Efeito do pH na atividade Catálitica enzimática (pH ótimo e pH estabilidade)

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Introdução
As enzimas são proteínas que catalisam a reação convertendo um ou mais substratos em produto, esse processo diminui a energia de ativação e ocorre um aumento na velocidade da reação. Esse processo de conversão de substratos pode ser entendido como atividade enzimática. Dentre os fatores que influenciam a atividade enzimática, podemos citar a temperatura e o pH do meio. Toda enzima possui uma temperatura ótima e um pH ótimo, nos qual a sua atividade catalítica é máxima.
Como as enzimas possuem grupos ionizáveis nas cadeias laterais de seus resíduos de aminoácidos, a remoção de um próton desse resíduo pode reduzir a atividade de uma enzima. O pH ótimo é aquele em que a distribuição de cargas elétricas da molécula da enzima é ideal para a catálise, sendo sua atividade máxima. Outras alterações nos grupos ionizáveis podem também modificar a estrutura terciária das enzimas, chegando a desnatura-la. 
Por isso é essencial para manutenção da enzima na forma ativa, a determinação da faixa de um pH de estabilidade, ou seja, uma faixa de pH na qual a atividade da enzima se manterá constantemente ativa sem que ela se desnature. [3]. Porém, cada enzima possui uma faixa de pH de estabilidade e um pH ótimo diferentes. A invertase é uma enzima que catalisa a hidrólise da sacarose segundo a reação: sacarose + H2O D-glucose + D-frutose. A enzima invertase é obtida com eficácia da levedura Saccharomyces cerevisiae que produz uma forma intracelular mais leve (~135 kDa) e outra extracelular mais pesada contendo uma porção importante de carboidratos (glicoproteína, 270 kDa). A invertase possui um pH isoelétrico de cerca de 4 e exibe um máximo de actividade catalítica a pH próximo de 4,5. Por esta razão as soluções de enzima e de sacarose contêm NaH2PO4 0,1 M. 
Invertase é um biocatalisador potencialmente útil na produção de xaropes com alto teor de frutose e glicose a partir da sacarose como matéria-prima Tomatoni e Vitolo (2007) destacaram o uso da invertase na produção de xarope de frutose usando invertase imobilizada em um biorreator de membrana. O xarope de frutose é empregado como adoçante em indústrias alimentícias e farmacêuticas e também é usado para obter frutose. Merecem ser lembrados, também, outros usos da invertase, como, em produtos para higiene bucal com o objetivo de evitar a formação das placas dentários, na hidrólise da rafinose, no preparo de meios de cultivo para a propagação de micro-organismos não produtores de invertase e em biosensores. (CABRAL, Bruna, 2012) A prática tem objetivo de determinar a faixa de pH ótimo de atividade e o pH de estabilidade da invertase. 
Materiais e Métodos
Para análise do pH ótimo realizou-se apenas uma série denominadas A, nesta inseriu-se em 7 tubos de ensaio 2,5 ml de solução de sacarose em diferentes tampões apresentando diferentes valores de pH e no 8 pipetar 2,5 ml de água e agitar os tubos. Logo após adicionou-se 100 microlitros de solução de enzima invertase cada tubo e aguardaram-se 10 minutos a temperatura ambiente. Então após exatamente 10 minutos levar o tubo para o banho em ebulição onde ocorrerá a inibição da atividade enzimática e se dará o início a determinação de açúcares redutores pelo método de Somogyi-Nelson em cada frasco. Após isso, inicia-se determinação de açucares redutores pipetando 0,5 ml de amostra com 1 ml de SNI em tubos de ensaio numerados, então agitar e colocar em banho em ebulição por 6 minutos. Retirar os tubos e resfria-los até temperatura ambiente em banho de gelo, então retira-los do gelo e adicionar 1 ml do reagente SNII, agitar os tubos e deixar em repouso por 5 minutos, adicionar 7,5 Ml de água destilado e misturar por inversão. Após isso calibrar o espectrofotômetro com a solução branca e medir absorbância a 540 nm. Repetir o procedimento para determinar o ph ótimo e ph estabilidade. 
Tabela 1 – Algumas propriedades da invertase.
	Propriedades
	Invertase extracelular
	Invertase intracelular
	Massa molecular (kDa)
	270
	135
	Carboidrato (%)
	50
	3
	Atividade específica (U/mg de proteína)
	2700
	2900
	Km [mM] (sacarose)
	26
	25
	pH - estabilidade
	3,0 – 7,5
	6,0 – 9,0
	pH ótimo - atividade
	3,5 – 5,5
	3,5 – 5,5
U = micromol sacarose hidrolisado por minuto. Fonte: GÁSCON, NEUMANN e LAMPEN 1981.
Resultados e Discussões 
pH ótimo 
Nesta prática tem-se a utilização da técnica de espectrofotometria, no entanto, obtiveram-se os seguintes valores de absorbância a 540 nm neste processo: 0,336 Å para a amostra de pH 2,8; 0,679 Å para a amostra de pH 4,2; 1,031 Å para a amostra de pH 5,2; 0,029 Å para a amostra de pH 6,8; 0,501Å para a amostra de pH 7,8; 0,006 Å para a amostra de pH 8,6; 0,0034 Å para a amostra de pH 10,0. Calculou-se a atividade enzimática absoluta para cada um dos tubos através da seguinte fórmula:
Atividade enzimática = 1000 (Absorbância )
 Volume enzima (mL)
Para pH 2,8:
Atividade enzimática = 1000 (0,336)/0,1
	Atividade enzimática = 3360U/mL
Para pH 4,2:
	Atividade enzimática = 1000 (0,679)/0,1
	Atividade enzimática = 6790 U/mL
Para pH 5,2:
	Atividade enzimática absoluta = 1000 (1,031)/0,1
	Atividade enzimática absoluta = 10300 U/mL
Para pH 6,8:
	Atividade enzimática absoluta = 1000 ( 0,029)/0,1
Atividade enzimática absoluta = 290 U/mL
Para pH 7,8:
	Atividade enzimática absoluta = 1000 (0,501Å)/0,1
	Atividade enzimática absoluta = 5010 U/mL
Para pH 8,6:
Atividade enzimática absoluta = 1000 (0,006)/0,1
	Atividade enzimática absoluta = 60 U/mL
Para pH 10,0:
Atividade enzimática absoluta = 1000 (0,034)/0,1
Atividade enzimática absoluta = 340U/mL
Calculou-se a atividade enzimática relativa em porcentagem para cada um dos tubos através da seguinte fórmula:
% Atividade relativa = Atividade enzimática do tubo X 100
 Maior atividade enzimática
Para pH 2,8:
% Atividade relativa = 3360/10300 X 100
% Atividade relativa = 32,62%
Para pH 4,2:
% Atividade relativa = 6790/10300 X 100
% Atividade relativa = 65,92%
Para pH 5,2:
% Atividade relativa = 10300/10300X 100
% Atividade relativa = 100 %
Para pH 6,8:
% Atividade relativa = 290/10300 X 100
% Atividade relativa = 2,81 %
Para pH 7,8:
% Atividade relativa = 5010/10300 X 100
% Atividade relativa = 48,64 %
Para pH 8,6:
% Atividade relativa = 60/10300 X 100
% Atividade relativa = 0,58 %
Para pH 10,0:
% Atividade relativa = 340/10300 X 100
% Atividade relativa = 3,30%
Através dos dados obtidos construiu-se a tabela abaixo
Tabela 2 - Efeito do pH na atividade da invertase
	pH
	Absorbância a 500 nm 
	Unidade de atividade de α-amilase U/mL
	% Atividade relativa
	2,8
	0,336Å
	3360
	32,62%
	4,2
	0,679Å
	6790
	65,92%
	5,2
	1,031 Å
	10300
	100%
	6,8
	0,029 Å
	290
	2,81%
	7,8
	0,501 Å
	5010
	48,64%
	8,6
	0,006Å
	60
	0,58%
	10,0
	0,034 Å
	340
	3,30%
 
A partir dos dados obtidos traçou-se o gráfico % Atividade Relativa X pH:
Gráfico 1: Efeito do pH na atividade da invertase. 
A invertase tem pH ótimo, segundo a literatura, em torno de 3,5 -5,5 . Segundo o Gráfico 1, a atividade da enzima é máxima em pH próximo a 5, 2, e praticamente inativa em pH maior que 6,8. Após esse valor, ocorre um relativo decréscimo na atividade enzimática. Porém entre os valores de pH 2,8 – 4,2, sua atividade acrescida. 
pH estabilidade:
No procedimento de pH de estabilidade, contudo não foi possível obter dados para análise devido a erros de pipetagem entre outros. 
4.0 Conclusão 
Através deste experimento, pôde-se concluir que é possível determinar o pH ótimo e a faixa de pH de estabilidade da invertase através do cálculo da atividade relativa e das leituras de absorbâncias na presença enzima. Dentre os valores obtidos pode-se também observar que a invertase quando em meio mais ácido seu pH ótimo, tende a aumentar sua atividade gradativamente até que em meio alcalino seja inativada por desnaturação. Além disso, pode-seobservar um erro não identificado na leitura de absorbância em pH 6,8, onde se esperaria um valor maior. 
5.0 Referências
CABRAL, Bruna Vieira. Hidrólise de Sacarose por Invertase Imobilizada em Duolite A-568 por Adsorção e Ligação Cruzada. 2012. 143 p. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química)- Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2012. 1. Disponível em: <https://repositorio.ufu.br/bitstream/123456789/15184/1/d.pdf>. Acesso em: 02 jul. 2018.
[1] MACEDO, A.G.; PASTORE, G.M.; SATO, H.H.; PARK, Y.G.K. Bioquímica Experimental de Alimentos. São Paulo: Varella, 2005.
[2] LEHNINGER, A.L.; NELSON, D.L.; COX, M.M. Princípios de Bioquímica. 4a edição, São Paulo: Sarvier, 2006.