Aula 04 - Meios de cultura e coloração

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Prof. Everardo A. Menezes
Prof. associado de Microbiologia
Universidade Federal do Ceará
Departamento de Análises Clínicas
Laboratório de Leveduras
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- È um conjunto de substâncias, formuladas de maneira adequada, capazes de promover o crescimento microbiano, elas simulam as condições do nosso corpo.
Características básicas dos meios de cultura:
Fonte de carbono e nitrogênio
Sais minerais
Vitaminas
Fonte de energia
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Classificação dos meios de cultura
Meio de enriquecimento
Meio simples
Meio nutritivo
Meio de transporte
Meio seletivo
Meio hiper seletivo
Meio diferencial
Meio de suporte
Meio indicador
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Preparação e distribuição de meios de cultura
Os meios comerciais devem ser hidratados; 
Devem ser pesados  papel manteiga/alumínio;
Frasco – Beckers ou erlemeyers;
Hidratar em pequena quantidade;
Depois deve-se acrescentar o restante da água;
Levar o meio para fundir  aquecer;
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Preparação e distribuição de meios de cultura
Usar sempre luvas térmicas;
Sempre que for usado o termo "esterilizar em autoclave", o tempo de esterilização é de 15 minutos e a temperatura de 121ºC;
Sempre que for usado o termo "esterilizar por filtração", usar o filtro com porosidade de 0,20 micra, recomendado para partículas bacterianas;
Distribuir o meio antes de autoclavar, os tubos não precisam estar esterilizados;
Distribuir o meio após a autoclavação, os tubos, frascos, placas, pipetas e vidrarias  estéreis;
Os meios devem ser autoclavados com as tampas semi-abertas, para que a esterilização seja por igual em todo o conteúdo dos tubos - tampas fechadas não permitem a entrada do vapor;
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Meios para crescimento e isolamento
CALDO BHI – BRAIN HEART INFUSION
Nutrientes de cérebro e coração: proteínas e açucares;
Função 
Cultivo quase todos os micro-organismos (estreptococcos, pneumococos, meningococos, enterobactérias, não fermentadores, leveduras e fungos);
Pode ser utilizado na preparação do inóculo para teste de susceptibilidade aos antimicrobianos;
Realização de teste de coagulase em tubo;
Teste de crescimento bacteriano a 42 e 44°C - Escherichia coli
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Meios para crescimento e isolamento
ÁGAR SANGUE
Base rica;
Ótimas condições de crescimento;
Formação de halos de hemólise nítidos, úteis para a diferenciação de Streptococcus spp. e Staphylococcus spp;
À base do meio  adiciona-se sangue de cavalo, carneiro ou coelho.
FUNÇÃO
Usado para o isolamento de micro-organismos não fastidiosos;
Verificação de hemólise dos Streptococcus spp. e Staphylococcus spp;
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Meios para crescimento e isolamento
ÁGAR MAC CONKEY
O cristal violeta inibe o crescimento de micro-organismos Gram positivos especialmente enterococos e estafilococos;
A concentração de sais de bile é relativamente baixa em comparação com outros meios;
É um meio diferencial e seletivo para Bacilos Gram negativos como, por exemplo, as Enterbactérias;
FUNÇÃO
BGN (enterobactérias e não fermentadores) e verificar a fermentação ou não da lactose;
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MEIOS PARA PROVAS DE TSA
ÁGAR MUELLER HINTON
Ágar padronizado por Kirby e Bauer e pelo CLSI que oferece condições de crescimento das principais bactérias para fazer o TSA;
FUNÇÃO
Meio utilizado para a realização do teste de avaliação da resistência aos antimicrobianos pelos métodos de difusão em disco e E-test para quase todas as bactérias;
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Meios para crescimento e isolamento
ÁGAR CLED – CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT
Micro-organismos presentes em amostras urina;
A deficiência de eletrólitos inibe as bactérias da microbiota normal (contaminantes).
FUNÇÃO
Isolar e quantificar micro-organismos Gram positivos, Gram negativos e leveduras na urina;
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Meios para crescimento e isolamento
ÁGAR CHOCOLATE
Utilizado para o cultivo de micro-organismos fastidiosos;
Cresce quase todos os tipos de micro-organismos;
À base do meio  adiciona-se sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura alta  hemácias lisam liberando hemina e hematina  inativação dos fatores de coagulação  crescimento dos micro -organismos exigentes;
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Meios para crescimento e isolamento
THAYER-MARTIN CHOCOLATE
É um meio rico e superior a outros meios de cultivo destinados para o isolamento de Neisseria sp;
Contém em sua fórmula antibióticos;
Contém salicina que inibem o crescimento de outras bactérias, quando em amostras colhidas de sítios contaminados;
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Meios para crescimento e isolamento
ÁGAR SALMONELLA-SHIGELLA (SS)
Possuem componentes (sais de bile, verde brilhante e citrato de sódio) que inibem micro-organismos Gram positivos;
Lactose ao meio  se o micro-organismo é lactose positiva;
Tissulfato de sódio e o citrato férrico permitem a detecção de H²S evidenciado por formação de colônias de cor negra no centro.
FUNÇÃO
Selecionar e isolar espécies de Salmonella sp e Shigella sp, em amostras de fezes, alimentos e água.
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Meios para crescimento e isolamento
CALDO SELENITO
Inibem coliformes e outras espécies da microbiota intestinal como estreptococos;
FUNÇÃO
Isolamento de Salmonella spp. e Shigella spp. em amostras de fezes, urina e alimentos...
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Meios para crescimento e isolamento
CALDO TETRATIONATO
Os sais de bile contidos no meio de tetrationato inibem micro-organismos Gram positivos e a adição da solução de iodo inibe a microbiota intestinal normal de espécies fecais;
FUNÇÃO
Meio de enriquecimento para Salmonella spp.
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Meios para crescimento e isolamento
LÖWENSTEIN JENSEN
A base do meio é constituída por ovos, verde malaquita e ácidos graxos o que permite amplo crescimento das Micobactérias;
FUNÇÃO
Isolamento primário das micobactérias;
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Meios de cultura - transporte
CARY BLAIR
Micro-organismos patogênicos e outros coliformes fecais sobrevivem bem neste meio;
A carência de uma fonte de nitrogênio impede consideravelmente a multiplicação de microrganismos e a composição nutritiva garante a sobrevivência deles;
FUNÇÃO
Transporte de material fecal e conseqüente conservação dos microrganismos;
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Meios de cultura - transporte
SALINA TAMPONADA
Meio líquido tamponado que mantém a bactéria viável;
FUNÇÃO
Meio de transporte de fezes.
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Meios de cultura - transporte
MEIO STUART
A carência de uma fonte de nitrogênio impede consideravelmente a multiplicação de micro-organismos e a composição nutritiva garante a sobrevivência deles;
FUNÇÃO
Transporte de diversos materiais e conseqüente conservação dos micro-organismos;
Haemophilus spp., Pneumococcus, Salmonella spp., Shigella spp. entre outros.
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Meios de cultura - manutenção
ÁGAR NUTRIENTE
Meio simples, de fácil preparação e barato;
FUNÇÃO
Várias aplicações  análise de água, alimentos e leite como meio para cultivo preliminar das amostras submetidas à exames bacteriológicos e isolamento de organismos para culturas puras;
Conservação e manutenção de culturas em temperatura ambiente;
Usado para observar esporulação de espécies de bacilos Gram positivos;
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MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
FITA PARA PROVA DE OXIDASE
O teste de oxidase é baseado na produção intracelular da enzima oxidase pela bactéria;
FUNÇÃO
Ajuda caracterizar espécies de Neisseria, distingui não fermentadores (oxidase positiva) de enterobactérias (oxidase negativa);
Diferencia algumas bactérias fermentadoras oxidase positiva entre elas Plesiomonas shigelloides, Aeromonas spp. e Vibrio spp.
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Interpretação
Oxidase positiva: roxo, bactéria não fermentadora;
Oxidase negativa: fermentadora, fazer testes bioquímicos (enterobactérias);
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MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
PARA PROVA DE TOLERÂNCIA AO NaCl 6,5%
A tolerância ao NaCl a 6,5% é uma prova utilizada para verificar a capacidade de alguns micro-organismos crescerem em presença do sal;
Meio base utilizadoé o BHI caldo, que é um meio nutritivo de uso geral, empregado para o cultivo de muitas bactérias; 
FUNÇÃO
Separa os Streptococcus dos Staphylococcus;
Na identificação de bacilos Gram negativos não fermentadores.
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MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
ÁGAR BÍLE-ESCULINA
Capacidade de bactérias hidrolisarem esculina na presença  bile;
A esculina é um derivado glicosídico da cumarina;
A esculina é incorporada em um meio contendo 4% de sais biliares;
As bactérias Bile-Esculina POSITIVAS  crescem  presença de sais biliares;.
A hidrólise da esculina no meio resulta na formação de glicose e esculetina;
A esculetina reage com íons férricos (fornecidos pelo composto inorgânico do meio - o citrato férrico), formando um complexo negro;
FUNÇÃO
Identificação dos Enterococcus spp e algumas especies de Streptococcus, que são Bile-Esculina positiva;
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MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
ÁGAR CITRATO SIMMONS
Verifica a capacidade da bactéria de utilizar o citrato de sódio como única fonte de carbono;
Sais de amônia  alcalinizando o meio;
FUNÇÃO
Diferenciar gêneros e espécies de Enterobactérias e não fermentadores.
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MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
ÁGAR FENILALANINA
Verifica a capacidade da bactéria de produzir ácido fenilpirúvico a partir da fenilalanina por ação enzimática;
FUNÇÃO 
Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias;
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MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
ÁGAR TSI – TRIPLO AÇÚCAR FERRO
Este meio contém três açúcares: 1,0%glicose, 1,0% lactose, 1,0% sacarose, vermelho de fenol para detecção da fermentação de carboidratos e sulfato de ferro para detecção da produção de sulfato de hidrogênio (indicado pela cor preta na base do tubo);
 A fermentação é indicada pela mudança da cor do indicador de pH de vermelho para amarelo. O ágar fundido é deixado solidificar, formando uma superfície inclinada;
Essa configuração origina duas câmaras de reação dentro do mesmo tubo;
A porção inclinada ou bico, exposta em toda sua superfície ao oxigênio atmosférico, é aeróbia. A porção inferior, denominada profundidade ou fundo, está protegida do ar e é relativamente anaeróbia;
FUNÇÃO
Diferenciar bacilos Gram negativos com base na fermentação de carboidratos, produção de sulfato de hidrogênio e gás.
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MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
TSI - LEITURA
Reações ápice/base:
Púrpura/amarelo = fermentação apenas da glicose (lactose e sacarose negativos);
Amarelo/amarelo = fermentação da glicose + lactose e/ou sacarose (2 ou 3 açucares);
Presença de gás (CO²) = bolhas ou meio fragmentado;
H²S positivo = presença de precipitado negro;
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MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
ÁGAR BASE URÉIA (CHRISTENSEN)
Determinar a habilidade do micro-organismo de degradar a uréia em duas moléculas de amônia pela ação da enzima urease;
Positivo  na alcalinização do meio;
Função 
BGN fermentadores e não fermentadores  Staphylococcus e Haemophilus.
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MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
PARA PROVA DE GELATINASE
Determina a habilidade do micro-organismo de produzir enzimas proteolíticas (gelatinases) que
liquefaz/hidrolisa gelatina;
FUNÇÃO 
Identificar e classificar bactérias fermentadoras, não fermentadoras e bacilos Gram positivos esporulados.
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MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO
PARA TESTE DE MOTILIDADE
A bactéria é móvel  flagelo;
Flagelos ocorrem nos bacilos Gram negativos, poucas formas de cocos são móveis;
FUNÇÃO
Determinar se o micro-organismo é ou não móvel;
Meios associados a outros testes: Meios SIM (Sulfato, Indol, Motilidade);
MILI (Motilidade, Indol, Lisina);
MIO (Motilidade, Indol, Ornitina) utilizados para testes enterobactérias;
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COLORAÇÕES 
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Colorações diferenciais 
Reage de modo distinto em diferentes bactérias;
Servem para diferenciar as bactérias;
Ex.: Gram
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BAAR
BACILOS ÁLCOOL-ÁCIDO-RESISTENTES;
Não se coram pelo Gram;
Ácido micólico e lipidios da parede;
Circundados por uma parede celular hidrofóbica;
Resistem a descoloração; 
Misturas de álcool-ácido usadas na identificação;
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Coloração para cápsula
Chamada coloração negativa;
Método difícil;
Durante o procedimento  lavagem retira cápsula;
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Coloração para cápsula
Cápsulas geralmente não aceitam corantes biológicos;
Tinta nanquim;
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Coloração de esporos 
Verde malaquita  corante primário;
Lavagem;
Safranina  cora o restante da bactéria;
Bactéria  verde e rosa;
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Coloração dos flagelos 
Estruturas muitos pequenas;
Procedimento delicado para coloração;
Usa-se mordente e carbolfucsina;
Aumenta o diâmetro dos flagelos  visível ao microscópio óptico;
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Recomendações 
Toda amostra é potencialmente contaminada;
Manipulação de material biológico  Biossegurança;
Procedimento com risco com respingos  cabine de segurança;
Não pipetar com a boca;
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Recomendações 
Não reencapar agulhas;
Descartar em recipiente adequado;
Material contaminado deve ser descontaminado antes do descarte;
Determinar área limpa e contaminada;
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Recomendações 
Limpar e desinfetar todas as áreas de trabalho;
Manter bancadas organizadas;
Não estocar material contaminado;
Tirar a bata quando sair do setor;
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Recomendações 
Lavar as mãos sempre;
Separar materiais em sacos de lixo;
Todos os reagentes identificados;
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Acidentes 
Sempre pedir ajuda;
Não omitir fatos;
Material biológico  superfície  hipoclorito 2%;
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Acidentes 
Material biológico  pele  sabão e álcool 70%;
Material biológico na bata  lavagem;