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CROMATOGRAFIA Camila Nunes 2013/1 Centro de Ciência e Tecnologia – CCT Laboratório de Ciências Químicas – LCQUI Química Analítica – QUI01109 Atualmente: Vendas de equipamentos e acessórios para CG, na maioria das vezes, importados. 1940 1950 1960 “CGS” rudimentar CGL proposta (Martin e Synge) Separação de ácidos orgânicos por CGL: primeiro cromatógrafo (Martin e James) Primeiro equipamento comercial (Griffin & George) Detector por Densidade de Gás (Martin e James) Detector por Ionização em Chama (McWillian e Dewar) Detector por Captura de Eletrons (Lovelock e Lipsky) Colunas Capilares (Golay) Cromatografia Gasosa Histórico Quais misturas podem ser separadas por CG ? Misturas cujos constituintes sejam VOLÁTEIS (=“evaporáveis”) Misturas substâncias quaisquer que podem ser “arrastadas” por um fluxo de um gás. As substâncias devem ser dissolver, pelo menos parcialmente, nesse gás. DE FORMA GERAL: CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oC e que sejam termicamente estáveis. Cromatografia Gasosa Aplicabilidade 1 2 3 4 6 5 1 - Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão. 2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra. 3 - Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna. 4 - Detector. 5 - Eletrônica de Tratamento (Amplificação) de Sinal. 6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador). Observação - em destaque: temperatura controlada Cromatógrafo a Gás Fase Móvel em CG: NÃO interage com a amostra - apenas a carrega através da coluna. Assim é usualmente referida como GÁS DE ARRASTE Requisitos: INERTE Não deve reagir com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento. PURO Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária. Impurezas típicas em gases e seus efeitos: oxida / hidroliza algumas FE incompatíveis com DCE H2O, O2 hidrocarbonetos ruído no sinal de DIC Instrumentação Gás de Arraste CUSTO Gases de altíssima pureza podem ser muito caros. COMPATÍVEL COM DETECTOR Cada detector demanda um gás de arraste específico para melhor funcionamento. Seleção de Gases de Arraste em Função do Detector: He , H2 DCT DIC N2 , H2 DCE N2 (SS), Ar + 5% CH4 CUSTO PUREZA A B C A = 99,995 % (4.5) B = 99,999 % (5.0) C = 99,9999 % (6.0) Instrumentação Gás de Arraste Requisitos: Os dispositivos para injeção (INJETORES ou VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica Injeção instantânea: Injeção lenta: t = 0 t = x t = 0 t = x Instrumentação Dispositivos de Injeção de Amostras 1 2 3 4 1 - Septo (silicone) 2 - Alimentação de gás de arraste) 3 - Bloco metálico aquecido 4 - Ponta da coluna cromatográfica Instrumentação Injetor “on-column” Convencional 1 2 3 1 - Ponta da agulha da microseringa é introduzida no início da coluna. 2 - Amostra injetada e vaporizada instantâneamente no início da coluna. 3 - “Plug” de vapor de amostra forçado pelo gás de arraste a fluir pela coluna. Instrumentação Injetor “on-column” de Líquidos TEMPERATURA DO INJETOR Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposição. Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulição do componente menos volátil VOLUME INJETADO Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra COLUNA Amostras Gasosas Amostras Líquidas empacotada = 3,2 mm (1/4”) 0,1 ml ... 50 mL 0,2 L ... 20 L capilar = 0,25 mm 0,001 ml ... 0,1 mL 0,01 L ... 3 L Sólidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta-se a solução Instrumentação Parâmetros de Injeção LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L êmbolo corpo (pirex) agulha (inox 316) Microseringa de 10 L: Microseringa de 1 L (seção ampliada): corpo guia êmbolo (fio de aço soldado ao guia) agulha Instrumentação Microsseringas para Injeção EMPACOTADA = 3 a 6 mm L = 0,5 m a 5 m Recheada com sólido pulverizado (FE sólida ou FE líquida depositada sobre as partículas do recheio) CAPILAR = 0,1 a 0,5 mm L = 5 m a 100 m Paredes internas recobertas com um filme fino (fração de m) de FE líquida ou sólida Instrumentação Colunas: Definições Básicas Tubo de material inerte recheado com FE sólida granulada ou FE líquida depositada sobre suporte sólido. MATERIAL DO TUBO ø = 3 mm a 6 mm L = 0,5 m a 5 m aço inox vidro pirex níquel TEFLON Granulometria do recheio 80 - 100 mesh 149 - 177 mm 100 - 120 mesh 125 - 149 mm 60 - 80 mesh 177 - 250 mm MESH dp Eficiência maximizada com: - Diminuição de dC - Diminuição de dp - Recheio regular Limitados pela resistência à passagem de gás de arraste Colunas Empacotadas Definições Básicas Tubo fino de material inerte com FE líquida ou sólida depositada sobre as paredes internas. MATERIAL DO TUBO ø = 0,1 mm a 0,5 mm L = 5 m a 100 m sílica fundida vidro pirex aço inox Nylon Silcosteel Colunas de sílica são revestidas externamente com camada de polímero (poliimida) para aumentar resistência mecânica e química Famílias de Colunas Capilares : PLOT (Porous layer open tube) Camada de FE sólida presa às paredes internas SCOT (Support coated open tube) Paredes internas revestidas com material de recheio similar ao das colunas empacotadas WCOT (Wall coated open tube) FE liquida depositada (ligada // entrecruzada) sobre as paredes internas. Colunas Capilares Definições Básicas 1 2 3 4 5 6 1 - Septo; 2 - Entrada de gás de arraste; 3 - “Liner” (misturador); 4 - Coluna Capilar 5 - Purga de gás de arraste; 6 - Válvula de controle de purga. Baixa capacidade de processamento de amostra (sub-microlitro) Injeção direta com microseringa muito difícil !!! Injetores com divisão (“splitters”) Sistema pneumático despreza fração da amostra injetada - Menor sensibilidade (boa parte da amostra é desprezada) - Divisão da amostra raramente é uniforme (fração purgada dos constituintes menos voláteis é sempre menor) - Ajuste da razão de divisão é mais uma fonte de erros Colunas Capilares Injeção LÍQUIDAS Depositados sobre a superfície de: sólidos porosos inertes (colunas empacotadas) ou de tubos finos de materiais inertes (colunas capilares) FE líquida SUPORTE Sólido inerte poroso Tubo capilar de material inerte SÓLIDAS Colunas recheadas com material finamente granulado (empacotadas) ou depositado sobre a superfície interna do tubo (capilar) Para minimizar a perda de FE líquida por volatilização, normalmente ela é: Entrecruzada: as cadeias poliméricas são quimicamente ligadas entre si Quimicamente ligadas: as cadeias poliméricas são “presas” ao suporte por ligações químicas Fases Estacionárias Conceitos Gerais Características Gerais: - Sólidos finamente granulados (diâmetros de partículas típicos de 105 µm a 420 µm). - Grandes áreas superficiais (até 102 m2/g). Mais usados: Polímeros Porosos Porapak (copolímero estireno-divinilbenzeno), Tenax (polióxido de difenileno) Sólidos Inorgânicos Carboplot, Carboxen (carvões ativos grafitizados), Alumina, Peneira Molecular (argila microporosa) GASES DE REFINARIA Coluna:Carboxen-1000 60-80 mesh; 15’ x 1/8” TCOL: 35oC a 225oC / 20oC. min-1 Gás de Arraste: He @ 30 ml.min-1 Detector: DCT Principais Aplicações: - Separação de gases fixos - Compostos leves - Séries homólogas Fases Estacionárias FE Sólidas O fenômemo físico-químico responsável pela interação analito + FE sólida é a ADSORÇÃO A adsorção ocorre na interface entre o gás de arraste e a FE sólida ADSORÇÃO Sólidos com grandes áreas superficiais (partículas finas, poros) Solutos polares Sólidos com grande número de sítios ativos (hidroxilas, pares de elétrons...) Fases Estacionárias FE Sólidas: Adsorção Maior parte das aplicações em CG moderna Quatro grandes grupos estruturais: PARAFINAS Apolares; alta inércia química; praticamente abandonadas. Principais: esqualano (C30H62), Apiezon (graxas para vácuo). POLIÉSTERES Ésteres de diálcoois com diácidos. Polares; altamente sensíveis a umidade e oxidação; uso em declínio. Principais: DEGS, EGA, EGS. ÉSTERES METÍLICOS DE ÁCIDOS GRAXOS Coluna:5%DEGS-PS s/ Supel-coport 100/120 mesh; 6’ x 1/8” TCOL: 200oC (isotérmico) Gás de Arraste: N2 @ 20 ml.min-1 Detector: FID Amostra: 0,5 mL de solução em clorofórmio contendo 0,5 mg de cada éster Fases Estacionárias FE Líquidas POLIGLICÓIS Muito polares; sensíveis a umidade e oxidação; ainda muito importantes. Principal: Polietilenoglicol (nomes comerciais: Carbowax, DB-Wax, Supelcowax, HP-Wax, etc.) Estrutura Química: AMINAS ALIFÁTICAS Coluna:4 % Carbowax 20M s/ Carbopack B + 0,8% KOH TCOL: 200oC (isotérmico) Gás de Arraste: N2 @ 20 mL.min-1 Detector: FID Amostra: 0,01 mL da mistura de aminas Fases Estacionárias FE Líquidas SILICONES (polisiloxanas) As FE mais empregadas em CG. Cobrem ampla faixa de polaridades e propriedades químicas diversas. R1, R2 = qualquer radical orgânico - Ligação Si-O extremamente estável = elevada estabilidade térmica e química das FE. - Silicones são fabricados em larga escala para diversas aplicações = minimização de custo do produto + tecnologia de produção e purificação largamente estudada e conhecida. - Praticamente qualquer radical orgânico ou inorgânico pode ser ligado à cadeia polimérica = FE “ajustáveis” a separações específicas + facilidade de imobilização por entrecruzamento e ligação química a suportes Fases Estacionárias FE Líquidas O fenômemo físico-químico responsável pela interação analito + FE líquida é a ABSORÇÃO A absorção ocorre no interior do filme de FE líquida (fenômeno INTRAfacial) ABSORÇÃO Filmes espessos de FE líquida Interação forte entre a FE líquida e o analito (grande solubilidade) Grande superfície líquida exposta ao gás de arraste Fases Estacionárias FE Líquidas: Absorção SELETIVA Deve interagir diferencialmente com os componentes da amostra. Regra geral: a FE deve ter características tanto quanto possível próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático ...) FE Seletiva: separação adequada dos constituintes da amostra FE pouco Seletiva: má resolução mesmo com coluna de boa eficiência Fases Estacionárias Características de uma FE ideal AMPLA FAIXA DE TEMPERATURAS DE USO Maior flexibilidade na otimização da separação. BOA ESTABILIDADE QUÍMICA E TÉRMICA Maior durabilidade da coluna, não reage com componentes da amostra POUCO VISCOSA Colunas mais eficientes (menor resistência à transferência do analito entre fases) DISPONÍVEL EM ELEVADO GRAU DE PUREZA Colunas reprodutíveis; ausência de picos “fantasma” nos cromatogramas. Fases Estacionárias Características de uma FE ideal Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende de sua PRESSÃO DE VAPOR (p0). p0 Estrutura química do analito Temperatura da coluna Temperatura da coluna Pressão de vapor Velocidade de migração ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE (MENOR RETENÇÃO) Instrumentação Temperatura da Coluna TEMPERATURA DA COLUNA CONTROLE CONFIÁVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA É ESSENCIAL PARA OBTER BOA SEPARAÇÃO EM CG Instrumentação Temperatura da Coluna Características Desejáveis de um Forno: AMPLA FAIXA DE TEMPERATURA DE USO Pelo menos de Tambiente até 400oC. Sistemas criogênicos (T < Tambiente) podem ser necessários em casos especiais. TEMPERATURA INDEPENDENTE DOS DEMAIS MÓDULOS Não deve ser afetado pela temperatura do injetor e detector. TEMPERATURA UNIFORME EM SEU INTERIOR Sistemas de ventilação interna muito eficientes para manter a temperatura homogênea em todo forno. Instrumentação Forno da Coluna Características Desejáveis de um Forno: FÁCIL ACESSO À COLUNA A operação de troca de coluna pode ser frequente. AQUECIMENTO E RESFRIAMENTO RÁPIDO Importante tanto em análises de rotina e durante o desenvolvimento de metodologias analíticas novas. TEMPERATURA ESTÁVEL E REPRODUTÍVEL A temperatura deve ser mantida com exatidão e precisão de ± 0,1°C. Em cromatógrafos modernos (depois de 1980), o controle de temperatura do forno é totalmente operado por microprocessadores. Instrumentação Forno da Coluna Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE: TCOL BAIXA: - Componentes mais voláteis são separados; - Componentes menos voláteis demoram a eluir, saindo como picos mal definidos. TCOL ALTA: - Componentes mais voláteis não são separados; - Componentes menos voláteis eluem mais rapidamente. Instrumentação Programação Linear de Temperatura A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação: Consegue-se boa separação dos componentes da amostra em menor tempo TEMPO TEMPERATURA tINI tFIM TINI TFIM R Parâmetros de uma programação de temperatura: TINI Temperatura Inicial TFIM Temperatura Final tINI Tempo Isotérmico Inicial tFIM Tempo Final do Programa R Velocidade de Aquecimento Instrumentação Programação Linear de Temperatura tR tM tR’ = tR - tM TEMPO SINAL tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a in-jeção e o ápice do pico cromatográfico) tM = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um composto que não interaja com a FE atravesse a coluna) tR’ = Tempo de Retenção Ajustado (tempo médio que as moléculas do analito passam sorvidas na FE) O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito é o TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO, tR’: Teoria Básica Tempo de Retenção Ajustado (tR’) Coluna cromatográfica: série de estágios independentes onde acontece o equilíbrio entre o analito dissolvido na fase estacionária e no gás de arraste: Ocorre um “quase-equilíbrio” entre o analito sorvido na FE e dissolvido no gás de arraste. KC = Constante de Distribuição [A]S = concentração do analito na FE [A]M = concentração do analito no gás MENOR RETENÇÃO !!! Volatilidade [A]M Afinidade pela FE [A]S Teoria Básica Constante de Distribuição (kC’) Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal quando da passagem de substâncias, que não o gás de arraste, proporcional à quantidade do analito. Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma. Instrumentação Detectores ~ 60 detectores já usados em CG ~ 15 equipam cromatógrafos comerciais 4 respondem pela maior parte das aplicações DCT TCD Detector por Condutividade Térmica DIC FID Detector por Ionização em Chama DCE ECD Detector por Captura de Eletrons EM MS Detector Es-pectrométrico de Massas Detectores Definições Gerais SENSIBILIDADE Relação entre o incremento de área do pico e o incremento de massa do analito. MASSA ÁREA Fator de Resposta, S: inclinação da reta Área do pico x Massa do analito o mesmo incremento de massa causa um maior incremento de área Sensibilidade S Na ausência de erros determinados: A = área do pico cromatográfico m = massa do analito Detectores Parâmetros Básicos de Desempenho UNIVERSAIS: Geram sinal para qualquer substância eluída. SELETIVOS: Detectam apenas substâncias com determinada propriedade físico-química. ESPECÍFICOS: Detectam substâncias que possuam determinado elemento ou grupo funcional em suas estruturas Detectores Classificação PRINCÍPIO Variação na condutividade térmica do gás quando da eluição de um analito. Cela de Detecção do DCT: 1 2 3 5 4 i 1 Bloco metálico (aço) 2 Entrada de gás de arraste 3 Saída de gás de arraste 4 Filamento metálico (liga W-Re) aquecido 5 Alimentação de corrente elétrica para aquecimento do filamento A taxa de transferência de calor entre um corpo quente e um corpo frio depende da condutividade térmica do gás no espaço que separa os corpos Se a condutividade térmica do gás diminui, a quantidade de calor transferido também diminui - o corpo quente se aquece. Detectores Detector por Condutividade Térmica Configuração tradicional do DCT: bloco metálico com quatro celas interligadas em par - por duas passa o efluente da coluna e por duas, gás de arraste puro: CELAS DA AMOSTRA CELAS DE REFERÊNCIA CORTE SUPERIOR CELAS DA AMOSTRA CELAS DE REFERÊNCIA CORTE LATERAL Quando da eluição de um composto com condutividade térmica menor que a do gás de arraste puro: Diferença de resistência elétrica entre os filamentos de amostra e referência Filamentos nas celas de amostra se aquecem Resistência elétrica dos filamentos nas celas de amostra aumenta Filamentos nas celas de referência não se aquecem Resistência elétrica dos filamentos nas celas de referência fica constante Detectores Detector por Condutividade Térmica 1 Separação e quantificação de compostos que não geram sinal em outros detectores (gases nobres, gases fixos) 2 Por ser um detector não-destrutivo, pode ser usado em CG preparativa ou detecção sequencial com dois detectores em “tandem” Coluna: CP Sil 5CB (50 m x 0.32 mm x 5 µm) Gás de Arraste: He @ 3 ml.min-1 TCOL: 40°C Detector: DCT 1 N2 2 CH4 3 CO2 4 n-C2 5 NH3 6 n-C3 7 i-C4 8 n-C4 Separação de Gases Fixos e Hidrocarbonetos: Detectores DCT: Aplicações PRINCÍPIO Formação de íons quando um composto é queimado em uma chama de hidrogênio e oxigênio O efluente da coluna é misturado com H2 e O2 e queimado. Como numa chama de H2 + O2 não existem íons, ela não conduz corrente elétrica. Quando um composto orgânico elui, ele também é queimado. Como na sua queima são formados íons, a chama passa a conduzir corrente elétrica Detectores Detector por Ionização em Chama COLETOR FLAME TIP BLOCO AR H2 COLUNA O ar e o H2 difundem para o interior do coletor, onde se misturam ao efluente da coluna e queimam: Uma diferença de potencial elétrico é aplicada entre o flame tip e o coletor quando se formam íons na chama, flui uma corrente elétrica: Detectores Detector por Ionização em Chama Química da Chama de Hidrogênio: Incandescência Reação Quebra Estrutura da chama três regiões básicas Região de quebra Mistura dos gases, pré-aquecimento, início da quebra das moléculas de H2, O2 e dos analitos. Zona de reação Reações exotérmicas com produção e/ou consumo de radicais H, O, OH, HO2 (provenientes do H2), CH e C2 (proveniente do analito) e íons CHO+ (analito). Zona de incandescência Emissão de luz por decaimento de espécies excitadas: OH (luz UV), CH e C2 (visível). Queima de substâncias com ligações C-H CH + O CHO+ + e- 1 íon formado a cada ~105 átomos de C queimados Queima de H2 Formam-se apenas radicais !!! Detectores Detector por Ionização em Chama SELETIVIDADE Seletivo para substâncias que contém ligações C-H em sua estrutura química. (como virtualmente todas as substâncias analizáveis por CG são orgânicas, na prática o DIC é UNIVERSAL) Compostos que NÃO produzem resposta no DIC: Gases nobres H2, O2, N2 CO, CO2, CS2 CCl4, peralogenados NH3, NxOy SiX4 (X = halogênio) H2O HCOOH, HCHO * SENSIBILIDADE / LINEARIDADE QMD típicas = 10 pg a 100 pg com linearidade entre 107 e 108 (pg a mg) DIC DCT N2 CH4 CO2 O2 Detectores Características Operacionais DIC Modificação do DIC altamente seletiva para compostos orgânicos nitrogenados e fosforados Pérola de sal de metal alcalino: RbCl (normal), KCl Seletividade S para fosforados ou nitrogenados: 10.000 x - 100.000 x em relação a hidrocarbonetos similares QMD = 0,4 pg a 10 pg (N) e 0,1 a 1 pg (P) Pesticidas Triazínicos usando DNP: 1 Desetilatrazina 2 Desisopropilatrazina 3 Atraton 4 Atrazina 5 Trietazina 6 Secbumeton 7 Sebutilazina 8 Simetrin 9 Dipropretrina 10 Dimetametrina 11 Metroprotrina (100 pg cada) Detectores Detector de Nitrogênio-Fósforo PRINCÍPIO Supressão de um fluxo de eletrons lentos (termais) causada pela sua absorção por espécies eletrofílicas Um fluxo contínuo de eletrons lentos é estabelecido entre um anôdo (fonte radioativa b -emissora) e um catodo. Na passagem de uma substância eletrofílica alguns eletrons são absorvidos, resultando uma supressão de corrente elétrica. Detectores Detector por Captura de Elétrons 1 2 3 4 5 1 Anôdo (fonte radioativa b - emissora) 2 Saída de gases 3 Catodo 4 Cavidade 5 Coluna cromatográfica Detectores Detector por Captura de Elétrons PRINCÍPIO A amostra é fragmentada e ionizada em um padrão característico da espécie química. 1 Moléculas da amostra são bombardeadas por elétrons (electron impact = EI) ou íons (chemical ionization = CI): ABCDE + e- ABCDE.+ + 2 e- 2 O íon formado se fragmenta: ABCDE.+ AB. + CDE+ ABCDE.+ AB+ + CDE. ABCDE.+ A+ + BCDE. 3 Os fragmentos iônicos formados são separados magneticamente de acordo com suas massas moleculares e contados: ABUNDÂNCIA MASSA / CARGA O gráfico do número de íons formados em função da razão Massa / Carga dos íons é o ESPECTRO DE MASSAS do analito Detectores Detector Espectrômetro de Massas 1 2 3 4 1 Câmara de Ionização Eletrons gerados por um filamento aquecido bombardeam a amostra. Os fragmentos ionizados (carga +1) são repelidos pelo eletrodo positivo e conduzidos ao separador magnético. 2 Saída de Vácuo Todo o interior do EM deve estar sob alto vácuo. 3 Separador Magnético A ação do campo magnético deixa apenas íons com determinada razão Massa / Carga atravessar esta área do equipamento. 4 Detector Uma válvula fotomultiplicadora ou um fotodiodo gera um sinal elétrico proporcional ao número de íons que incide sobre o elemento. Detectores Detector Espectrômetro de Massas m/Z = 118 m/Z = 80 m/Z = 79 - CO - (CO + H) m/Z = 90 20 40 60 80 100 120 0 m / Z Detectores Espectro de Massas Fontes de Informações Qualitativas RETENÇÃO Uso de dados de retenção de um analito para sua identificação DETECÇÃO Detectores que fornecem informações estruturais sobre as substâncias eluídas Identificação individual das espécies contidas na amostra Determinação da identidade da amostra propriamente dita Aplicações Qualitativas de CG Para análise qualitativa confiável por CG é recomendável combinação de dados provenientes de pelo menos duas fontes Análise Qualitativa Conceitos Gerais t’R Interações analito / FE Pressão de vapor do analito Condições operacionais (TCOL, FC ...) Fixas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustado de um analito é uma constante AMOSTRA PADRÃO Comparação de cromatogramas da amostra e de uma solução padrão do analito suspeito Análise Qualitativa Tempos de Retenção Por definição chamamos de TEMPO DE RETENÇÃO, tr, de uma substância ao tempo decorrido do instante em que a amostra foi introduzida até o instante do máximo do pico. tR tM tR’ = tR - tM TEMPO SINAL Cromatografia Tempo de Retenção Na separação cromatográfica, a velocidade de eluição das espécies químicas presentes na amostra é diferente. Essa velocidade depende da constante de equilíbrio durante o processo de distribuição dos solutos entre a fase móvel e a fase estacionária. Os valores de Kc afetam a separação dos componentes de uma amostra. • Kc é alterada com o tipo (e volume) das fases móvel e/ou estacionária. Cromatografia Tempo de Retenção Uma separação total das espécies é possível se a coluna for suficientemente longa. Cromatografia Tempo de Retenção Fatores que afetam o tempo de retenção: Constante de distribuição (Kc); Vazão da fase móvel; Temperatura da coluna. Cromatografia Tempo de Retenção Quando se deseja quantificar um determinado composto em uma amostra. COMO??? Calibração Preparação de uma série de soluções padrão cuja composição se aproxima daquela da amostra. As áreas ou as alturas dos picos são relacionadas com a concentração de cada padrão. Curva de calibração (ou analítica) Cromatografia Análise Quantitativa Uma curva de calibração é válida somente para o conjunto de condições nas quais ela foi obtida. Curva de calibração Cromatografia Análise Quantitativa Método de calibração – Padrão externo Compara a resposta para o analito de interesse em uma amostra com as respostas obtidas para soluções de concentrações conhecidas preparadas a partir de um padrão. Curva de calibração: Respostaanalito X Concentração Cromatografia Análise Quantitativa Método de calibração – Padrão externo Exemplo 1 - Um grupo de alunos de uma universidade tiveram a necessidade de quantificar o eugenol presente no óleo de cravo-da-índia que foi obtido em uma aula experimental. Preparam os padrões que foram, por sua vez, analisados por cromatografia gasosa. As concentrações dos padrões e as áreas correspondentes estão nas tabelas abaixo. Tabela 1. Preparação dos padrões. Tabela 2. Resultados da injeções dos padrões. Cromatografia Análise Quantitativa Método de calibração – Padrão externo Exemplo 1 - a) Qual seria a curva de calibração para o eugenol? Cromatografia Análise Quantitativa Método de calibração – Padrão externo Exemplo 1 - b) A amostra de óleo de cravo-da-índia foi injeta por quatro analistas diferentes e os resultados se encontram na tabela abaixo. Qual a concentração do eugenol na amostra? Tabela 3. Resultados obtidos por diferentes analistas. Cromatografia Análise Quantitativa Área média: 61518,25 Método de calibração – Padrão interno Preparo de soluções padrão de concentrações conhecidas do analito de interesse com adição de uma quantidade determinada de outra substância padrão, chamada padrão interno. Curva de calibração: Respostaanalito Interesse / Respostapd. Interno X Concentração Cromatografia Análise Quantitativa Método de calibração – Padrão interno Escolha do padrão interno: A substância escolhida como tal deve: Ser similar ao analito a ser quantificado; Ter tempo de retenção próximo a esta substância; Não reagir com componentes da amostra; Não fazer parte da amostra; Para métodos cromatográficos, não co-eluir com demais compostos da amostra. Cromatografia Análise Quantitativa Método de calibração – Padrão interno Exemplo 2 - O mesmo grupo de alunos do exemplo 1, não satisfeitos com os resultados obtidos, resolveram preparar uma curva de calibração para o eugenol utilizando o método do padrão interno. Para isso, refizeram os padrões e amostra com a adição de uma quantidade conhecida de carvona (1,84 g.L-1) (padrão interno). Os resultados estão expostos abaixo. Tabela 4. Resultados da injeções dos padrões. Cromatografia Análise Quantitativa Método de calibração – Padrão interno Exemplo 2 – a) Como seria construída a curva de calibração para este método? Tabela 4. Resultados da injeções dos padrões. Cromatografia Análise Quantitativa Método de calibração – Padrão interno Exemplo 2 – b) E para este método? Qual seria a concentração do eugenol? Tabela 5. Resultados da injeções obtidos por diferentes analistas. Cromatografia Análise Quantitativa Razão média: 0,632 CONSEQUÊNCIA: pode comprometer a eficiência da separação cromatográfica: Analitos com retenções próximas: separação deficiente; Picos mais largos e menos intensos = menor detectabilidade. EFICIÊNCIA: Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito. Cromatografia Alargamento da Banda Cromatográfica O que faz com que o alargamento das bandas aconteça?? Cromatografia Alargamento da Banda Cromatográfica O desempenho, ou eficiência, da coluna está relacionado com dois termos: número de pratos teóricos (N); altura do prato (H). Onde: L = comprimento da coluna em cm O desempenho da coluna aumenta com o aumento do número de pratos e a diminuição da altura destes. Cromatografia Pratos Teóricos – Desempenho da Coluna Considera que a coluna é constituída em camadas estreitas e contínuas (“pratos”), onde ocorre o equilíbrio do soluto entre FE e FM; O movimento do soluto através da coluna = transferência da FM em equilíbrio entre pratos subsequentes. Cromatografia Pratos Teóricos – Desempenho da Coluna
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