11. Tecnologia do DNA recombinante

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Tecnologia do DNA recombinante
A genética
▪ A meta da genética é o estudo da estrutura e o funcionamento dos
genes e genomas.
▪ Os primeiros indícios sobre o funcionamento gênico vieram
primeiro da correlação de mutações dentro do gene com proteínas
defeituosas e doenças genéticas.
▪ A revelação da natureza do DNA e a caracterização do código
genético permitiram um salto na compreensão da natureza básica
do gene.
A genética
▪ Entretanto todas as deduções sobre os genes eram indiretas.
▪ Nenhum gene tinha sido isolado e sua sequência de DNA
diretamente examinada até a década de 70. Na verdade, parecia
impossível isolar um único gene do genoma de um organismo.
▪ Embora seja fácil isolar o DNA de tecidos vivos, como seria
possível isolar um único gene desta massa de filamentos de DNA?
Por que isolar um gene é tão importante?
1) O isolamento de um gene nos permite a determinação da sua
sequência nucleotídica. Dedução da função proteíca. Genes de
interesse biológico e médico.
2) A expressão deste gene in vitro em uma sequência de
aminoácidos permite o estudo da função deste gene.
3) O funcionamento também pode ser estudado inserindo mutações
não-sinônimas nesta sequência codificante e estudar a alteração
da função protéica.
4) Um gene pode ser transferido de um organismo a outro
(transgenia). Os organismos transgênicos são utilizados na
pesquisa básica e em aplicações comerciais especializadas.
Técnicas de DNA recombinante
❖ Conjunto de técnicas criadas na década de 70 para obter,
amplificar e manipular fragmentos específicos de DNA.
❖ Essas técnicas revolucionaram o campo da genética, abrindo as
portas para novos ramos de pesquisa, incluindo a engenharia
genética.
❖ Técnicas foram aperfeiçoadas e são utilizadas até hoje em
laboratórios de pesquisa e no nosso dia-a-dia.
DNA recombinante
“É o resultado de uma combinação in vitro entre um 
fragmento de DNA de um organismo em estudo e algum 
vetor, que vai servir para transportar e replicar este 
DNA”.
Detecção do gene alvo
Multiplicação do DNA recombinante no 
sistema bacteriano (clonagem de DNA)
Transformar o DNA recombinante em um 
sistema bacteriano
Inserir os fragmentos em vetores (centenas
de milhares)
Extrair e cortar o DNA de um genoma
doador
Procedimento básico
1. Isolando o DNA doador
➢ Os protocolos gerais para o isolamento do DNA estavam
disponíveis décadas antes do advento da tecnologia do DNA
recombinante.
➢ O DNA doador obtido é o DNA genômico nuclear nos
eucariontes e o DNA cromossômico nos procariontes.
Tipos de DNA doador
• DNA genômico: obtido a partir de extração simples 
de DNA. Precisa ser clivado para o procedimento.
• DNA quimicamente sintetizado (PCR): versão mais
utilizada atualmente por ser altamente específica.
• cDNA (DNA complementar): é a versão “artificial”
de uma molécula dupla-fita de DNA gerada a partir
de RNAm via RT-PCR.
2. A escolha do vetor (ou DNA receptor)
➢ O vetor é uma molécula pequena de DNA com uma intensa
capacidade de replicação in vivo, que irá carrear o fragmento de
DNA doador.
Vetor Descrição
Tamanho do 
DNA doador
Plasmídios Diversos tipos conhecidos Até 20 kb
Vetores virais
Principalmente fagos – tamanho
do genoma 50 kb
10 a 15 kb
Cosmídios
Híbrido artificial entre um 
plasmídio e o genoma de fago
Até 45 kb
BAC Cromossomo artificial bacteriano Até 100 kb
YAC
Cromossomo artificial de 
levedura
Até 1.000 kb
Vetores
• Plasmídios
– Pequenos fragmentos circulares de DNA
– Replicação independente do DNA bacteriano
– Presença ou ausência dentro da bactéria
– Quantidade variável
– Resistência a drogas e outras características 
fenotípicas “visíveis”
– Bom método para amplificar o DNA clonado
– Fragmentos clonáveis até 20kb
– Fragmentos grandes são perdidos
– Plasmídios clássicos
• pBR322
• pUC18
Vetores de Grande Porte
• Cromossomo Artificial de Levedura
– Se comporta como um pequeno cromossomo 
que se replica dentro do eucarionte e carrega 
seu DNA de interesse
– Tamanho médio do inserto: 500Kb
– Tamanho máximo do inserto: 1Mb
– Contém todas os elementos necessários para 
se replicar e segregar dentro da levedura
Cromossomo Artificial de Levedura
3. Isolando o vetor
4. Enzimas de restrição
➢As enzimas de restrição são uma forma de defesa
bacteriana contra fagos. Essas enzimas atuam como
uma tesoura, clivando o DNA em pontos específicos,
inativando-o.
➢ Por atuarem em sítios específicos (sítios de restrição),
essas enzimas são ideais para se trabalhar com a
manipulação do DNA. Qualquer molécula de DNA,
desde vírus até humanos, contem sítios de restrição ao
acaso ao longo da sequência.
4. Tipos de Cortes
5. Cortando o DNA
Ponta coesiva (adesiva)
5. Cortando o DNA
6. Ligação
➢ Após a digestão do DNA doador e do
vetor por uma enzima de restrição,
os fragmentos são colocados juntos
em um tubo de ensaio.
➢ Isso permite que as pontas adesivas
do DNA doador se juntem às do
vetor, formando moléculas
recombinantes.
➢ As pontas são unidas pela ação de
uma DNA ligase que cria as ligações
fosfodiéster nas junções.
7. Clonagem do DNA quimérico
Introdução de DNA Exógeno
DNA Shotgun
8. Gene repórter
❖ Os vetores podem carrear um ou dois genes repórteres (fenótipo
conhecido) que permite diferenciar as bactérias que receberam
ou não o vetor com o DNA recombinante.
❖ Uma colônia é visível a olho nu quando atinge 107 de células.
Uma clonagem pode gerar bilhões de cópias.
Exemplos
Construção de uma biblioteca de DNA
❖A tecnologia do DNA recombinante permite a clonagem de
um determinado gene ou região genômica de interesse.
❖Podemos clonar um genoma ou um cromossomo inteiro de
uma só vez. Essa coleção de clones é chamada de biblioteca
de DNA.
❖Esta etapa da construção da biblioteca é também é chamada
de clonagem “shotgun” porque o pesquisador clona uma
grande quantidade de fragmentos e espera que um dos
clones contenha o “tiro”, ou o gene desejado.
❖A tarefa seguinte à montagem da biblioteca é encontrar o
gene desejado.
Vetor Descrição
Tamanho do 
DNA doador
Plasmídios Diversos tipos conhecidos Até 20 kb
Vetores virais
Principalmente fagos – tamanho
do genoma 50 kb
10 a 15 kb
Cosmídios
Híbrido artificial entre um 
plasmídio e o genoma de fago
Até 45 kb
BAC Cromossomo artificial bacteriano Até 100 kb
YAC
Cromossomo artificial de 
levedura
Até 1.000 kb
Escolha do vetor (maior capacidade)
Construção de uma biblioteca de DNA
O resultado
Biblioteca de fagos
Construção de uma biblioteca de RNAm (ou cDNA)
❖Esta metodologia visa a construção de uma biblioteca de
clones usando o RNAm celular. Nesse caso não precisa clivar.
❖Esta biblioteca também é chamada de transcriptoma porque
só os genes transcritos serão clonados.
❖Como é feita de a partir do RNAm total obtido de uma
célula, os genes clonados não contêm íntrons, nem regiões
regulatórias.
❖As bibliotecas podem variar de célula a célula, uma vez que
cada tipo celular possui sua própria regulação e expressão
de proteínas específicas.
❖Uma vantagem é a ausência do chamado “DNA lixo”.
Retrotranscrição do RNA
❖O RNAm total de uma célula
é submetido a uma reação
de retrotranscrição.
❖Uma transcriptase reversa
viral utiliza o RNA como
molde para a síntese de
uma fita unifilamentar de
DNA.
❖A TR sintetiza também uma
segunda fita complementar
de DNA.
Localizar o gene alvo
• No caso de genes bacterianos pode ser a simples
expressão de um fenótipo.
• Podemos utilizar sondas de DNA marcados
quimica ou radioativamente que se hibridiza com
o DNA alvo.
• Se a proteína for conhecida, podemos utilizar
anticorpos para localizá-la (nessecaso a proteína-
alvo precisa ser expressa).
Localizando o gene alvo via sonda de DNA
❖ A biblioteca (com centenas de milhares de fragmentos clonados)
deve ser triada para se encontrar a molécula de DNA com o gene
de interesse. Nesse caso será utilizada uma sonda específica que
irá marcar o clone desejado para que o pesquisador o identifique.
❖ Uma sonda de DNA unifilamentar é marcada radiativamente ou
com fluorescência. Ela é utilizada para se associar por
complementaridade ao clone desnaturado contendo o gene alvo.
❖ A sonda pode ser feita a partir:
❖ DNAc gerado a partir do RNAm.
❖ Gene homólogo de um organismo evolutivamente
próximo.
❖ RNA livre (RNAt ou RNAr).
Localizando o gene alvo
A hidridização
Hibridização in situ
Hibridização in situ
Detecção de trissomia
A genética reversa
❖ Se a sequência de DNA do gene não é conhecida, pode-
se sintetizar a sonda de DNA a partir da sequência de
aminoácidos conhecida da proteína.
❖ Devido à redundância do código é difícil prever a
sequência exata de nucleotídeos do gene alvo.
❖Para contornar este problema é selecionada uma região
curta na sequência de aminoácidos com redundância
mínima (20 bp).
A genética reversa
❖ Nesse exemplo seriam sintetizados 96 filamentos de
oligonucleotídeos para servirem de sonda.
❖ O filamento correto dentro deste coquetel localizaria o
gene alvo. Difícil aplicabilidade. Existe uma alternativa.
Biblioteca de expressão
❖ O gene contido dentro de um vetor pode ser expresso e codificar
sua proteína. Vetor chamado de “Vetor de Expressão”.
❖ Para isso o vetor deve conter um promotor que expressa altos
níveis de uma proteína bacteriana específica (Ex: Operon Lac).
Biblioteca de expressão
❖ Usando a tecnologia do DNA recombinante fusionando
DNAc (RNAm) com vetores de expressão, pode-se
montar uma biblioteca de expressão.
❖ Uma vez que o produto do gene é conhecido e isolado
em forma pura, pode-se gerar anticorpos contra essa
proteína.
❖ Um segundo anticorpo anti-anticorpo marcado pode
localizar o primeiro e revelar o clone que contém o
gene-alvo.
Biblioteca de expressão
Aplicações da Tecnologia do DNA Recombinante
Transgênicos
Transgênicos
➢ Transgênicos são organismos gerados a partir de técnicas de
engenharia genética que contêm material genético (DNA) de outro
organismo.
➢ Organismos geneticamente modificados são comuns para os
geneticistas desde a década de 70.
Produção de insulina (1977)
➢ O fornecimento injeção de insulina para diabéticos começou em
1922 a partir do extrato de pâncreas de feto bovino.
➢ Em 1977, insulina humana é produzida e purificada a partir de
bactérias E. coli pela Boyer. Baixo custo de produção.
➢ Atualmente uma empresa canadense tenta produzir insulina
humana em plantas.
➢ Demanda atual de insulina: 16t por ano.
Expressão de genes eucarióticos em bactérias
➢ Quando bactérias são utilizadas para sintetizar uma proteína
eucariótica é desejável produzir a maior quantidade possível da
proteína-alvo.
➢ Atualmente muitas proteínas como a insulina humana e o hormônio
do crescimento humano são gerados em massa por bactérias e
fungos geneticamente modificados.
Produção de hGH 
Tecnologia do DNA recombinante em eucariontes 
➢As técnicas de manipulação gênica, clonagem e expressão
foram inicialmente desenvolvidas em bactérias, mas são
utilizadas rotineiramente em uma variedade de
eucariontes.
➢Algumas proteínas eucarióticas não são produzidas em
grandes quantidades em bactérias.
➢ Embora os genes eucarióticos possam ser expressos em
hospedeiros bacterianos, em geral, é desejável introduzir
esses genes de volta no organismo doador. Se este
organismo for um eucarionte, produz-se desta maneira
um organismo eucariótico transgênico.
Transgênicos na agricultura: O começo da polêmica
VANTAGENS
Alimentos mais ricos em 
nutrientes
Plantas resistentes a insetos e 
doenças
Produção de proteínas humanas
Crescimento acelerado dos 
cultivos
DESVANTAGENS
Alergia / toxicidade
Polinização cruzada (risco
ambiental)
Concentração do poder econômico
nas empresas de biotecnologia
(caso Monsanto)
Você comeria?
Farofa pronta
Pão de queijo
Óleo de soja
Sazon
Caldo de carne / galinha
Maionese
Molho de tomate
Milho verde
Arroz
Mistura de bolo (Dona Benta)
Barra de cereais
Biscoitos Bauducco
Trident
Hershey’s
Halls
Danone
Bisnaguinha
Etc, etc, etc…
Biotecnologia vegetal
➢ Plantas transgênicas podem ser obtidas através da infecção por
Agrobacterium tumefaciens, uma bactéria que causa a doença de
galha.
Tomates transgênicos
➢ Tomate tolerante a insetos (1987) – Toxina
proveniente de uma bactéria parente do
antrax.
➢ Fish Tomato (1991) – tomate resistente a
geadas (transgene de um peixe).
➢ Flavr Savr (1994) – tomate com meia-vida
prolongada.
➢ Mais sabor (2007) – inserção de genes do
manjericão tornou o tomate mais saboroso.
➢ Vacina (2008) – cientistas coreanos testam a possibilidade de criar um
tomate transgênico que produza componentes para uma vacina contra a
mal de Alzheimer. Vacina contra a SARS (2005).
Arroz dourado (Golden rice)
➢ Em 2000 foi apresentado um arroz transgênico rico em beta-
caroteno (precursor da vitamina A). A versão 2.0 produz 23x mais
do que a versão original (2005).
➢ Atualmente plantado nas Filipinas, Taiwan e EUA.
Biofarmácia
➢ Plantas que produzem terápicos contra diversas doenças.
➢ Por exemplo: ainda em desenvolvimento bananas, morangos e
maçãs transgênicas que produzem anticorpos contra a bactéria da
cárie.
➢ Finalidade: comunidades isoladas, pouco acesso aos dentistas.