PCR 2 Oct2012

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“Primers” para PCR: 
• “Primers”: oligonucleotídeos com 18 a 28 bases (fita 
única) escritos sempre na direção 5´  3´ 
 
• São necessários dois “primers”: 
• Um complementar a um trecho da fita anti-sense 
» Primer sense (forward) 
• Um complementar a um trecho da fita sense 
» Primer anti-sense (reverse) 
 
 
Desenho de “primers” 
Escolha dos primers para PCR: 
 1 Asp Pro Val Ala Val Leu Ala Val Phe Glu Glu Ile 12 
 1 G GAT CCA GTG GCG GTG TTG GCC GTG TTC GAG GAG ATA 37 
 
 13 Gln Val Glu Glu Val Leu Tyr Ile Leu Val Phe Gly Glu 25 
 38 CAG GTG GAG GAG GTG CTG TAT ATC CTG GTC TTC GGC GAG 76 
 
 26 Ser Leu Leu Asn Asp Gly Val Thr Val Val Arg Tyr His 38 
 77 TCC CTC CTC AAC GAT GGT GTG ACG GTG GTC CGT TAC CAT 115 
 
 39 Leu Phe Glu Gly Phe Ser Glu Leu Gly Glu Asp Asn Ile 51 
 116 CTG TTC GAG GGC TTC AGC GAG CTC GGT GAG GAC AAC ATC 154 
 
 52 Lys Ala Val Asp Ile Ala Ser Xxx Val Ala Ser Phe Leu 64 
 155 AAG GCC GTT GAC ATC GCC AGC NGG GTC GCC TCC TTC CTT 193 
 
 65 Leu Val Ala Leu Gly Gly Thr Ala Ile Gly Ile Ile Trp 77 
 194 CTC GTG GCC CTC GGC GGC ACG GCC ATC GGC ATC ATC TGG 232 
 
 78 Gly Phe Leu Thr Ala Phe Ile Thr Arg Leu Thr Ser Gln 90 
 233 GGC TTC CTC ACC GCC TTC ATC ACC AGG TTA ACG AGT CAG 271 
 
 91 Val Pro Arg Asp Arg Ala Ile Phe Val Phe Val Met Ala 103 
 272 GTN CCG CGT GAT CGA GCC ATC TTC GTG TTC GTG ATG GCC 310 
 
 104 Tyr Leu Asn Ala Glu Met Leu Ala Ser Ser Ser Glu Thr 116 
 311 TAC CTC AAT GCG GAG ATG CTG GCC TCG TCC TCG GAG ACC 349 
 
 117 Ile Ile 118 
 350 ATC ATC T 356 
 
oligonucleotídeo 1 para PCR (sense): 
5' GTG GAG GAG GTG CTG TAT ATC 3' 
 
- oligonucleotídeo 2 para PCR (anti-sense): 
5' GTA GGC CAT CAC GAA CAC GAA 3' 
 
- oligonucleotídeo para hibridização 
(anti-sense): 
5' CTG ACT CGT TAA CCT GGT GAT G 3' 
 
Critérios para desenho de “primers”: 
 
- Composição de bases: 
O conteúdo de G+C deve estar entre 40% e 60%, com distribuição mais ou menos 
homogênea de todas as bases ao longo do comprimento do “primer”. 
 
- Comprimento: 
A região do “primer” complementar à “template” deve ser de 18 a 28 nts. Os dois 
“primers” a serem utilizados numa reação não devem ter diferença de comprimento 
que exceda 3 nts. 
 
- Seqüências repetidas ou auto-complementares: 
Não deve haver repetições invertidas no “primer” ou seqüências auto-complementares 
com mais de 3 nts seguidos. 
 
• Complementaridade entre membros de um par de “primers”: 
 
A extremidade 3’ de um “primer” não pode ser capaz de se ligar a qualquer 
ponto do outro primer. Como os “primers” estão presentes em alta concentração, 
mesmo baixa complementaridade entre eles pode levar à formação de híbridos 
e a conseqüente síntese e amplificação de dímeros de “primers”. 
Dímeros dos “primers” é o produto da 
extensão do primer por pareamento consigo 
mesmo ou com o outro “primer” do par. 
Como são produtos mais curtos, são copiados 
mais eficientemente, podendo dominar a 
reação e sequestrar “primers” que iriam se 
parear com a “template” real. 
 
Outro fato que pode ocorrer, quando começa 
a se acumular produto de PCR, é o 
pareamento das extremidades dos produtos 
amplificados, formando concatâmeros. Isso 
aparecerá na eletroforese como “smears” de 
elevado peso molecular. 
- Temperatura de fusão: temperatura na qual 50% das moléculas alvo já estão pareadas 
com os “primers” 
O Tm calculado dos dois membros do par de “primers” não deve diferir em mais que 5oC 
(Tm depende da concentração de “primers” e de sais) 
 
Extremidade 3’: 
A natureza da extremidade 3’ dos “primers” é crucial. Se possível, a base da extremidade 
3’ de cada “primer” deve G ou C. Mas não é recomendável que seja ...NGGG ou ...NCCC, 
pois pode gerar dímeros de primers. 
 
-Localização do sítio de pareamento dos “primers” na seqüência alvo: 
Algumas vezes há restrições impostas pelo tipo de informação que se quer obter ao fazer a 
PCR. Ao desenhar “primers” para cDNA, o ideal é que estejam em exons diferentes. 
 
-Adição de sítios de restrição, promotores de bacteriogafos, clamp GC, e outras seqüências 
na extremidade 5’: Usualmente estas seqüências não alteram o pareamento do “primers” 
nas seqüências alvo. 
A extremidade 5’ não precisa ser complementar à seqüência alvo. Isso nos 
permite adicionar seqüências com propósitos específicos na extremidade 5’ 
• sítio para enzima de restrição, mais 3 a 4 bases adicionais 
• promotores para transcrição in vitro 
• promotores de seqüências consenso para inicío de tradução 
• para transcrição e tradução in vitro 
 etc 
 
Para o cálculo do Tm considera-se apenas a região complementar à seqüência alvo. 
“primers” com sítios para enzimas de restrição: 
Cáculo do Tm dos inciadores 
Tm é a temperatura na qual metade das fitas moldes presentes na reação estão hibridizadas 
com os primers, que usualmente estão presentes em considerável excesso em relação às 
templates. 
Tm depende da concentração de primers (e templates) e da concentração de sal. 
 
Métodos para cálculo do Tm: 
 
Para “primers” com cerca de 20 nucleotídeos (regra de Wallace): 
 
 Tm = (número de G + C) x 4 + (número de A+T) x 2 
 
Uma fórmula mais acurada que pode ser usada para oligonucleotídeos entre 15 e 70 
nucleotídeos (Bolton e McCarthy): 
 
 Tm = 81,5 + 16,6[log10(I) + 0,41 (%G+C)-(675/N) 
 
onde I: concentração de cátions monovalentes 
 N: comprimento em no. de nucleotídeos 
 
Pode ser ainda usado cálculo da temperatura de annealing otimizada (Wu et al., 1991) para 
oligonucloetídeos com 20-35 nts. 
 
 Tp = 22 + 1,46 [(2 x número de G+C) + (número de A+T) 
 Nearest neighbor method: 
Proc Natl Acad Sci U S A 1986 Jun;83(11):3746-50 
Breslauer KJ, Frank R, Blocker H, Marky LA 
Nucleic Acids Research Rychlik, Spencer and Rhoads, vol 18, num 12, pp 6409-6412 
 
 H 
Tm = - 273,15 + 16,6 log [Na+] 
 S + R ln[primers] 
 
 
5’ 3’ 
G ~ 10K cal/mol G ~ 0,6K cal/mol 
G não depende da concentração de sal. 
5’ 3’ 
5’ 
 
3’ 
Favorece produtos inespecíficos 
5’ 3’ 
5’ 
 
3’ 
3’ irá parear por último. 
Aumento da especificidade 
G global do primer < 10 Kcal/mol 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 
Primer3 – Free Online Primer Design Tool | PCR Primer Analysis ... 
Existe uma grande variedade entre os valores calculados usando as 
diferentes fórmulas. 
 
Estas fórmulas constituem apenas um guia para a temperatura de 
annealing a ser usada na PCR. Na prática, é necessário determinar a 
temperatura ótima empiricamente. 
Pode usar: - Touch down 
 - PCR em termociclador com gradiente 
 
• A distância entre os “primers” : 
 Fragmentos longos são mais difíceis de ser amplificados 
 
• Fragmentos de 120-300 nt são adequados quando o objetivo é apenasdetectar a presença do gene 
 
• Quando o propósito é clonar uma região específica de um gene ou um 
cDNA inteiro, o fragmento poderá ser maior, mas devemos usar 
enzimas com antividade corretiva ou mix de enzimas. 
 
Primers degenerados: 
verificar as tabelas 
de uso do código 
pela espécie 
(codon usage) 
Desenho de iniciadores degenerados: uma mistura de primers 
- Met Ile His Trp Cys Pro Leu 
 ATG ATT CAT TGG TGT CCT TTT 
 ATC CAC TGC CCC TTG 
 ATA CCA CTT 
 CCG CTC 
 CTA 
 CTG 
 1 . 3 . 2 . 1 . 2 . 4 . 6 = 288 
- mas não é possível usar as 6 degenerações acima 
- uso de inosina (por A/T/G) reduz diluição 
- quantidade de primer deve ser aumentada 
- alinhamento prévio usando Clustal ou Clustalw 
Codon usage: 
disponível para grande número de espécies em 
http://www.kazusa.or.jp/codon 
http://blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.html 
Para preparar o estoque de primer é necessário que o fabricante forneça a 
quantidade sintetizada. Dilua o primer liofilizado de modo que a solução estoque 
fique na concentração de 1 mM, por exemplo. 
 
Se não sabe a quantidade, meça a concentração por espectrofotometria (A260 nm) 
 
c = A260/el 
e: coeficiente de extinsão (M-1 cm-1) 
l: banda de passagem do espectrofotômetro 
Cálculo de e: 
A - 15.200 
C - 7.050 
G - 12.010 
T - 15.200 
Exemplo: 5’GTGAGTCCCTGAATGTAGTG 3’ 
e = (15.200 x 4) + (7.050 x 3) + (12.010 x 7) + (8.400 x 6) = 216.420 
 
Dilua o estoque de modo que a leitura de A260 esteja entre 0.1-0.8 
 
Suponhamos que a diluição tenha sido de 100, a A260 = 0.15 
 
C = [0.15 X 100]/ 216.420 X 1 = 0,000069 M = 69 mM = 69 pmol/mL 
 
Fatores de conversão úteis: 
pmol para ng = (no. de pmol x N x 325)/1000 - N é o número de nucleotídeos 
ng para pmol = (ng x 1000)/ (N x 325) 
325 é a massa molecular média dos nucleotídeo. 
PCR quantitativo em tempo real 
Sistema para quantificação do produto amplificado por PCR em tempo real 
ou sistema de detecção de seqüência (SDS): 
 
Isso consiste em utilizar um sistema que detecta o aumento da quantidade 
de fitas de DNA no tubo de reação, através da medida do aumento da 
emissão fluorescente, à medida que a reação está ocorrendo. 
 
Os níveis de fluorescência emitida pela amostra excitada por um laser ou 
por uma lâmpada de halogênio associada a um filtro específico, é detectada 
a cada ciclo e enviada para uma unidade processadora. 
O ciclador térmico utilizado para 
quantificação em tempo real está equipado 
com cabos de fibra óptica que direciona a 
luz do laser para cada uma das poças do 
bloco onde são colocadas as amostras 
O sistema coleta a emissão fluorescente entre 500 e 600 nm em cada uma 
das 96 poças com amostras, a cada 3 a 10 s. Os cabos levam a emissão 
fluorescente de volta à câmara CCD 
Para detecção do produto de PCR em cada ciclo é preciso marcar o DNA 
amplificado com algum tipo de molécula fluorescente. 
 
Existem vários tipos de moléculas fluorescentes utilizadas para esse fim. 
 
Dois sistemas têm sido mais comumente utilizados: 
 - SYBR Green 
 - TaqMan 
Sistema SYBR Green: 
O corante se liga a duplas fitas de DNA. 
Se há aumento do número de fitas duplas, 
há aumento proporcional da intensidade de 
fluorescência. 
 Sistema TaqMan 
 
• Sistema TaqMan emprega uma sonda, que é um oligonucleotídeo específico 
 que é complementar a uma parte interna do segmento a ser amplificado. 
 
• Este oligonucleotídeo é marcado com uma molécula fluorescente em sua 
 extremidade 5’, esta molécula é denominada “reporter”; 
 na extremidade 3’, é adicionada outra molécula que pode ou não ser fluorescente 
 (de comprimento de onda diferente), cuja função é denominada “quencher”. 
 
• Enquanto a sonda está livre em solução o “quencher” absorve a fluorescência do 
 “reporter”, não sendo detectada fluorescência. 
Fluorescence Ressonance Energy Transfer - FRET 
ATCACC..............CATCG 5’ 3’ 
Reporter Quencher 
Substâncias fluorescentes usadas: 
A atividade de exonuclease 5’  3’ da Taq DNA polimerase é utilizada para separar 
“reporter” e “quencher” durante a síntese de cada nova molécula de DNA. 
reporter quencher 
Holland et al. 1991: descreveu pela primeira vez a atividade síntese de DNA associada 
a atividade exonucleásica 5’-> 3’da Taq DNA pol.; atividade essa que se seguia ao 
aparecimento de uma estrutura em forquilha, criada pela fita template e pela fita a ser 
removida pela atividade exonucleolítica da enzima. 
 
Lee - 1993: explorou a essa característica da enzima para criar 
sistema TaqMan 
 
FAM TET 
reporter quencher reporter quando liberado pela 
enzima, fluoresce livremente 
Cada vez que é sintetisada uma nova fita há aumento 
da intensidade da emissão fluorescente 
Taq DNA Pol 
Representação de um plot da amplificação em tempo real 
O plot da amplificação mostra 4 fases distintas: 
 linha basal: não houve acúmulo de fitas duplas o suficiente para que a fluorescência 
 emitida possa ser detectada. 
 fase log: a quantidade de amplicon dobra a cada ciclo 
 fase linear: há pequeno aumento, amplificação linear, da quantidade de amplicon 
 fase platô: não há mais aumento no número de amplicons 
1 
2 
3 
4 
Esta maneira de quantificar o produto 
de PCR criou um novo paradigma para 
quantificação por PCR: 
 
É avaliado o momento de aparecimento 
do sinal e não quanto sinal é gerado 
após um dado número de ciclos 
 
Ciclo threshold – Ct: 
A fluorescência ultrapassa um nível avaliado como “background” – valor correspondente a 
cerca de 10 vezes o desvio padrão do “background”. 
Pode-se estabelecer um nível (Crossing Point – CP) em qualquer ponto da fase 2. 
sensibilidade (dynamic range): < 101 a > 1010 
 
A diluição serial (diluição em série de 10 x) de uma amostra seguida de 
amplificação das moléculas originais por PCR deve resultar numa curva com 
gradiente próximo de –3,3, isso indica que a amplificação é de duas vezes a 
cada ciclo (Y = 1). 
Caso o slope seja maior em módulo que 3,3 significa que a eficiência de 
amplificação é menor que 1. 
Nesta curva padrão (diluições 
seriadas), as 3 últimas diluições 
parecem ter a mesma quantidade. 
 
Exemplo típico de contaminação 
com DNA genômico. 
Sistema SYBR Green: 
 
O corante detecta todo tipo de dupla fita presente na amostra. 
 
Caso haja amplificação de produtos inespecíficos ou amplificação de dímeros de 
primers, a fluorescência emitida por estas moléculas será indistinguível da 
fluorescência emitida pelo produto amplificado específico que se desejava amplificar. 
Cada curva é o 
registro do que 
ocorreu em um tubo 
ao longo dos diversos 
ciclos de PCR 
Após o término dos ciclos de amplificação, se utilizamos SYBR Green, podemos 
avaliar quantos tipos de diferentes fragmentos foram amplificados, porque 
diferentes fragmentos têm “melting points” diferentes: 
Quando as fitas se separam, o SYBR 
Green não mais se liga àquelas 
moléculas, e deixa de emitir 
fluorescência. 
A fluorecência cai abruptamente. 
É possível derivar a quantidade de fluorescência em função da 
temperatura e expressar o resultado como na curva abaixo. 
Neste caso, um único produto amplificado. 
SYBR Green 
Exemplo de dois diferentes produtos amplificados em tubos distintos. 
SYBRGreen 
 
Identificação de tipos de HPV por avaliação do Tm dos produtos 
amplificados com o mesmo par de primers. 
SYBR Green 
Para otimização, procure obter a condição com: 
 
. maior variação de fluorescência por ciclo (R ou Rn) 
 
. menor Ct 
Sintetize vários pares de primers e teste-os com SYBR Green. 
Analise R, Ct e curvas “melting”. 
 
Primers: 
Tm 10oC abaixo do Tm da sonda (60 a 65 oC) 
 
Sonda: 
Não pode ter G na extremidade 5’ junto ao fluoróforo repórter 
Tm 70oC a 75oC 
Localize a sonda a 2 ou 3 bases de um dos primers 
 
Como calcular o número de moléculas-template presentes no início da 
reação (No) a partir do Ct? 
Nf = No (1+Y)
n 
Ct = n = número de ciclos 
 
 Ct é um termo exponencial! Não é linear. 
A conversão para uma forma linear é através do termo: 
 
2-Ct 
 
Nf = No (1+Y)
Ct 
 
Nf = número de moléculas quando a fluorescência atinge o nível limiar definido 
pelo pesquisador. 
Tem que ser um ponto escolhido dentro da fase de amplificação exponencial e é o 
mesmo para todas as amostras analisadas num mesmo experimento. 
 
Y = 1 (se a eficiência de amplificação for 100%) 
 
Nf/No = 2
Ct  No/Nf = 2
-Ct  No  2
-Ct 
 
PCR em tempo real será quase sempre comparativo. 
Duas moléculas alvo são amplificadas, simultaneamente em um mesmo tubo, ou 
em duas reações distintas: 
 Gene de interesse (x) 
 Controle interno – Referência (r) 
 (outro gene, ou o mesmo gene clonado e mutado para servir de controle) 
Analisemos esta questão formalmente: 
 
Para o Gene de interesse - x Para o controle interno - r 
 
Nf,x = No,x (1 + Yx)
Ct,x Nf,r = No,r (1 + Yr)
Ct,r 
 
 Se Yx = Yr = 1 , podemos escrever: 
 
No,x = Nf,x . 2
-Ct,x (1) No,r = Nf,r . 2
-Ct,r (2) 
Dividindo (1) por (2)  
No,x = Nf,x . 2
-Ct,x 
No,r = Nf,r . 2
-Ct,r 
Definindo: No,x/No,r = XN quantidade normalizada de moléculas 
 do gene de interesse em relação ao número 
 de moléculas controle no tempo zero 
 
 Nf,x/Nf,r = K relação constante e próxima de 1, visto 
 que o número de moléculas amplificadas 
 quando ambos atingem o limiar deve ser o 
 mesmo. 
 
 
Temos que 
 XN = K . 2
-Ct 
Em nossos experimentos o valor de XN (número normalizado de nossas 
moléculas alvo no início da reação de PCR) será medido em diferentes 
condições experimentais: 
 
por exemplo condição A e condição B: 
 
Assim teremos: 
 
 XN,A K . 2
-Ct,A 
= 
XN,B K . 2
-Ct,B 
= 2-   Ct 
Exemplo de comparação da quantidade de moléculas de mRNA/c-myc 
normalizada pela quantidade de molécula de mRNA/GAPDH em cérebro e rins. 
A comparação foi: cérebro/cérebro 
 rim/cérebro 
Livak KJ AND Schmittgen TD 2001 Methods 25:402-048 
Quantificação relativa de mRNA por PCR convencional 
Quantificação relativa mRNA 
 
 Comparação de amostras A e B 
 
A quantidade de um mRNA específico em cada uma das amostras A e B é normalizada por meio da 
comparação com a quantidade de uma molécula tomada como controle interno, esta com 
expressão constante nas condições A e B. 
 
Controles internos mais utilizados: b-actina; b2-microglobulina, GAPDH; fosfogliceratocinase 1; 
hipoxantina ribosiltransferase (HPRT1); RNA ribossomal 
 
Estes mesmos controles internos são utilizados para PCR em tempo real 
 
 
Para quantificação, o que mais comumente é feito quando não se dispõe de PCR em 
tempo real: 
 
• Transcrição reversa com oligo-dT ou randon primers, a partir de 5 mg de RNA total de 
cada uma das amostras correspondentes às situações A e B 
 
• Diluição do cDNA (1:10 a 1:100) - 1 mL para PCR 
 
• PCR com primers específicos para o gene alvo e para um gene utilizado como 
controle interno. 
 
• Faz-se PCR com números variáveis de ciclos, de modo a determinar o menor número 
de ciclos necessários para visualização da banda amplificada sem alcançar o platô. 
• A amplificação de ambos os genes deve estar na fase exponencial de amplificação, 
para que possamos fazer a comparação entre eles. 
Cinética da PCR 
Nf = No (1 + Y)
n 
A quantidade final de produto só tem relação conhecida com a quantidade inicial 
de moléculas alvo se o platô ainda não foi atingido 
Considerações sobre controles internos 
para PCR semiquantitativo 
O RNA nativo a ser usado como controle interno: 
•Não deve ter sua expressão modificada pela manobra experimental e condição 
especial que está sendo analisada. 
•Os níveis de expressão do controle interno e do gene analisado devem ser similares. 
•A amplificação de uma molécula muito abundante pode prejudicar, por competição, 
a amplificação da molécula pouco abundante (isso, para multiplex PCR) 
Para genes muito expressos: GAPDH e b-actina (ambos muito abundantes) 
Para genes de média e baixa expressão: hipoxantina ribosiltransferase (HPRT1) que é um gene 
housekeeping com poucas cópias de mRNA 
Para estudos com estimulação com soro: b2-microglobulina ou 18S 
Neste caso, b-actina e GAPDH não são recomendáveis 
 
No caso da avaliação do efeito de um dado tratamento, o 
controle interno não deve sofrer variação com o tratamento. 
No exemplo acima, b-2 microgobulina poderia ser usada como 
controle interno, mas não o GAPDH. 
Exemplo de análise 
temporal do nível de 
expressão gênica após 
um dado tratamento 
Gene de interesse: 
Interleucina Ib 
 
 
Controle interno: 
18S 
Para análise quantitativa a integridade do RNA é fundamental. 
 
Com a degradação parcial do RNA há alteração da relação entre 
a quantidade de um RNA específico e a quantidade de RNA total. 
As moléculas de RNA não se degradam de forma homogênea. 
A reprodutibilidade dos experimentos de quantificação relativa cai 
muito quando o número de cópias da molécula alvo é muito baixo. 
 
Efeito de amostragem estocástica 
(“stochastic sample effect”)