4 - Métodos de Coloração

Prévia do material em texto

1
MÉTODOS MÉTODOS 
DEDE
RABELO, R. N. 
ProfªProfª Juliana de Andrade CintraJuliana de Andrade Cintra
DEDE
COLORAÇÃOCOLORAÇÃO
MÉTODOS DE COLORAÇÃO
PAREDES CELULARES DE CÉLULAS 
GRAM-POSITIVAS
• Maioria Gram-positivas.
RABELO, R. N. 
– Parede celular:
• Camadas de peptideoglicana.
– Formando:
• Estrutura espessa e rígida.
MÉTODOS DE COLORAÇÃO
PAREDES CELULARES DE CÉLULAS 
GRAM-POSITIVAS
• Tem quase 80nm de espessura.
RABELO, R. N. 
q p
– 40% a mais de 80%.
• Peso seco das paredes celulares.
• Pepitdeoglicana.
• Razão das bactérias Gram-positivas.
– Mais sensíveis à penicilina.
MÉTODOS DE COLORAÇÃO
PAREDES CELULARES DE CÉLULAS 
GRAM-POSITIVAS
RABELO, R. N. 
• No interior da matriz de peptideoglicana.
– Variedade de proteínas, polissacarídeos e moléculas
única.
• ÁCIDOS TEICÓICOS.
– Polímeros de unidades de Ribitol (5 carbonos) ou
Glicerol (3 carbonos) e Fosfato.
• Unidos entre si por meio de ligações Fosfodiéster.
MÉTODOS DE COLORAÇÃO
PAREDES CELULARES DE CÉLULAS 
GRAM-POSITIVAS
Cl d á id T i ói
RABELO, R. N. 
• Classes de ácidos Teicóicos
– Ácido Lipoteicóico:
• Atravessa a membrana de peptideoglicana.
• Ligada a membrana plasmática.
– Ácido Teicóico da Parede:
• Ligado a camada de peptideoglicana.
MÉTODOS DE COLORAÇÃO
PAREDES CELULARES DE CÉLULAS 
GRAM-POSITIVAS
RABELO, R. N. 
• Devido a carga negativa.
– Grupo Fosfato dos Ácidos teicóicos.
• Podem ligar e regular o movimento de cátions para
dentro e fora da célula.
2
MÉTODOS DE COLORAÇÃO
PAREDES CELULARES DE CÉLULAS 
GRAM-POSITIVAS
• Podem assumir:
P l d i t l l
RABELO, R. N. 
– Papel de crescimento celular.
– Impedindo:
• Ruptura da parede e possível lise celular.
• Fornecem especificidade antigênica da parede.
– Torna possível identificação.
• Testes laboratoriais.
MÉTODOS DE COLORAÇÃO
PAREDES CELULARES DE CÉLULAS 
GRAM-NEGATIVAS
RABELO, R. N. 
• Consiste:
– Uma ou de algumas camadas de
peptideoglicana.
– Membrana externa.
• Mais delgada e complexa.
MÉTODOS DE COLORAÇÃO
PAREDES CELULARES DE CÉLULAS 
GRAM-NEGATIVAS
RABELO, R. N. 
• Peptideoglicana.
– Ligada a lipoproteína.
– Membrana externa.
– Está no espaço periplasmático.
MÉTODOS DE COLORAÇÃO
PAREDES CELULARES DE CÉLULAS 
GRAM-NEGATIVAS
• Espaço periplasmático
RABELO, R. N. 
• Espaço periplasmático.
– Compartimento que contêm:
• Enzimas de degradação.
• Proteínas de transporte.
– Se encontra entre:
• Membrana citoplasmática.
• Porção externa da parede celular.
MÉTODOS DE COLORAÇÃO
PAREDES CELULARES DE CÉLULAS 
GRAM-NEGATIVAS
Não contém ácidos teicóicos
RABELO, R. N. 
• Não contém ácidos teicóicos:
– Contêm:
• Pequena quantidade de peptideoglicana.
– Mais susceptíveis ao rompimento mecânico.
MÉTODOS DE COLORAÇÃO
PAREDES CELULARES DE CÉLULAS 
GRAM-NEGATIVAS
• Membrana externa Gram-negativas:
RABELO, R. N. 
g
– Consiste de:
• Lipoproteína.
• Lipopolissacarídeos = LPS.
• Fosfolipídeos.
– Estrutura básica:
• Similar à da membrana citoplasmática.
3
MÉTODOS DE COLORAÇÃO
PAREDES CELULARES DE CÉLULAS 
GRAM-NEGATIVAS
• Forte carga negativa:
RABELO, R. N. 
– Fator importante para a evasão da fagocitose.
– Fornece barreiras para:
• Antibióticos = Penicilina.
• Enzimas digestivas.
• Lisozima.
• Detergentes.
• Metais pesados.
• Sais biliares e certos corantes.
MÉTODOS DE COLORAÇÃO
PAREDES CELULARES DE CÉLULAS GRAM-
NEGATIVAS
• LPS:
Componente estrutural exclusivo da membrana externa
RABELO, R. N. 
– Componente estrutural exclusivo da membrana externa
das bactérias Gram-negativas.
• Moléculas dos LPS:
– São os principais determinantes antigênicos de superfície.
– Denominados antígenos somáticos ou antígenos “O”.
– São responsáveis pela atividade de endotoxina.
– Foi mais amplamente estudada em espécies:
• Salmonella e Escherichia coli.
COLORAÇÃO DE GRAM
• 1884:
– Médico e Bacteriologista dinamarquês.
– Hans Christian Gram.
RABELO, R. N. 
• Utilizada:
– Frequência para exame microscópico direto de
amostras e subcultivos.
• Classifica em dois grandes grupos:
– Gram-positivas e Gram-negativas.
COLORAÇÃO DE GRAM
MECANISMO DA COLORAÇÃO DE GRAM
• Baseia-se:
Diferenças estruturais da parede celular
RABELO, R. N. 
– Diferenças estruturais da parede celular.
– Bactérias Gram+ e Gram-.
• Cada uma reage com os vários reagentes:
– Substância que produz reação química.
RABELO, R. N. 
COLORAÇÃO DE GRAM
MECANISMO DA COLORAÇÃO DE GRAM
• Violeta de genciana:
RABELO, R. N. 
– Corante primário:
• Cora ambas as células.
– Púrpura:
• Corante é captado pelas paredes celulares de
ambos tipos de células.
4
COLORAÇÃO DE GRAM
MECANISMO DA COLORAÇÃO DE GRAM
• Iodo:
RABELO, R. N. 
– Mordente retentor.
– Forma grandes cristais com o corante.
– Se combina a peptideoglicana das paredes celulares.
– Bactérias Gram+ possuem mais peptideoglicana que
as Gram-.
– Mais cristais são depositados nas paredes celulares.
• Gram+.
COLORAÇÃO DE GRAM
MECANISMO DA COLORAÇÃO DE GRAM
• Álcool:
D t
RABELO, R. N. 
– Descorante:
• Dissolve os lipídeos na membrana externa da parede celular
Gram-.
– Permite a remoção dos cristais de corante de suas
paredes celulares.
– Cristais das paredes celulares espessas das bactérias
Gram+ permanecem.
– Bactérias Gram- :
• Ficam incolores após lavagem com álcool.
COLORAÇÃO DE GRAM
MECANISMO DA COLORAÇÃO DE GRAM
• Safranina ou Fucsina:
RABELO, R. N. 
– Contracorante.
• Adicionada.
• Bactérias:
– Cor rosa.
COLORAÇÃO DE GRAM
PROCEDIMENTOS PARA COLORAÇÃO
PREPARO DO ESFREGAÇO
RABELO, R. N. 
• Sobre o centro de uma lâmina limpa:
– Colocar uma gota d’água.
• Sobre a gota d’água:
– Colocar uma pequena quantidade de cultura a ser
examinada.
COLORAÇÃO DE GRAM
PROCEDIMENTOS PARA COLORAÇÃO
PREPARO DO ESFREGAÇO
RABELO, R. N. 
• Homogeneizar levemente.
– Movimentos circulares até formar um esfregaço fino.
• Cultura líquida dispensa-se a gota d’água.
• Fixar pelo calor:
– Chama do bico de Bunsen.
COLORAÇÃO DE GRAM
TÉCNICA DE COLORAÇÃO
• Cobrir o esfregaço com solução de Cristal
Violeta.
– Violeta de Genciana
RABELO, R. N. 
Violeta de Genciana.
– 1 a 2 minutos.
• Escorrer para retirar o excesso de violeta de
genciana.
– Cobrir o esfregaço com Iodo.
– Mordente.
– Lugol.
– 1 minuto.
5
COLORAÇÃO DE GRAM
TÉCNICA DE COLORAÇÃO
• Lavar a lâmina:
RABELO, R. N. 
– Álcool ou Solução de Álcool-Acetona.
– 10 segundos
– Até não aparecer mais corante.
• Lavar a lâmina em água corrente.
– Levemente.
COLORAÇÃO DE GRAM
TÉCNICA DE COLORAÇÃO
• Cobrir o esfregaço:
RABELO, R. N. 
– Safranina ou Fucsina.
– 30 segundos.
• Lavar a lâmina em água corrente.
– Levemente.
COLORAÇÃO DE GRAM
TÉCNICA DE COLORAÇÃO
• Secar a lâmina em temperatura ambiente.
RABELO, R. N. 
– Secagem forçada.
• Examinar a lâmina em microscópio óptico.
– Objetiva de imersão.
COLORAÇÃO DE GRAM
TÉCNICA DE COLORAÇÃO
INTERPRETAÇÃO
RABELO, R. N. 
• GRAM POSITIVO:
– Azul Escuro.
– Roxo.
• GRAM NEGATIVO:
– Rosa Pálido.
– Róseo.
– Vermelho.
RABELO, R. N. 
COLORAÇÃO DE GRAM
RABELO, R. N. 
6
COLORAÇÃO DE GRAM
RABELO, R. N. 
GRAM + e GRAM -
COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN
MECANISMO DA COLORAÇÃO
• Parede celular:
RABELO, R. N. 
– Alguns parasitos e bactérias.
• Contém cadeias longas:
– 50 a 90 Carbonos de lipídeos .
– Confere a estes MO resistência ao descoramento de
corantes básicos pelo álcool-ácido.
– Denominados “Ácidos-Resistentes”.
– Mycobacterium e Cryptosporidium sp.
– Coloração clássica requer aquecimento.
– Permitindo que o corante entre na parede celular..
COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN
PROCEDIMENTOSPARA COLORAÇÃO
PREPARO DO ESFREGAÇO
RABELO, R. N. 
• Sobre o centro de uma lâmina limpa:
– Colocar uma gota d’água.
• Sobre a gota d’água:
– Colocar uma pequena quantidade de cultura a ser
examinada.
COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN
PROCEDIMENTOS PARA COLORAÇÃO
PREPARO DO ESFREGAÇO
RABELO, R. N. 
• Homogeneizar levemente.
– Movimentos circulares até formar um esfregaço fino.
• Cultura líquida dispensa-se a gota d’água.
• Fixar pelo calor:
– Chama do bico de Bunsen.
COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN
TÉCNICA DE COLORAÇÃO
• Cobrir o esfregaço com Fucsina de Ziehl.
Aquecer a lâmina cuidadosamente até a emissão de
RABELO, R. N. 
– Aquecer a lâmina, cuidadosamente, até a emissão de
vapores.
– 5 minutos.
• Escorrer:
– Retirar o excesso da Fucsina de Ziehl.
– Diferenciar com Álcool-Ácido Clorídrico a 1%.
COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN
TÉCNICA DE COLORAÇÃO
• Lavar a lâmina com água corrente:
RABELO, R. N. 
– Levemente.
– Com cuidado.
• Corar o fundo com solução diluída de
azul de metileno.
– 30 a 50 segundos.
7
COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN
TÉCNICA DE COLORAÇÃO
• Lavar a lâmina em água corrente.
L t
RABELO, R. N. 
– Levemente.
• Secar a lâmina em temperatura ambiente.
– Secagem forçada.
• Examinar a lâmina em microscópio.
– Objetiva de imersão.
COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN
TÉCNICA DE COLORAÇÃO
INTERPRETAÇÃO
RABELO, R. N. 
• Bacilos ácidos-resistentes ou BAAR.
– Vermelho.
• Outros MO e Núcleos celulares ou
BNAAR.
– Azul.
RABELO, R. N. RABELO, R. N.