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Aula 9 PCR, Sequenciamento e Diagnóstico molecular
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UNIVERSIDADE ESTÁCIO DE SÁ CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA BASES DA BIOLOGIA MOLECULAR Prof. William Volino PCR, Sequenciamento de DNA e Diagnóstico Molecular Replicação do DNA in vitro Técnica que revolucionou a genética molecular Altamente sensível e específica Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) Diagnóstico de doenças infecciosas e genéticas Amplificação de genes para posterior clonagem e expressão Determinação de variabilidade genética Detecção de OGMs Sexagem de embriões Estudo da expressão gênica Aplicações da PCR Preparo da reação - DNA polymerase (Thermus aquaticus) - Primers Nucleotídeos Tampão DNA (RNA) Mg++ Realizada em Termocicladores Reação ocorre em três fases (ciclo) Desnaturação – as duas fitas são separadas pela alta temperatura Anelamento – os primers se ligam à sequencia alvo Extensão – A Taq polimerase produz o DNA Number of cycles 0 10 15 20 25 30 Análise por Eletroforese Géis de agarose ou nitrocelulose Corrida dos fragmentos – Amplicons Visualização dos fragmentos Marcador de peso molecular PCR Hot Start Diminui a possibilidade de formar produtos inespecíficos Baixas temperaturas favorece o anelamento do primer de forma inespecífica A enzima só entra em contato com o restante dos reagentes na hora da primeira desnaturação Separa-se o volume das amostras por uma camada de cera ou utiliza-se uma enzima bloqueada por anticorpo. PCR Touchdown Também evita o anelamento inespecífico Utiliza-se quando não se sabe a temperatura exata de anelamento A reação é programada para diminuir a temperatura sequencialmente nos ciclos inicias até chegar na temperatura ideal do primer PCR Multiplex Ideal quando há pouca amostra de DNA disponível Economiza na quantidade de reagentes Utilizam-se vários primers para diferentes loci ao mesmo tempo Investigação de paternidade Diagnóstico de doenças Identificação de transgênicos Nestead PCR Aumenta a sensibilidade e a especificidade da reação Utiliza-se o produto de uma amplificação e primers internos Ex. Um primer que identifica o gênero na primeira amplificação e um primer interno que identifica a espécie na segunda amplificação. RT-PCR Primeiro produz uma fica de DNA a partir do RNA O DNA produzido é chamado de DNA complementar (cDNA) Utiliza-se uma transcriptase reversa Posteriormente é feita a PCR normalmente, utilizando uma DNA polimerase Real Time PCR Permite a quantificação da reação, identificando a quantidade de replicons Utiliza-se fluoroforos que se ligam ao DNA produzido ou sondas específicas Baseia-se na detecção e quantificação da fluorescência aderida ao DNA RAPD (Randon Amplified Polymorphic DNA) PCR Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso Usa apenas um primer inespecífico Técnica mais simples que o DNA fingerprinting Através dela podem-se estabelecer graus de semelhança e parentesco entre indivíduos Sequenciamento do DNA Mostra a ordem exata das bases Técnica mais usada é a didesóxi ou Sequenciamento de Sanger Nucleotídeos normais e didesoxinucleotíeos marcados com fluorescencia são utilizados numa PCR Os didesoxinucleotídeos bloqueiam a síntese de DNA gerando fragmentos de diferentes tamanhos Os fragmentos são separados por eletroforese Um leitor identifica as cores Um programa de computador codifica a informação Diagnóstico molecular de doenças infecciosas Identifica o agente infeccioso através da pesquisa do seu genoma Vantagens Mais rápidos Mais sensíveis Mais específicos Mais seguros Coleta das amostras Qualquer amostra biológica Ex.: sangue, urina, biópsias, líquidos corporais Adequar a amostra aos objetivos e suspeita clínica Ex.: Hepatite – sangue Meningite - Líquor Preparação da amostra do paciente Liberação do genoma do microrganismo Rompimento das membranas com detergentes e enzimas Separação dos ácidos nucléicos de outras moléculas (ptns, lipídeos e CHO) e de restos celulares Considerar o grau de pureza, a integridade do DNA (ou RNA) e a estrutura celular do microrganismo na escolha do método Escolher métodos mais rápidos e práticos (material de fácil aquisição e manuseio) Erros de diagnóstico Resultados falso negativos Falta de amplificação Presença de inibidores da PCR Ex.: hemoglobina, heparina, EDTA Resultados falso positivos Consequência da alta sensibilidade dos métodos de amplificação Produção de amplicons inespecíficos Contaminação da amostra Dúvidas???
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