RESUMO VIROL PRÁTICA

Prévia do material em texto

RESUMO VIROL PRÁ TICÁ 
I. USO DO HOSPEDEIRO EM VIROLOGIA 
Os sistemas hospedeiros são usados para a confirmação da etiologia da doença devido a complicações. 
São utilizados para diferenciação de quadros clínicos semelhantes, ou quando terapêuticas diferentes são 
usadas para doenças com mesma sintomatologia. Também são aplicados em estudos epidemiológicos para 
identificação de novos sorotipos circulantes em surtos e epidemias. 
Os parâmetros de diagnósticos são: isolamento e identificação, sorologia, detecção direta da partícula 
viral, e testes moleculares. O material a ser utilizado depende o sítio de infecção. Nem sempre o vírus pode 
estar na circulação sistêmica, o que pode levar a resultados falsos negativos. 
Para o isolamento em sistemas hospedeiros deve-se realizar a coleta do material a ser usado, a qual 
deve obedecer a alguns critérios: 
 Tempo em relação ao surgimento da doença: deve-se coletar o material na fase aguda ainda, 
pois a mesma coincide com o inicio dos sintomas e a replicação do vírus. 
 Sitio de coleta: deve ser adequado aos sintomas e ao quadro clinico e depende do tropismo de 
vírus. 
 
Sítio de coleta Espécime clínico 
Trato 
respiratório 
Secreções nasais e de orofaringe, aspirado de 
nasofaringe, escarro. 
TGI Fezes. 
Trato genital Secreções genitais. 
Conjuntiva Impressão córnea. 
SNC LCR 
Sistêmica Sangue 
Pele Biópsia, raspado de lesão, líquido de 
vesículas. 
 
 
 Qualidade da coleta: deve ser realizada o mais cuidadosamente possível a fim de evitar a 
contaminação com outras lesões ou com microbiota. 
 Tempo antes do processamento: deve ser adequado as características físico-químicas do vírus, 
devendo ser escolhida a melhor forma de transporte e armazenamento. 
O material deve ser transportado em meio de transporte, o qual estabiliza a partícula viral, sendo esta 
envelopada ou não. Para amostras com partículas envelopadas, ou com suspeita de serem envelopadas, 
não se deve congelar a amostra. É ideal que a entrega da amostra ao laboratório de análises sejam 
imediata. Se a coleta do material aconteceu em até 24 horas a amostra deve ser conservada em gelo até 
chegar ao laboratório. Caso o tempo para início da análise seja maior que 24 horas, deve congelar a 
amostra e armazenar em refrigerador -70ºC, sabendo do risco de perda da amostra. 
A descontaminação é realizada utilizando antibióticos e antifúngicos a fim de evitar interferências. A 
clarificação é realizada com centrifugação para retirada de restos celulares e metabólitos, colhendo o 
sobrenadante, onde estão presentes as partículas virais. 
A amostra deve conter a identificação do paciente, a descrição do material colhido e o tempo de 
coleta após inicio dos sintomas, o que é importante na decisão da utilização de testes sorológicos ou 
moleculares. 
Os materiais de TGI, do trato genital 
e de pele devem ser bem 
processados a fim de evitar a 
presença de outros 
microorganismos, evitando a 
presença de resultados falsos 
positivos. 
No sangue se realiza a sorologia e 
não a pesquisa da partícula viral. 
O diagnóstico clássico consiste no isolamento da partícula viral em cultura de células, em ovos 
embrionados ou em animais de laboratório. Na cultura de células se observa o efeito citopático (CPE) das 
células infectadas pelos vírus. Para confirmação da identificação do vírus se realiza IF ou sorologia pareada. 
Já o diagnóstico rápido é feito através de IF, ELISA e PCR. 
A escolha dos sistemas hospedeiros é feita conforme o vírus, podendo ser cultura de células, ovos 
embrionados ou animais de laboratório, onde a cultura de células é o método mais utilizado. A finalidade 
do uso de sistemas hospedeiros é a amplificação das partículas virais e também de vírus que não foram 
considerados ou identificados. 
Alguns sistemas hospedeiros não estão disponíveis, os animais de laboratório estão sobre rigoroso 
controle de uso pelas CEUAs, os ovos embrionados são caros, demoram e de inoculação difícil, portanto, a 
utilização de cultura de células é mais simples e barata. Ainda assim a amplificação é demorada e atrapalha 
o diagnóstico, e há vírus que não se propagam em nenhum desses sistemas, devendo ser identificados 
diretamente do espécime clínico. O modelo animal é mais utilizado em produção de vacinas e soros e no 
desenvolvimento de antivirais. 
No modelo animal a inoculação das partículas virais pode ser natural por inalação ou ingestão, ou por 
meios experimentais com a injeção diretamente no sítio de infecção, que se sabe que o vírus apresenta 
tropismo. A evidenciação da propagação viral se dá pela observação do animal, se o mesmo se alimenta se 
apresenta comportamento característico, se apresenta paralisia, se morreu. 
A utilização de ovos embrionários é, principalmente, para o isolamento de vírus aviários, como o 
Influenza, além do emprego na produção de vacinas. O embrião deve ter idade entre 9 e 11 dias, pois se 
mais jovem corre risco de morte e se mais velho, apresenta maior resistência. Utiliza-se o ovoscópio para 
avaliação da viabilidade do ovo. O local de inoculação depende do vírus. 
 
 Como evidências da replicação viral nos ovos embrionados temos alterações fenotípicas, como bolhas, 
alterações do embrião, hemaglutinação. 
O teste da hemaglutinação pode ser cruzado com a sintomatologia a fim de obter um diagnóstico mais 
preciso. Na hemaglutinação, as partículas virais são adicionadas em cultura de hemácias, se o vírus 
apresentar hemaglutininas as hemácias serão lisadas, mas se não apresentar hemaglutininas as hemácias 
se depositam e o vírus fica em suspenção. 
 
 O estabelecimento de cultura de células se tornou possível graças às técnicas assépticas 
cirúrgicas, a descoberta dos antibióticos e dos meios de cultura. A cultura de células é sistema econômico e 
fácil que fornece as preparações virais com títulos elevados, pois não apresentam ação do sistema imune, 
permitindo o estudo da biologia molecular do vírus, e a avaliação da permissividade e velocidade de 
replicação viral. A velocidade da replicação viral é mensurada pela ausência de replicação e pelo tempo que 
leva para realizar CPE. 
A aderência das células na garrafa depende se essas são aderentes ou não, estando relacionadas com 
diferentes tipos de cultivo. 
 Cultivo primário: as células são retiradas diretamente de tecidos para a cultura, são culturas 
finitas, usadas para a produção de vacinas. São culturas finitas, pois há decréscimo de viabilidade conforme 
as passagens. 
 Secundária: as células são subcultivadas, apresentando maior viabilidade, mesmo após 5 a 20 
passagens. Podem ser: 
o Diploides ou finitas: células normais de um tipo celular. 
o Heteroplóides ou infinitas: são células com aneuploidia, podendo ser tumorais, 
transformadas por oncogenes ou por agentes químicos. São células que apresentam grandes alterações 
fisiológicas e morfológicas. 
 
 
II. DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO DAS INFECÇÕES VIRAIS 
 
Após o isolamento da partícula viral, para confirmação da identificação do vírus, podemos realizar a 
sorologia pareada, que consiste nos testes de neutralização e de inibição da hemaglutinação. A sorologia 
pareada é mais usada que o isolamento em sistemas hospedeiros, pois os anticorpos perduram por bastante 
tempo após a infecção. 
A finalidade da sorologia pareada é a confirmação da suspeita clínica de enfermidade viral, com o 
isolamento do soro do paciente para realização da sorologia. A sorologia pode ser usada para identificar os 
vírus isolados em cultura de células, sendo muito importante nos casos em que o isolamento do vírus é 
dificultado. A sorologia é importante pata a determinação do estado do sistema imune, identificando 
infecções prévias e atuais.A sorologia pareada baseia-se no principio de que a maioria das infecções geram anticorpos 
específicos, além de células de memória que permitem a identificação de infecções prévias. É uma técnica 
que é restrita quando se trata de reações cruzadas, podendo gerar resultados equivocados. 
A coleta do material para a sorologia pareada acontece em duas fases: 
 Coleta do soro na fase aguda para identificação de IgM. 
 Coleta do soro na fase convalescente pata detecção de IgG. 
Se a relação entre os títulos de anticorpos entre as duas fases por de 4 vezes, há o indício da soroconverção 
de IgM em IgG. 
 
A. TESTE DE NEUTRALIZAÇÃO (TN): 
É baseado na neutralização da infecção viral por anticorpos presentes no soro do paciente, utilizando 
cultura de células como revelador, a fim de detectar ou não CPE. Utiliza anticorpos do soro do paciente em 
cultura de célula contendo o vírus suspeito em concentração conhecida. Se o paciente apresentar anticorpos 
para esse vírus, haverá a formação de imunocomplexos e o vírus não poderá causar CPE nas células da 
cultura. Em suma um TN positivo é aquele que apresenta CPE negativo, enquanto que um TN negativo 
apresenta CPE positivo. Antes do soro do paciente ser adicionado a cultura de células contendo as partículas 
virais, deve haver uma inativação desse, pois se proteínas do sistema complemento estiverem presentes, 
poderá haver lise das células da cultura. A inativação acontece em banho maria a 56ºC de 15-30 minutos. O 
soro coletado na fase aguda não é tratado na hora, é tratado apenas após a coleta do soro de fase 
convalescente, a fim de trata-los juntos e evitar possíveis erros. 
O teste requer o soro de fase aguda (SFA) + soro de fase convalescente (SFC) + cultura de células com 
o vírus apenas (controle + de CPE) + cultura de células sem o vírus (controle – do CPE) + cultura de células 
com vírus que receberá SFA e SFC. Deve-se conhecer a concentração da suspensão viral a ser adicionada na 
cultura de células. 
Nesse teste não há quantificação dos anticorpos, mas pode-se conhecer os títulos desses através de 
diluições seriadas de SFA e SFC, observando até qual diluição há neutralização viral e ausência de CPE. 
Em geral, nas diluições mais concentradas há CPE negativo. 
Os títulos de anticorpos são determinados pelo inverso da ultima concentração em que não houve 
CPE. Os títulos serão maiores no SFC. 
Se a diferença nos títulos de SFC E SFA for maior ou igual a 4 vezes significa que houve conversão 
sorológica, o que representa infecção recente. Se não houve conversão sorológica, o que implica em SFA e 
SFC com mesmos títulos, significa que a infecção é passada e que a sintomatologia não corresponde ao vírus 
pesquisado. Se o título de SFA for menor que 10 e de SFC for 10, deve-se refazer o teste com diluições 
menores que 1:10 a fim de observar se a infecção é recente. Se os títulos de SFC e SFA estiverem menores 
do que 10 e com presença de CPE em ambos, isso é sinal de que o indivíduo é susceptível. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CPE negativo 
CPE positivo 
 
B. TESTE DE INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO (HI): 
 
É um teste baseado na capacidade de hemaglutinação dos vírus, utilizando anticorpos 
específicos presentes no soro do paciente a fim de detectar a inibição da hemaglutinação, em função da 
neutralização do vírus. Se o anticorpo neutraliza o vírus, há inibição da hemaglutinação, se o anticorpo 
não neutraliza há hemaglutinação. É empregado para detecção de vírus que não causam CPE. 
São requisitos do teste: soro do paciente + partículas virais em concentração conhecida + 
cultura de hemácias com o vírus (controle positivo de hemaglutinação) + cultura de hemácias sem o 
vírus (controle negativo de hemaglutinação). 
Se após a adição do soro do paciente a cultura de hemácias com o vírus, e a mesma 
apresentou lise significa que houve hemaglutinação e o paciente não apresenta anticorpos contra 
aquele vírus. Hemaglutinação positiva, inibição da hemaglutinação negativa. Mas se após a adição do 
soro do paciente as hemácias se depositaram (ao contrário de tornaram o poço completamente 
vermelho, como acontece quando há hemaglutinação) há inibição da hemaglutinação, significando que 
o paciente apresentava anticorpos que neutralizaram aquele vírus. Hemaglutinação negativa, inibição 
da hemaglutinação positiva. 
Rotavírus, Influenza, Parainfluenza, Vírus da Rubéola, Vírus da Dengue e Parvovírus são vírus 
que apresentam hemaglutininas, e a presença de hemaglutininas que lisarão as hemácias, faz com o que 
haja redução do hematócrito. 
Devem ser retiradas do SFA e SFC as hemaglutininas inespecíficas, bem como inibidores 
inespecíficos de aglutinação, usando Caolin 25%. Dilui-se a cultura de hemácias em diversas 
concentrações, adicionando sobre cada concentração a partícula viral. A ultima diluição que apresentar 
aglutinação apresentará 1 unidade aglutinante (UHA). A partir dessa concentração em que há 1UHA, na 
diluição 2x mais concentrada haverá 2UHA e por ai vai. 
De modo semelhante ao TN o título de anticorpos é dado pelo inverso da ultima concentração 
em que houve inibição da hemaglutinação. 
 
Diluição da suspenção viral nas concentrações da imagem, com aglutinação até 1:64, diluição esta que 
apresenta 1UHA. Cada vírus tem uma concentração ideal para gerar hemaglutinação, o vírus da rubéola é de 
4UHA e os demais da lista acima é de 8UHA. 
 
CSFA e CSFC são os controle positivos de inibição, bem como CH, enquanto que CV é controle negativo de 
inibição. 
 
Houve soroconversão  infecção recente 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
III. SOROLOGIA HEPATITE B e D