RESUMO DA PRÁTICA DE MICRO MED

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RESUMO DA PRÁTICA DE MICRO-MED
PRÁTICA 1:
Trabalhar com microbiota, a qual é diferenciada por indivíduo e nicho. A tosse é reflexo e mecanismo mecânico para evitar a entrada de microorganismos no pulmão. A microbiota é anfibiôntica, sendo benéfica para a defesa do individuo, porém pode ser maléfica no caso das infecções oportunistas.
Narina, orofaringe e nasofaringe apresentam muitos microorganismos, podendo contaminar pessoas do entorno, além de causar autoinfecção, como no caso de erisipela causada pelo Streptococcus pyogenes.
O objetivo da aula foi retirar amostras de microbiota do trato respiratório superior, retirando tais amostras da orofaringe e da narina anterior. No caso de coleta da orofaringe é recomendável engolir bem a saliva, por a língua para fora e, com auxilio do abaixador de língua, passar o swab na região das amídalas, sem encostar na língua a fim de contaminar com a microbiota lingual. No caso da coleta da narina anterior, coletar com o swab sem ir muito profundo a fim de não atingir a nasofaringe.
A semeadura foi em ágar sangue, por esgotamento, e com 3 furos no meio, incubando por 24h.
Microorganismos fastidiosos requerem mais nutrientes, para isso usam-se meios ricos, como o ágar sangue, no qual cresce uma variedade de microorganismos, favorecendo seu isolamento. O ágar sangue também é um meio diferencial, ajudando no diagnóstico preliminar com base na presença ou não de hemólise.
PRÁTICA 2:
Como resultados da prática 1 temos que na orofaringe há maior população e uma maior variedade, enquanto que na narina anterior há menor população e menor variedade.
Quanto à morfologia das colônias temos que na orofaringe há maior variedade de colônias, em geral de puntiformes a médias, e todas com halo de hemólise. Já na narina anterior há mais colônias médias e grandes.
A variedade da microbiota está relacionada com a variedade de receptores na mucosa. Na orofaringe predominam os estreptococos, enquanto que na narina anterior predominam os estafilococos.
O objetivo desta aula consistiu na coleta de colônias puntiformes, no caso das amostras de orofaringe e de colônias grandes no caso de amostras de narina anterior. Retiraram-se essas colônias com a agulha, seguida de atrito contra a parede do tubo contendo caldo simples, para colônias puntiformes e para ágar inclinado para colônias grandes.
PRÁTICA 3:
Com as amostras da aula 2, presentes no caldo simples e no ágar inclinado se realizou a coloração de Gram e o teste da catalase. O teste da catalase consiste em divisão de uma lâmina em duas partes, adicionando uma gota de salina com o material do ágar inclinado, ou uma gota do caldo simples. Quanto ao resultado do teste da catalase:
Se catalase +: realizar o teste da coagulase, onde se pega uma lâmina, divide-se em duas partes, recolhendo uma amostra robusta e, adicionando 1 gota (por pipeta) de plasma em um dos lados.
Se catalase -: realizar o teste na bacitracina, onde pega-se um swab, mergulha-o no caldo e semeia na placa com ágar sangue. De um lado da placa de ágar sangue semear com a amostra e do outro com um controle β hemolítico, e após a semeadura adicionar um disco de bacitracina.
PRÁTICA 4 – COPROCULTURA:
As fezes são semeadas em meio seletivo. As infecções do TGI são causadas por enterobactérias, as quais são bacilos Gram -, encontrados nas fezes, na urina e até no escarro.
As diarreias são manifestações clínicas comuns e facilmente identificáveis a infecção por pessoas leigas. Bactérias enteroinvasivas são capazes de desencadear disenteria, a qual consiste em diarreia com sangue e tenesmo.
A investigação laboratorial de trata de isolamento e identificação. Para outras matrizes como sangue e escarro, realiza-se o método de Gram e semeia em meios seletivos, como o ágar sangue, para diagnóstico presuntivo.
As colônias de enterobactérias presentes no ágar sangue são grandes e cinzentas, podendo ser mucoides ou secas.
No caso das fezes, devido à vasta microbiota, requer-se a realização do método de Gram e a semeadura em meios de cultura muito seletivos, além da pesquisa de enzimas metabólicas específicas através da série bioquímica.
A coleta deve ser feita em um frasco limpo, com boca larga e fechado para o transporte. A coleta também pode ser feita por swab retal em bebês e pacientes debilitados, mas o swab não pode tocar as fezes, passando apenas no esfíncter. Se o material coletado com o swab não for semeado na hora, podem-se utilizar meios de transporte como Cary e Blair, Stuart ou Amies. Sem meio de transporte deve-se semear em até 2h e com o meio de transporte em até 48h. Se o material contiver muco ou pus, os mesmos também devem ser semeados.
Os meios seletivos como ágar McConkey e EMB (eosina – azul de metileno) contêm sais biliares que selecionam apenas o crescimento de enterobactérias. Esses meios apresentam indicadores de pH e lactose. A lactose é utilizada como critério para saber se a bactéria a fermenta ou não.
	Ágar McConkey
	EMB
	Ágar SS
	Indicador de pH é o vermelho neutro
	Apresenta eosina e azul de metileno
	Apresenta lactose, tiossulfato, sais biliares e citrato
	Lactose +, o meio fica rosa
	Lactose +, o meio fica verde, as vezes verde metálico (E.coli)
	Permite a identificação de Salmonella e Shigella
	Lactose -, o meio fica claro quase transparente
	Lactose -, o meio fica púrpura/preto
	
	
	É forte indicador da presença de E.coli, pois a mesma apresenta colônias verde metálicas, uma vez que são muito fermentadoras
	
Brilho metálico significa que consumiu lactose e glicose, produzindo muito ácido.
São pouco seletivos, pois não separam E. coli das demais enterobactérias.
	Meios de triagem:
TSI: meio tríplice lactose, glicose e sacarose. Neste meio se observa a capacidade do microorganismo em fermentar esses açúcares, além da observação da formação de gás, onde o mesmo eleva o meio, onde o gás é produto da degradação de ácido fórmico. Também se pode observar a produção de H2S a partir de sulfato ferroso. O meio é um ágar inclinado com cor marrom/alaranjado contendo o indicador vermelho de fenol. A semeadura deve ser feita com agulha perfurando o meio até o fundo e semeando em estrias na superfície. Quanto ao resultado podemos ter:
	Lactose
	Glicose
	Gás
	H2S
	+ (amarelo em cima)
	+ (amarelo em baixo)
	+ (eleva o meio)
	 + (preto em baixo – também é glicose +)
	- (vermelho em cima)
	- (vermelho em baixo)
	- (não eleva o meio)
	- (amarelo ou vermelho em baixo)
Todas as enterobactérias são glicose +.
LIA: é o ágar lisina ferro, o qual verifica a capacidade de descarboxilar aas, com a produção de aminas reativas as quais alcalinizam o meio, podendo ser possível observar a formação de H2S. As amostras positivas apresentam coloração roxa, e as positivas que produzem H2S apresentam coloração roxa e o preto.
Citrato: testa a capacidade do microorganismo usar citrato como única fonte de carbono. Apresenta o indicador de pH azul de bromotimol. Se o microorganismo utilizar citrato como fonte de carbono, apresentará como produto amônia o que alcaliniza o meio.
	Citrato
	+ (azul)
	- (verde)
		Nossa amostra de fezes apresentava o seguinte perfil:
E.coli
	TSI
	LIA
	Citrato
	Lactose +
	 +
	 -
	Glicose +
	H2S -
	
	Gás + 
	
	
	H2S -
	
	
Para a maioria das infecções intestinais não se realiza antibiótico terapia, pois são doenças autolimintantes e o necessário é repor a microbiota. Uma exceção é no caso da infecção por Shigella, a qual é muito invasiva.
PRÁTICA 5 – URINOCULTURA:
Para se descobri se a bactéria entérica é a causadora ou contaminante da amostra de urina, realiza-se a urinocultura quantitativa.
Os sintomas que normalmente estão presentes na infecção urinária são disúria, poliúrica e febrícula. Por vezes a urina pode estar turva, mas se tal turvação for bacteriana, isso equivale a 107 bactérias/mL. No entanto, outros fatores podem levar a turvaçãoda urina como a grande ingestão de fosfato e a presença de células epiteliais.
Na urinocultura se avalia a piúria, que é a presença de piócitos na urina e a quantificação das bactérias presentes, por isso urinocultura quantitativa.
A coleta pode ser feita por micção espontânea, via cateter (em pacientes hospitalizados) ou punção supra púbica (neonatos). Na micção espontânea é muito importante à antissepsia da região genital e de períneo a fim de evitar contaminação com a microbiota, e com esta mesma finalidade, se despreza o primeiro jato e colhe-se a urina. Para mulheres é interessante que se abram os grandes lábios e encoste o frasco próximo à uretra, isso se justifica pelo fato que a urina escorre pela vagina e períneo antes de cair no frasco, o que pode contaminar.
A amostra de urina colhida deve ser levada ao laboratório de análises clínicas o mais rápido possível, pois a E.coli é o principal contaminante, e pelo fato de seu tempo de geração ser de 12 minutos, um demora no início da análise pode levar a um erro de diagnóstico.
A cultura quantitativa consiste em diluição da amostra de urina e seu plaqueamento. Utilizando 2 tubos de salina contendo 9,9 mL, recolhe-se 0,1mL de amostra de urina e dilui-se no primeiro tubo, deste primeiro tubo se retira 0,1 mL e dilui-se no segundo tubo. Com isso no primeiro tubo teremos uma diluição 1:100 e no segundo 1:10.000.
O cálculo do numero de bactérias se dá pela seguinte equação:
Nº colônias x diluição x volume = nº de bactéria UFC
	A nossa amostra apresentou 21 colônias na placa 1: 10.000, e segundo a equação acima temos:
	21 x 104 x 10 = 2,1. 106 UFC.
Para que seja definida a infecção urinária o paciente deve apresentar uma contagem acima de 105 UFC, portanto, essa amostra de urina corresponde a um paciente com infecção.
	Quanto aos testes bioquímicos a amostra de urina apresentou o seguinte perfil:
E.coli
	TSI
	LIA
	Citrato
	Lactose +
	 +
	 -
	Glicose +
	H2S -
	
	Gás + 
	
	
	H2S -
	
	
PRÁTICA 6 - ANTIBIOGRAMA:
O Antibiograma é o teste padrão mais importante, o qual não pode ser liberado com resultado errado ou duvidoso.
Apresenta o seguinte tripé:
Meio de cultura utilizado é o Ágar Muller Hinton, o qual possui pH ideal, tamponamento ideal, não pode ser deixado mais de 15 min na autoclave, deve ser bem dissolvido, pois uma má dissolução interfere na absorção do fármaco pelo meio, bem como na introdução do inóculo.
Inóculo deve apresentar 108 UFC, segundo a escala de Mcfar (0,5), pois se for maior ou menor pode induzir um falso resultado de resistência ou sensibilidade, respectivamente.
Discos de antibióticos devem estar íntegros, na validade e bem conservados.
A semeadura do inóculo para um antibiograma deve ser convergente em toda a placa, e não por esgotamento, pois se a semeadura não for convergente há interferência no resultado. Caso de semeadura com pouco inóculo promove um halo de inibição maior, enquanto que semeadura com muito inóculo promove um halo de inibição menor.
Diferentes tamanhos de halos podem ser encontrados em uma mesma placa com semeadura correta, isso se deve ao fato que diferentes antimicrobianos difundem-se de maneira diferente, apresentando maior ou menor halo. Para tanto deve-se medir o halo de inibição e verificar tamanho do diâmetro com a tabela a fim de verificar se esse valor equivale a resistência ou sensibilidade.
Resultados atípicos que podem interferir:
Crescimento invasivo - não é possível distinguir o halo, como acontece com Proteus.
Colônias dentro da zona de inibição – pode ter duas causas, ou mistura de cepas ou contaminação. No entanto, o antibiograma é realizado a partir de culturas puras, logo só pode ser mistura de cepas provenientes de mutações que levaram a resistência. Nesse caso mede-se apenas o raio a partir da colônia mais interna e multiplica-o por 2.
Superexposição da zona de inibição – halos de 2 ou mais antimicrobianos se tocam, levando a um efeito sinérgico, o que aumenta o halo.
Semeadura diferente – com menos inóculo em alguns pontos que outros, os halos são menores do que deveria ser.