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Purificação de Proteínas 
Propriedades usadas na purificação de proteínas 
através de cromatografia líquida 
Na separação a amostra contendo a mistura de proteínas é 
preparada em solução aquosa, a solução é colocada em contato 
com um suporte sólido poroso (fase estacionária) e eluída através 
deste suporte com uma solução aquosa (fase móvel). 
A separação ocorre devido a diferenças entre as propriedades das 
diferentes proteínas. 
 
 
Propriedades exploradas: Tamanho (massa molecular) 
 Carga líquida 
 Polaridade (hidrofobicidade) 
 Afinidade química (especificidade) 
 
Coluna cromatográfica 
amostra 
Detector UV 280nm Coletor de frações 
Sistema para FPLC 
Recuperação da atividade enzimática 
Recuperação = 80% = 80 U/100 U 
100 U 80 U 
 
2ml de lisado 
contendo 
50 U/mL 
Etapa de purificação 
Recuperação: indica qual a porcentagem de 
atividade enzimática recuperada após o 
procedimento de purificação 
10ml de material 
contendo 
8 U/mL 
 
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
etapas
Re
cu
pe
ra
çã
o 
em
 re
la
çã
o 
ao
 in
íc
io
Recuperação de 90% em cada etapa 
100 U de alfa-glicosidase 
10 mg de proteína 
100 U de alfa-glicosidase 
1 mg de proteína 
100 U de alfa-glicosidase 
2 mg de proteína 
100U/mg 
50U/mg 
10U/mg 
Enriquecimento 
100 U/mg 200 U/mg Etapa de purificação 
Enriquecimento = 2 = 200/100 
Enriquecimento: indica o aumento da 
atividade específica após o procedimento de 
purificação. 
Filtração em Gel ou Cromatografia de Exclusão Molecular 
Tamanho: 
100 kD 
20 kD 
Fluxo de solução 
tamponante 
através da coluna 
volume 
abs280 
5 µm 
fluxo 
fluxo 
volume 
Seletividade 
As dimensões dos poros da matriz determinam a faixa de peso 
molecular das proteínas que podem ser separadas na cromatografia. 
 
 
Tipos de resina 
Sephacryl (dextrana + bis-acrilamida) 
50 µm 
Sepharose (dextrana + epiclorohidrina) 
10 – 120 µm 
Cálculo de peso molecular relativo 
utilizando cromatografia de filtração em gel 
Definições 
 
ve = volume de eluição da amostra (proteína de interesse) 
 
vo = volume morto ou “void”. Volume no qual são eluídas proteínas 
totalmente excluídas dos poros das resinas. Corresponde ao volume 
externo aos grãos da resina 
 
vt = volume total da coluna. Pode ser calculado geometricamente a 
partir das dimensões da coluna. 
 
ve = volume de eluição da 
amostra 
(proteína de interesse) 
vo = volume morto ou “void”. 
 
Volume no qual são eluídas 
proteínas totalmente excluídas dos 
poros das resinas. Corresponde ao 
volume externo aos grãos da resina 
 
Pode ser medido usando 
macromoléculas muito grandes, em 
geral “blue dextrana” (milhões de 
Daltons) 
vt = volume total da coluna. 
Pode ser calculado a partir das 
dimensões da coluna. 
 
Definições 
 
“razão de eluição” 
Kav = (ve – vo)/(vt-vo) 
 
Kav 
Log PM 
Cromatografia de Troca Iônica 
Carga líquida: 
Aminoácidos possuem cadeias laterais ionizáveis; 
Proteínas possuem terminais C e N ionizáveis. 
 
 
 
pI (ponto isoelétrico) = pH no qual o número total de cargas 
positivas é igual ao número total de cargas negativas. Logo, a 
proteína não tem carga líquida. 
 
Se o pH > pI, a carga líquida da proteína é negativa 
 
Se o pH < pI, a carga líquida da proteína é positiva 
+ 
Fluxo de solução 
tamponante com pH 
definido 
+ 
Fluxo de solução 
tamponante com pH 
definido 
volume 
+ 
Fluxo com solução 
tamponante contendo NaCl 
Na+ 
Na+ 
Na+ 
Na+ 
Na+ 
Na+ 
Na+ 
Cl- 
Cl- 
Cl- 
Cl- 
Cl- 
Cl- 
Cl- 
Cl- 
Cl- 
volume 
NaCl 
+ 
+++ 
pI = 7 
 
 
 
pI = 9 
pH = 6 
F α q1.q2 
+ 
+++ 
+++ 
volume 
NaCl 
Tipos de resina 
Cromatografia de Hidrofobicidade 
 
Adição de sal 
Polaridade: 
Série de Hofmeister 
 
Cátions: 
NH4+ > K+ > Na+ > Li+ > Mg+2 > Ca+2 > guanidina 
 
 
 
 
Ânions: 
SO4-2> HPO4-2>acetato>citrato>tartarato> Cl-> NO3-> SCN- 
Efeito precipitante 
 
Adição de sal 
Precipitação por sulfato de amônio é usada para concentrar e/ou purificar 
parcialmente amostras contendo proteínas 
Cromatografia de Hidrofobicidade 
Polaridade: 
 
(NH4)2SO4 
 
(NH4)2SO4 
volume 
Abs 
280 
Fase estacionária 
apolar 
 
(NH4)2SO4 
volume 
Abs 
280 
 
volume 
Abs 
280 
Tipos de resina 
Cromatografia líquida de fase reversa 
Polaridade: 
(Material poroso apolar é a fase estacionária) 
Proteína ricas 
em aminoácidos 
mais apolares: 
mais retidas 
Proteínas ricas em 
aminoácidos mais 
polares: menos 
retidas 
 Eluição: 
 aumento da % de 
 solvente orgânico 
 na solução eluente 
1o. 2o. 
	Número do slide 1
	Número do slide 2
	Número do slide 3
	Número do slide 4
	Número do slide 5
	Número do slide 6
	Enriquecimento: indica o aumento da atividade específica após o procedimento de purificação.
	Número do slide 8
	Número do slide 9
	Número do slide 10
	Número do slide 11
	Número do slide 12
	Número do slide 13
	Número do slide 14
	Número do slide 15
	Número do slide 16
	Número do slide 17
	Número do slide 18
	Número do slide 19
	Número do slide 20
	Número do slide 21
	Número do slide 22
	Número do slide 23
	Número do slide 24
	Número do slide 25
	Número do slide 26
	Número do slide 27
	Número do slide 28
	Número do slide 29
	Número do slide 30
	Número do slide 31
	Número do slide 32
	Número do slide 33
	Número do slide 34