sem Ac
Interpretação do resultado
Presença de Ac no soro � tapete 
celular íntegro � vírus não adsorve no 
receptor celular (proteína bloqueada 
pelo anticorpo)
Ausência de Ac no soro � Efeito 
citopático no tapete celular � vírus 
infecta a célula (proteína livre para 
adsorver com o receptor celular)
� 1. 
1. 1. 
1. soroneutralização
soroneutralizaçãosoroneutralização
soroneutralização
Com Ac
Sem Ac
Visualização no 
Microscópio 
óptico 
� 1. 
1. 1. 
1. soroneutralização
soroneutralizaçãosoroneutralização
soroneutralização
� 2. Elisa indireto 
2. Elisa indireto 2. Elisa indireto 
2. Elisa indireto 
Com Ac
Sem Ac
1. Adicionar o vírus padrão conhecido
2. Incubar em geladeira por 12 hs 
aproximadamente para que ocorra 
a adsorção do vírus na placa.
3. Lavagem da placa
Com Ac
Sem Ac
4. Adicionar a amostra a ser 
testada (soro do indivíduo)
� 2. Elisa indireto 
2. Elisa indireto 2. Elisa indireto 
2. Elisa indireto 
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Métodos de diagnóstico indireto 3
Com Ac
Sem Ac
5. Lavagem da placa
6. Adicionar um anticorpo marcado 
com enzima específico para o 
ANTICORPO que se ligou ao 
antígeno viral . 
EEEE
� 2. Elisa indireto 
2. Elisa indireto 2. Elisa indireto 
2. Elisa indireto 
Com Ac
Sem Ac
7. Lavagem da placa (para 
eliminar os Anticorpos que não 
se ligaram)
EEEE
� 2. Elisa indireto 
2. Elisa indireto 2. Elisa indireto 
2. Elisa indireto 
Com Ac
Sem Ac
EEEE
s s s s
s s s s
8. Adicionar o substrato para a 
enzima.
� 2. Elisa indireto 
2. Elisa indireto 2. Elisa indireto 
2. Elisa indireto 
Com Ac
Sem Ac
EEEE
s s s s
s s s s
EEEE
s s s s
s s s s
Alteração 
da cor
SEM 
Alteração 
da cor
� 2. Elisa indireto 
2. Elisa indireto 2. Elisa indireto 
2. Elisa indireto 
� 3. Inibição da 
3. Inibição da 3. Inibição da 
3. Inibição da Hemaglutinação
HemaglutinaçãoHemaglutinação
Hemaglutinação (HI)
(HI)(HI)
(HI)
Com Ac
Sem Ac
1. Adicionar o soro a ser testado
2. Adicionar o vírus padrão conhecido 
3. Incubar 1 hora estufa a 37ºC
(tempo necessário para que haja a 
interação específica do Anticorpo 
com o Antígeno viral)
Com Ac
Sem Ac
4. Adicionar a hemácia específica para o 
vírus conhecido. 
Exemplos: 
parvovírus canino – hemácia suíno; 
influenzavírus – hemácia de galinha; 
coronavírus bovino – hemácia camundongo
� 3. Inibição da 
3. Inibição da 3. Inibição da 
3. Inibição da Hemaglutinação
HemaglutinaçãoHemaglutinação
Hemaglutinação (HI)
(HI)(HI)
(HI)
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Métodos de diagnóstico indireto 4
Com Ac
Sem Ac
Formação do botão 
de hemácias 
(Anticorpo 
presente no soro 
bloqueou a 
glicoproteína viral 
que promove a 
hemaglutinação)
Formação da malha 
de hemácias (vírus 
livre para interagir 
com as hemácias e 
promover 
hemaglutinação)
� 3. Inibição da 
3. Inibição da 3. Inibição da 
3. Inibição da Hemaglutinação
HemaglutinaçãoHemaglutinação
Hemaglutinação (HI)
(HI)(HI)
(HI) � 4. 
4. 4. 
4. Imunofluorescência
ImunofluorescênciaImunofluorescência
Imunofluorescência indireta (IFI)
indireta (IFI)indireta (IFI)
indireta (IFI)
� 1. 
1. 1. 
1. Antígeno viral ( ) é colocado sobre uma lâmina e 
adicionado um fixador químico
� 4. 
4. 4. 
4. Imunofluorescência
ImunofluorescênciaImunofluorescência
Imunofluorescência indireta (IFI)
indireta (IFI)indireta (IFI)
indireta (IFI)
� 2. 
2. 2. 
2. É adicionado os soros dos animais suspeitos
� Se houver Ac específico contra o antígeno viral (soro positivo) 
ocorrerá a interação específica Ag – Ac. 
� Se não houver (soro negativo), não ocorre interação e as moléculas 
não específicas são removidas no processo de lavagem subsequente.
Reação positiva 
(indica presença de Ac específicos 
contra o antígeno viral no soro testado)
Reação negativa
(Ausência de Ac específicos contra o 
antígeno viral no soro testado)
Soro testadoSoro testado
� 4. 
4. 4. 
4. Imunofluorescência
ImunofluorescênciaImunofluorescência
Imunofluorescência indireta (IFI)
indireta (IFI)indireta (IFI)
indireta (IFI)
� 3. 
3. 3. 
3. Adiciona-se um Anti-Anticorpo (anticorpo contra outro 
anticorpo) marcado com fluoresceína ( ) 
No soro negativo não ocorrerá interação devido a ausência do anticorpo 
específico no soro teste)
Reação positiva 
(indica presença de Ac específicos 
contra o antígeno viral no soro testado)
Reação negativa
(Ausência de Ac específicos contra o 
antígeno viral no soro testado)
F F F
F
� 4. 
4. 4. 
4. Imunofluorescência
ImunofluorescênciaImunofluorescência
Imunofluorescência indireta (IFI)
indireta (IFI)indireta (IFI)
indireta (IFI)
� 4. 
4. 4. 
4. Lavagem � Remoção dos conjugados (anti-anticorpos 
marcados com fluoresceína) que não se ligaram.
Reação positiva 
(indica presença de Ac específicos 
contra o antígeno viral no soro testado)
Reação negativa
(Ausência de Ac específicos contra o 
antígeno viral no soro testado)
F F F
� 4. 
4. 4. 
4. Imunofluorescência
ImunofluorescênciaImunofluorescência
Imunofluorescência indireta (IFI)
indireta (IFI)indireta (IFI)
indireta (IFI)
� 5. 
5. 5. 
5. Visualização em microscópio de fluorescência (emissãode 
luz ultra-violeta para emissão de fluorescência)
Reação positiva 
(indica presença de Ac específicos 
contra o antígeno viral no soro testado)
Reação negativa
(Ausência de Ac específicos contra o 
antígeno viral no soro testado)
F F F
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Métodos de diagnóstico indireto 5
� 4. 
4. 4. 
4. Imunofluorescência
ImunofluorescênciaImunofluorescência
Imunofluorescência indireta (IFI)
indireta (IFI)indireta (IFI)
indireta (IFI)
� 5. 
5. 5. 
5. Visualização em microscópio de fluorescência (emissão de 
luz ultra-violeta para emissão de fluorescência)
Reação positiva 
(indica presença de Ac específicos 
contra o antígeno viral no soro testado)
Reação negativa
(Ausência de Ac específicos contra o 
antígeno viral no soro testado)
F F F
� 5. 
5. 5. 
5. Imunodifusão
ImunodifusãoImunodifusão
Imunodifusão em gel de 
em gel de em gel de 
em gel de ágar
ágarágar
ágar (IDGA)
(IDGA)(IDGA)
(IDGA)
� princípio: formação de complexos Ag-Ac (ligação do 
antígeno com o anticorpo específico)
PRECIPITADOPRECIPITADO
(visível em gel de (visível em gel de ágarágar ��������
linha de precipitação)linha de precipitação)
� 5. 
5. 5. 
5. Imunodifusão
ImunodifusãoImunodifusão
Imunodifusão em gel de 
em gel de em gel de 
em gel de ágar
ágarágar
ágar (IDGA)
(IDGA)(IDGA)
(IDGA)
� O teste se baseia na migração dos antígenos e
anticorpos em gel de ágar em direções opostas
resultando na formação de linhas de precipitação visíveis
(complexosAg-Ac).
� Teste oficial para diagnóstico da Anemia Infecciosa
Equina (somente em laboratórios credenciados pelo
Ministério da Agricultura)
� 5. 
5. 5. 
5. Imunodifusão
ImunodifusãoImunodifusão
Imunodifusão em gel de 
em gel de em gel de 
em gel de ágar
ágarágar
ágar (IDGA)
(IDGA)(IDGA)
(IDGA)
Material: Placa de Petri
Ágar Gel
Ag = Antígeno específico 
SP = Soro positivo (controle positivo)
S1, S2 e S3 = soros testes
Ag
SP
SP
SP
S1
S2
S3
Amostra 
positiva
� 5. 
5. 5. 
5. Imunodifusão
ImunodifusãoImunodifusão
Imunodifusão em gel de 
em gel de em gel de 
em gel de ágar
ágarágar
ágar (IDGA)
(IDGA)(IDGA)
(IDGA)
Legenda:
PS = SORO POSITIVO (controle)
AG = Antígeno (Ex: proteína viral)
1, 2 e 3 = amostras de soro testadas
Interpretação:
PS ���� controles ok (precipitação)
Soro 1 ���� positivo (precipitação)
Soro 2 ���� positivo fraco (precipitação)
Soro 3 ���� negativo (sem precipitação)