Resumão Viro

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RETROVIRIDAE- vírus da Anemia Infecciosa Eqüina.
Os retrovírus possuem vírions envelopados e apresentam duas moléculas idênticas de RNA de fita
simples linear como genoma. Os membros dessa família são assim denominados por possuírem uma enzima capaz de sintetizar uma molécula de DNA pela transcrição do seu genoma, mecanismo chamado de transcrição reversa. A enzima que cataliza esta reação – a transcriptase reversa (RT) – é um componente dos vírions e possui, ainda, outras atividades essenciais para a replicação viral. A etapa de transcrição reversa se constitui no evento central da multiplicação dos retrovírus. O ciclo replicativo dos retrovírus envolve também uma etapa de integração da cópia DNA do seu ácido nucléico no genoma da célula hospedeira, etapa essencial para a expressão gênica e para a produção de progênie viral. Esse evento faz com que as infecções pelos retrovírus assumam um caráter persistente, ou seja, uma vez infectados, os hospedeiros se tornam portadores do agente pelo resto da vida.
A anemia infecciosa eqüina (EIA) é uma doença infecciosa potencialmente fatal que afeta os eqüídeos. O EIAV (equine infectious anemia virus) é mais um membro do gênero Lentivirus. A infecção pelo EIAV apresenta distribuição mundial, com maior ocorrência em áreas tropicais ou subtropicais pantanosas e que apresentam populações numerosas de vetores artrópodes – moscas, tabanídeos e mosquitos. A principal forma de transmissão é pela picada de insetos hematófagos -sobretudo tabanídeos – que exercem o papel de vetores mecânicos, carreando o vírus na probóscide. A transmissão é mais freqüente em áreas de grande infestação de insetos e com grande concentração de animais. A picada dos insetos estimula um refl exo defensivo dos animais, o que freqüentemente resulta na interrupção do repasto sangüíneo. Acredita-se que a maioria dos animais infectados apresente uma infecção subclínica, tornando-se portadores assintomáticos do agente. Em cavalos infectados experimentalmente, observa-se o estabelecimento de uma infecção persistente, geralmente acompanhada por episódios de viremia, febre e anemia. Além das manifestações supracitadas, os animais podem apresentar glomerulonefrite, linfoadenopatia e infiltração de macrófagos e linfócitos no fígado e em outros órgãos. A exemplo dos outros retrovírus, a infecção pelo EIAV é persistente, ou seja, os animais infectados tornam-se portadores do agente por toda a vida. Na forma crônica, os episódios de febre podem ocorrer a intervalos variáveis, entre os quais a temperatura volta a valores normais. Quadros recorrentes de depressão e letargia, petéquias nas mucosas, emagrecimento progressivo, edema nas partes baixas e anemia estão freqüentemente associados com a infecção crônica. A resposta mediada por linfócitos T citotóxicos específicos para epitopos das proteínas do capsídeo e das glicoproteínas do envelope viral seria a principal responsável pela manutenção do estado assintomático em animais portadores. As manifestações clínicas de hipertermia, anemia, depressão e letargia recorrentes, em áreas endêmicas para o agente são sugestivas da infecção pelo EIAV e devem ser investigadas. A detecção de anticorpos é o método laboratorial mais empregado para o diagnóstico da anemia infecciosa eqüina. O teste sorológico mais utilizado – e considerado o teste-padrão – é a IDGA, também conhecido como teste de Coggins. Esse é o teste recomendado pelo Ministério da Agricultura de vários países. A suspeita clínica também pode ser confirmada por outros testes laboratoriais, como fixação do complemento, inibição da hemaglutinação (HI), IFA e ELISA. O teste de IDGA se constitui em um teste simples, com boa especificidade (baixa sensibilidade), que pode ser utilizado para a confirmação da suspeita clínica, mas que possui aplicação mais importante no monitoramento de rebanhos e da condição sanitária de animais submetidos a transporte, comércio, importação/exportação. No Brasil, laboratórios e técnicos interessados em realizar o teste devem ser cadastrados no Ministério da Agricultura e ser submetidos a treinamento específico. Somente técnicos e laboratórios cadastrados são legalmente licenciados para a realização do teste e emissão do laudo.
PARAMYXOVIRIDAE- vírus da Cinomose.
A família é formada por vírus envelopados, em sua maioria esféricos, com projeções glicoprotéicas de superfície. Os vírions possuem um nucleocapsídeo helicoidal que envolve o genoma de RNA fita simples e polaridade negativa.
Ciclo replicativo da família: 1) Ligação aos receptores; 2) Penetração por fusão do envelope viral com a membrana plasmática; 3) Transcrição dos mRNA pelo complexo polimerase; 4) Tradução das proteínas virais pelos ribossomos celulares; 5) Síntese de RNA antigenômico e replicação do RNA genômico pelo complexo polimerase; 6) Processamento e transporte das proteínas do envelope e inserção na membrana plasmática; 7) Morfogênese; 8) Egresso.
A infecção pelo vírus da cinomose (CDV) ocorre em canídeos domésticos e selvagens. O CDV é um membro do gênero Morbillivirus. A infecção pelo CDV é enzoótica no mundo inteiro, com a doença ocorrendo com maior freqüência em cães jovens não-vacinados. Falhas vacinais, associadas com esquemas de vacinação inadequados ou mesmo com vacinas comerciais de baixa qualidade, podem resultar na ocorrência de doença mesmo em cães vacinados O contato direto com as secreções nasais, orais e urina de animais infectados se constitui na principal forma de transmissão do CDV. O CDV penetra geralmente pela via oronasal e replica inicialmente nos epitélios e em macrófagos das vias aéreas superiores, faringe e tonsilas. A replicação primária é seguida de viremia que permite a disseminação sistêmica do vírus e infecção de uma variedade de linfonodos e acúmulos linfóides, levando a um quadro de imunossupressão. Em cães que não conseguem montar uma resposta imune eficiente, o vírus produz uma viremia secundária, dissemina-se e replica em vários tecidos, incluindo células epiteliais da pele, dos tratos digestivo, respiratório e urinário, no sistema nervoso central (SNC) e no sistema retículoendotelial. Esses animais podem apresentar uma variedade de manifestações clínicas, relacionadas com os órgãos e tecidos afetados.Aincapacidade de erradicar o vírus pode resultar em persistência viral no SNC. A ocorrência de lesões cutâneas e doença respiratória em cães jovens, associadas ou não com sinais neurológicos, são sugestivos de cinomose. Uma linfopenia pode estar presente no hemograma de animais doentes. O diagnóstico laboratorial pode ser realizado pela detecção de antígenos do CDV em esfregaços de células da conjuntiva ou de fossas nasais, na capa flogística e no sedimento urinário pelas técnicas de IFA e IPX ou, ainda, pela detecção do genoma viral nessas amostras por RT-PCR. Kits de ELISA, para detecção de IgM, têm sido utilizados em clínicas, e o resultado positivo é indicativo de infecção presente ou recente. A vacinação com cepas atenuadas do CDV, em formulações mono ou polivalentes, é a estratégia mais utilizada no combate a cinomose. As pessoas envolvidas nos cuidados ambulatoriais com animais doentes devem utilizar medidas de proteção (luvas descartáveis, esterilização e descarte de fômites, higiene pessoal e do ambiente com desinfetantes), associadas com o isolamento dos animais, prevenindo a disseminação
da enfermidade no ambiente residencial e nosocomial.
HERPESVIRIDAE- vírus da Pseudorraiva Suína.
Uma propriedade muito importante apresentada por, virtualmente, todos os herpesvírus é a capacidade de causarem infecções inaparentes ou latentes. Assim, uma vez infectado por um herpesvírus, o hospedeiro permanece portador do vírus na forma latente. A latência é caracterizada pela ausência de replicação viral e de sinais clínicos, e dura toda a vida do hospedeiro. Durante esse período, o animal pode não apresentar sinais clínicos e raramente excreta o vírus. No entanto, a infecção latente pode ser ocasionalmente reativada por situações de estresse, ocasiõesem que o vírus é re-excretado pelo hospedeiro e pode se disseminar para indivíduos susceptíveis. Os herpesvírus estão amplamente distribuídos na natureza e nas espécies animais. Os vírions dos herpesvírus consistem de um núcleo contendo uma molécula de DNA de fita dupla linear; um capsídeo icosaédrico; uma camada protéica amorfa, chamada tegumento, que recobre o capsídeo; e um envelope lipoprotéico contendo espículas de glicoproteínas na sua superfície. As partículas não possuem uma forma bem definida. A síntese do DNA viral e a montagem do capsídeo ocorrem no núcleo da célula hospedeira. A aquisição do envelope viral ocorre durante o trânsito dos nucleocapsídeos através da membrana nuclear ou através de organelas citoplasmáticas envelopadas. Também são capazes de permanecer latentes nos seus hospedeiros naturais. Nas células infectadas de forma latente, os genomas virais se mantêm na forma circular epissomal, ocorrendo pouca ou nenhuma expressão gênica. Esses genomas retêm a capacidade de replicar, o que ocorre por ocasião da reativação da infecção latente. Os herpesvírus são vírus facilmente inativados por álcoois e detergentes, em razão da presença do envelope lipoprotéico. 
Ciclo replicativo dos alfaherpesvírus: Após a ligação aos receptores, a penetração ocorre por fusão do envelope com a membrana plasmática na superfície celular. Os nucleocapsídeos são transportados ao longo dos microtúbulos até os poros nucleares, onde ocorre o desnudamento e a liberação do genoma no interior do núcleo. Segue-se a transcrição dos genes alfa que são traduzidos nas proteínas alfa, cuja função principal é ativar a transcrição dos genes beta. As proteínas beta estão envolvidas na síntese de nucleotídeos trifosfato e na replicação do genoma. Os genes gama somente são transcritos após a replicação do DNA e codificam principalmente proteínas estruturais. Parte dessas proteínas penetra no núcleo e forma pré-capsídeos, nos quais o genoma é introduzido. Os nucleocapsídeos adquirem o envelope por brotamento através da membrana nuclear interna. Podem perder o envelope ao atravessar a membrana nuclear externa e serem reenvelopados no aparelho de Golgi, ou são enviados em vesículas até o Golgi. Os vírions envelopados são transportados em vesículas do trans-Golgi até a superfície celular, onde são liberados por exocitose.
Herpesvírus suíno - A doença de Aujeszky – ou pseudoraiva – é causada pelo herpesvírus suíno tipo 1 (SuHV-1). O SuHV-1 pertence ao gênero Varicellovirus, da subfamília Alphaherpesvirinae, e possui um genoma DNA de fita dupla. Em regiões endêmicas, a doença de Aujeszky é considerada uma importante causa de perdas econômicas na suinocultura, relacionadas com as altas taxas de morbidade e mortalidade de leitões, redução da performance dos reprodutores e redução do desenvolvimento dos animais em crescimento e terminação. Os suínos são os hospedeiros naturais do SuHV-1, mas o vírus pode ser transmitido e causar doença grave em hospedeiros secundários (ruminantes, felinos, caninos e roedores). Os suínos que sobrevivem à infecção se tornam portadores subclínicos do vírus na sua forma latente. Os índices de morbidade e mortalidade, associados com a infecção, dependem da idade dos animais infectados e são mais altos em animais jovens. O vírus é transmitido por contato direto ou indireto de animais susceptíveis com secreções contaminadas ou animais infectados. Os animais excretam o vírus em secreções nasais e saliva por vários dias após serem infectados. O sêmen de machos contaminados e as secreções genitais e restos fetais de porcas que abortam também contêm o vírus e podem transmiti-lo. A replicação viral no SNC resulta em lesões progressivamente severas que levam a disfunções motoras e, eventualmente, à morte. Essas alterações são mais comuns em leitões com idade entre uma e duas semanas. A infecção, com determinadas cepas e em altas doses, freqüentemente resulta em infecção e doença pulmonar. Após a infecção aguda, tanto subclínica, quanto com sinais inespecíficos, neurológicos ou respiratórios, os animais permanecem portadores da infecção latente. Embora o vírus seja geneticamente pouco variável, podem ocorrer diferentes formas clínicas, relacionadas com o tropismo de diferentes amostras virais, que podem afetar primariamente os sistemas respiratório ou nervoso. Os achados de necropsia em suínos afetados, se presentes, são: congestão das meninges e aumento de volume do líquido céfalo-raquidiano, hemorragias, congestão ou focos necróticos nas amígdalas e laringe, rinite fibrinosa, edema pulmonar e consolidação dos lóbulos pulmonares anteriores. O diagnóstico laboratorial é realizado pela identificação do vírus em tecidos e/ou em secreções de suínos doentes. O diagnóstico rápido é feito usualmente por testes de IFA direta em tonsilas, pulmão, traquéia, baço, rins, fígado e cérebro. O isolamento do vírus pode ser realizado a partir dessas amostras. Em geral, as estratégias de combate são baseadas em uma combinação de vacinação, identificação e descarte de soropositivos, além de medidas gerais de prevenção.
	ORTHOMYXOVIRIDAE- vírus da Influenza nos animais domésticos.
Os ortomixovírus causam as infecções respiratórias de pessoas e animais conhecidas como gripe ou influenza. Os vírions dos ortomixovírus são grandes, pleomórficos, com envelope e contêm sete ou oito moléculas de RNA de polaridade negativa como genoma. A grande variabilidade antigênica, principalmente dos vírus humanos, constitui-se em um obstáculo quase intransponível para a produção de vacinas permanentes e de uso universal. Os hospedeiros naturais dos vírus da influenza são aves aquáticas e migratórias de várias espécies. Nesses animais, o vírus replica no intestino sem produzir sinais clínicos e é excretado em altos títulos nas fezes. 
Parte prática
Detecção direta por microscopia eletrônica
O método mais simples de detecção e identificação de vírus é a visualização direta das partículas na amostra. A ME possuiu grande aplicabilidade na pesquisa e identificação de vírus que não replicam
com eficiência em cultivo celular. A maior restrição da ME é a sua baixa sensibilidade. Amostras clínicas que contenham quantidade inferior a 106-107 partículas víricas por mililitros não são detectadas como positivas por essa técnica, gerando resultados falso-negativos. O custo elevado do equipamento e a exigência de técnicos altamente capacitados para a operação e interpretação dos resultados também representam limitações. A sensibilidade da ME pode ser aumentada
pelo uso de técnicas que permitam a concentração e facilitem a visualização das partículas víricas. A clarificação de amostras por centrifugação de baixa rotação é empregada para remover partículas
e substâncias que possam interferir na técnica. A ultracentrifugação é utilizada com o objetivo de concentrar as partículas virais. A aglutinação com soro hiperimune é rotineiramente utilizada
e denomina-se imunoeletromicroscopia. Nesta metodologia, utiliza-se um soro hiperimune específico contra o agente suspeito, cujos anticorpos irão se ligar e promover a concentração das
partículas, facilitando a visualização.
 
Hemaglutinação
Vários vírus possuem proteínas de superfície que se ligam a eritrócitos, provocando a sua
agregação e aglutinação, fenômeno denominado hemaglutinação (HA). A propriedade de aglutinar eritrócitos é restrita a algumas famílias de vírus (exemplos: ortomixovírus e paramixovírus) e, para cada um desses vírus, a HA ocorre apenas com eritrócitos de determinadas espécies animais. O teste é realizado pela incubação de uma suspensão de eritrócitos com o material suspeito (puro ou em diluições) em microplacas com fundo em “V” ou “U”. Após o período de incubação, a presença do agente hemaglutinante será indicada pela formação de uma rede difusa de eritrócitos no poço. Em amostras negativas (ausência do agente hemaglutinante), as hemácias não serão aglutinadas, irão rolar e se acumular no fundo da cavidade, formando um botão bem definido. Esse teste é defácil execução, porém falha em detectar quando quantidades pequenas de vírus. Outra restrição é que
a atividade hemaglutinante é uma propriedade restrita a algumas famílias de vírus, ou seja, a técnica
não possui aplicação universal. A atividade hemaglutinante pode ser inibida pela presença de anticorpos anti-hemaglutininas específicos. Os anticorpos específicos irão ligar-se à proteína hemaglutinante do vírus, impedindo a ligação desta com os eritrócitos. Dessa maneira, um método para se detectar e quantificar anticorpos antivirais no soro de animais foi desenvolvido e denomina-se inibição da hemaglutinação (HI). A técnica de HI pode ser utilizada tanto para a detecção de anticorpos antivirais como para a identificação de vírus hemaglutinantes. Após a detecção da atividade HA, a técnica de HI é realizada, utilizando-se um anti-soro específi co contra o vírus suspeito para confirmar o diagnóstico.
Imunofluorescência
É uma técnica de detecção de antígenos e baseia-se na reação de anticorpos específicos com o antígeno presente no material suspeito. Os anticorpos são conjugados com uma substância que emite luminosidade fluorescente (fl uoresceína) quando exposta à luz ultravioleta (UV). Geralmente, o material deve ser previamente fixado em etanol, metanol ou acetona. Após a fixação, incuba-se o material com o anticorpo específico marcado com o fluorocromo. Posteriormente, sucessivas lavagens são realizadas para a remoção do anticorpo não-ligado. O material é, então, examinado ao microscópio de luz UV. O resultado final é a observação de uma região ou de toda a célula
corada, pois as proteínas virais estão dispersas no seu interior. Existem basicamente duas variantes da técnica: a direta (IFD) e a indireta (IFI). Na IFD, o anticorpo primário específico para o agente é
marcado com o fluorocromo e adicionado diretamente sobre a amostra. No caso da IFI, a técnica é realizada em duas etapas. A primeira incubação é realizada com o anticorpo primário específico para os antígenos virais e, após a remoção dos anticorpos que não se ligaram aos antígenos, por sucessivas lavagens, adiciona-se o anticorpo secundário, marcado com o fluorocromo. O anticorpo secundário (específico para a espécie animal na qual foi produzido o anticorpo primário) reconhece e se liga ao anticorpo primário. A IFA é uma técnica simples e se constitui em uma das técnicas mais utilizadas em Virologia. Como desvantagens, incluem-se a necessidade de um microscópio de luz UV e a possibilidade de alguns tecidos ou células emitirem fluorescência natural, o que pode dificultar a interpretação do resultado.
 
Imunoperoxidase
A técnica de imunoperoxidase (IPX) baseiase no mesmo princípio da IFA, com a diferença que os anticorpos são marcados com uma enzima, que pode ser a horseradish peroxidase (HRPO ou peroxidase) ou a fosfatase alcalina (AP). Em tecidos, a técnica é chamada de imunohistoquímica. A metodologia é semelhante à IFA, existindo também a IPX direta e indireta. Na IPX direta, o material fixado é incubado com o anticorpo antiviral marcado com a enzima, seguido da lavagem e adição
do substrato. A presença do antígeno no material é revelada pela ação da enzima no substrato. A IPX indireta utiliza o anticorpo primário específico para o antígeno, e o anticorpo secundário é marcado com a enzima. Essa variação da técnica apresenta maior sensibilidade devido à amplificação do sinal. A técnica de IPX possui as mesmas aplicações da IFA, porém apresenta a vantagem de não necessitar do microscópio de luz UV, já que as reações podem ser visualizadas sob microscopia ótica comum.
 
Ensaio Imunoenzimático (ELISA)
Pode ser utilizado para a detecção de antígenos virais e também de anticorpos. É uma técnica que apresenta vantagens, tais como: a boa sensibilidade, especificidade, baixo custo, repetibilidade e versatilidade. animal. Os testes podem ser executados em a mostras individuais, como recurso diagnóstico em clínicas ou consultórios; ou em grande escala, como realizado em laboratórios totalmente automatizados. A técnica permite uma variação de formas e aplicações, dependendo do objetivo e da disponibilidade de reagentes. Basicamente, os testes de ELISA podem ser classificados em diretos, indiretos ou de competição. A técnica baseia-se na imobilização da reação antígeno-anticorpo em um suporte sólido (placas de poliestireno), seguida de uma reação colorimétrica. No ELISA de captura direto para detecção de antígenos virais, placas de 96 cavidades são recobertas com anticorpos específicos para um determinado agente. A amostra suspeita da presença viral (sangue, secreções ou leite) é adicionada e incubada por um determinado tempo. Nesse período, ocorre a captura do antígeno (amostras positivas) pelo anticorpo fixado na placa. Após essa etapa, são realizadas lavagens para a remoção de substâncias inespecíficas. A seguir adiciona-se um segundo anticorpo, específico para o vírus, conjugado com a enzima (HRPO ou AP). Novamente os anticorpos que não se ligaram são removidos por lavagens. A confirmação da presença do antígeno viral é evidenciada pela adição de substrato e desenvolvimento da coloração específica nas amostras negativas. A leitura é realizada pela inspeção visual ou pelo uso de fotocolorímetro.
Imunocromatografia
A imunocromatografi a é uma técnica de visualização simples, geralmente realizada em dispositivos plásticos, podendo ser executada em clínicas e ambulatórios. A prova é baseada na reação antígeno-anticorpo, em que a amostra suspeita (vírus ou antígenos virais) é passada através de um filtro e, então, impregnada em uma membrana, onde reagirá com o anticorpo específico previamente
imobilizado. A presença do antígeno é revelada pelo aparecimento de focos ou bandas coloridas, pois os reagentes são conjugados com substâncias cromógenas. O resultado depende essencialmente da qualidade dos reagentes. Um dos problemas do teste é o seu custo elevado. Vários testes diagnósticos são baseados nesse princípio.
Immunoblots 
O princípio dos imunoblots é semelhante ao da IPX. Os antígenos virais são detectados pelo uso de anticorpos marcados com enzimas, que agem no substrato, provocando mudança de cor. A diferença fundamental entre a IPX e os imunoblots é que o material suspeito deve ser previamente solubilizado e imobilizado em um suporte sólido, geralmente membranas de nitrocelulose ou nylon. A membrana é, então, incubada com o anticorpo antiviral não-marcado (anticorpo primário), seguido de lavagem e incubação com um anticorpo antiespécie do anticorpo primário (anticorpo secundário) conjugado a uma enzima. A presença do antígeno pesquisado é revelada pela adição do substrato, que muda de coloração pela ação da enzima. Substratos que emitem luminosidade capturável em filmes de raios X também têm sido utilizados e aumentam a sensibilidade da técnica. Existem duas variações principais dos imunoblots: os dot/slot blots e o Western blot (WB). No dot/slot blot, o homogenado de proteínas é diretamente imobilizado na membrana, em pontos (dots) ou fendas (slots), seguida pela detecção com os anticorpos. Essa variação da técnica é mais simples e rápida, porém não fornece informações acerca da massa da proteína detectada. No WB, as proteínas solubilizadas são separadas por eletroforese em um gel de poliacrilamida (SDSPAGE), transferidas para a membrana e, então, submetidas à detecção com os anticorpos marcados. Essa técnica permite a detecção da proteína e também a determinação de sua massa molecular, pelo padrão de migração no gel.
Técnicas de hibridização
 
A detecção de ácidos nucléicos virais pelo uso de sondas marcadas com isótopos radioativos
ou com enzimas tem sido muito utilizada em Virologia, tanto em diagnóstico como em pesquisa.
A técnica baseia-se na complementaridade das moléculas de DNA ou RNA. Inicialmente, escolhe-se a região-alvo do genoma a ser detectado, que deve ser um segmento conservado entre isolados de campo. A sonda deve ser sintetizada com base na seqüência de nucleotídeos da região-alvoe deve ser exatamente complementar a esta. Essa sonda pode ser um oligonucleotídeo sintético, um segmento de DNA inserido em um plasmídeo ou um produto de PCR. A sonda é, então, conjugada com um isótopo radioativo ou com uma enzima, para possibilitar a sua detecção. O material suspeito é imobilizado em uma membrana, seguido pela incubação com a sonda marcada e de lavagens para remover as sondas não-ligadas. Na presença do ácido nucléico do vírus suspeito, a sonda irá hibridizar com a seqüência-alvo. A presença da sonda revela-se pela exposição da membrana a um filme de raios X ou pela adição de substrato. Quando o ácido nucléico (DNA, RNA) é imobilizado diretamente na membrana, a técnica é denominada dot ou slot blot. A presença do ácido nucléico será demonstrada pelo aparecimento de uma marca ou borrão no local onde foi aplicado o material. Porém, se o material for previamente submetido à eletroforese, para a separação das moléculas de ácido nucléico de acordo com o tamanho, e então transferido para a membrana, a técnica denomina-se Southern blot (para DNA) ou Northern blot (para RNA). A reação positiva aparece na forma de bandas marcadas na membrana, correspondentes à migração do ácido nucléico durante a eletroforese. As técnicas de hibridização possuem boa sensibilidade e especifi cidade, e, quando implementadas na rotina do laboratório, permitem a obtenção dos resultados em poucos dias. Outra vantagem é que podem ser aplicadas a qualquer agente infeccioso, necessitando-se apenas de uma sonda específica. As restrições dessas técnicas referem-se à necessidade de pessoal especializado e à disponibilidade de reagentes.
 
PCR 
 
A reação da polimerase em cadeia (PCR) é uma técnica altamente específi ca e sensível, que consiste na síntese in vitro de uma grande quantidade de cópias de um segmento de DNA existente na amostra. Ou seja, consiste em amplificar o número de moléculas a partir de uma molécula-alvo original, denominada molde. Essa amplificação pode ser realizada a partir de uma quantidade mínima do ácido nucléico-alvo; uma PCR bem padronizada, teoricamente, é capaz de detectar e amplificar até uma única cópia do molde existente na amostra. A região-alvo a ser amplificada é delimitada por primers, que são oligonucleotídeos sintéticos. Esses primers hibridizam com suas regiões complementares, que se localizam nas cadeias opostas do DNA, nas regiões flanqueadoras da sequência alvo. Os primers são sintetizados de acordo com a seqüência a ser amplificada, e a sua especificidade depende do seu grau de conservação e complementaridade com a seqüência-alvo. A reação de PCR envolve a realização de vários ciclos (entre 30 e 40) de desnaturação (separação da fita dupla), hibridização dos primers e polimerização da cadeia de DNA a partir dos primers, pela enzima DNA polimerase. A cada ciclo o número de moléculas correspondentes à seqüência-alvo duplica e, no final da reação, acumulam-se milhões de cópias idênticas correspondentes à seqüência-alvo inicial. Essas moléculas, denominadas genericamente de produtos de PCR (ou amplicons), podem, então, ser detectadas visualmente em géis de agarose, corados com brometo de etídio, sob
luz UV. Os produtos de PCR podem também ter a sua identidade confirmada por hibridização
com sondas específicas. A grande difusão da PCR somente foi possível após a identificação de uma enzima polimerase de DNA resistente ao calor, o que levou à simplificação da técnica associado com o desenvolvimento de equipamentos cada vez mais acessíveis.
 Inoculação em ovos embrionados
Vários vírus de aves e alguns de mamíferos replicam com eficiência em tecidos de embrião de galinha. A habilidade desses vírus em se multiplicar nesse sistema biológico tem sido utilizada para a multiplicação de vírus em laboratório, seja para a detecção de vírus em material clínico, seja para a amplificação de vírus. Essa metodologia teve grande difusão antes do desenvolvimento e estabelecimento dos cultivos celulares, porém, nos dias atuais, está limitada a poucos vírus,
principalmente àqueles que não replicam em cultivos. O material pode ser inoculado por várias
vias, dependendo do agente suspeito. A presença do agente pode ser evidenciada pelo desenvolvimento de lesões macro e microscópicas características no embrião e/ou nas membranas vitelínica. Também se pode observar retardo no desenvolvimento e morte do embrião. A presença do agente – e a sua quantificação – também pode ser detectada pela pesquisa da atividade biológica do agente (HA), de antígenos (IFI) ou de ácidos nucléicos virais (hibridização, PCR).
Inoculação em animais susceptíveis
Durante muitos anos, a reprodução da doença em animais se constituiu na forma mais objetiva de detecção de vírus em material suspeito. A inoculação de animais também serviu para a amplificação do agente para diversos fins, entre eles a produção de vacinas. Os fatores limitantes para esse procedimento incluem o custo elevado de manutenção, a imunidade prévia dos animais ao agente e a baixa reprodutibilidade da enfermidade. Nos últimos anos, questões éticas referentes ao uso experimental de animais somaram-se a essas restrições. No princípio do século, os bovinos eram inoculados com o vírus da febre aftosa (FMDV) no epitélio lingual. Após o desenvolvimento de
vesículas, o fluido era coletado, inativado e utilizado para a produção de vacinas. A utilização de extratos de cérebro de camundongos infectados com o vírus da raiva (RabV), para a produção de vacinas, é outro exemplo da inoculação em animais. Com o desenvolvimento dos cultivos celulares, essa metodologia deixou de ser utilizada. Atualmente, a multiplicação de vírus pela inoculação de animais possui uso muito restrito, dentre os quais se destacam a prova biológica para o diagnóstico da raiva em camundongos lactentes. A inoculação de camundongos lactentes é ocasionalmente utilizada para o diagnóstico do FMDV. Para alguns vírus que não replicam eficientemente em cultivo celular, como o vírus da peste suína africana (ASFV), a inoculação de animais, para se obter altos títulos do vírus, é empregada.
Isolamento em cultivo celular (prova de ouro)
A propagação do agente em cultivo celular permite que quantidades mínimas de partículas víricas viáveis sejam detectadas, amplificadas e, posteriormente, caracterizadas. Para os vírus que replicam bem em células de cultivo, esse sistema biológico possui aplicações virtualmente ilimitadas, incluindo: a) isolamento e identificação com fins diagnósticos; b) obtenção de estoques virais para caracterização biológica e molecular; c) uso em testes sorológicos; d) produção de estoques virais para estudos de patogenia; e) produção de antígeno para a imunização de animais (produção de anti-soro ou anticorpos monoclonais); f) produção de vacinas, entre outros. Existem dois tipos principais de cultivos celulares: cultivos primários e as linhagens contínuas. Cada um desses tipos apresenta vantagens e restrições. Os cultivos primários originam-se da remoção de um órgão fresco de um embrião ou feto recém-sacrificado. O órgão removido é submetido a um processo mecânico e enzimático para fracionamento do tecido e individualização das células. As células individualizadas são cultivadas em frascos ou garrafas, onde irão aderir e formar uma monocamada. O cultivo é realizado com meio nutritivo e promotores de crescimento, a temperatura de incubação é de 37ºC. Nesse processo, a divisão celular é bastante restrita, com uma propagação lenta e limitada, podendo-se dizer que ocorre uma divisão celular a cada 24 horas. Assim, é necessária a realização de subcultivos periódicos, e isso é realizado através da individualização da monocamada pela ação enzimática, ressuspensão e semeadura em novos frascos de cultivo. Nesses novos cultivos, o número celular irá duplicar ou quadruplicar em poucos dias. Após um número variável de subcultivos (10 a 30 passagens, dependendo do tipo celular), as células começam a apresentar taxas reduzidas de multiplicação e, eventualmente, cessam a multiplicação.Os cultivos primários são os preferidos para a realização da multiplicação viral, pois possuem características morfológicas e fisiológicas bastante semelhante às células dos órgãos originais. Sendo assim, possuem uma maior sensibilidade para a infecção viral. A restrição que esse tipo de cultivo apresenta é o número limitado de subcultivos, gerando necessidade de preparação contínua nos laboratórios com alta demanda celular. As linhagens celulares ou linhagens contínuas são derivadas de células tumorais ou de tecidos normais que sofreram transformação in vitro. Esses tipos de cultivos celulares são cultivados de maneira semelhante aos cultivos primários e possuem capacidade de multiplicação quase indefinida. Por estarem bem adaptadas às condições do cultivo, são de fácil manipulação e propagação. A maioria dos laboratórios dá preferência a esse tipo de cultivo celular devido à sua uniformidade, estabilidade e facilidade de manuseio. Por causa dessa alta taxa de propagação em laboratório, as linhas celulares podem sofrer alterações morfológicas e fisiológicas que alteram a sensibilidade à infecção viral. No entanto, a sensibilidade à infecção com alguns vírus pode ser inferior nas linhagens celulares em comparação com os cultivos primários, mas as vantagens citadas acima compensam este aspecto. Existem ainda cultivos de células que semultiplicam em suspensão, ou seja, não necessitam de uma superfície de contato para adesão e multiplicação. Uma grande vantagem desse tipo de cultivo é a concentração do número de células, reduzindo a relação do número de células, tamanho do frasco e volume de meio utilizado. Essa é uma característica desejável e amplamente utilizada para a produção de vacinas. O processamento de amostras que potencialmente contenham vírus deve ser realizado rapidamente e seguir algumas regras para aumentar a probabilidade de detecção e multiplicação do agente. Para o diagnóstico, as amostras devem ser inoculadas em cultivos celulares o mais brevemente possível. A inoculação consiste na deposição do material suspeito sobre as monocamadas, seguido de incubação por 1 a 2 horas (período de adsorção). Posteriormente, o inóculo é desprezado, e a monocamada é lavada para remover ou reduzir a presença de substâncias toxicas e/ou contaminação bacteriana e fúngica. Após, o meio de cultivo é reposto, e as células são incubadas a 37ºC, com uma atmosfera de 5% de CO2. As monocamadas devem ser observadas diariamente para a presença de alterações morfológicas celulares associadas com a replicação viral. Essas alterações, consequências do processo replicativo dos vírus, são denominadas genericamente de efeito citopático. Uma grande parcela dos vírus produz alterações morfológicas nos cultivos celulares, que, muitas vezes, são características de um determinado agente ou grupo de vírus. A visualização dessas alterações ao microscópio óptico é apenas um indicativo da presença de um agente viral na amostra suspeita. No entanto, ausência de alterações não indica necessariamente a ausência de vírus. Alguns vírus infectam as células sem causar ECP e são denominados de não-citopáticos,