POP gram

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ - UFPI 
CAMPUS SENADOR HELVÍDIO NUNES DE BARROS - CSHNB 
CURSO DE BACHARELADO EM ENFERMAGEM 
DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA (PRÁTICA) 
PROFA. THIALLY BRAGA GONÇALVES 
 
PRÁTICA 2 – MICROSCOPIA E COLORAÇÃO DE GRAM 
 
 
1. PRINCÍPIO 
 
Torna-se necessário fixar e corar as bactérias para o estudo exato da sua morfologia e citologia. 
Com efeito, o tamanho dos detalhes estruturais, a falta de contraste natural destes detalhes e o 
movimento das bactérias aliado à sua grande refringência, tornam impossível o estudo morfológico 
exato destes organismos nos simples exames a fresco. A fixação é a coagulação do protoplasma 
bacteriano e a sua colagem às lâminas, com o mínimo de deformação, quer dizer, imobilização dos 
microrganismos e das estruturas celulares. São agentes fixadores o calor, atuando em escala 
moderada, os vapores de ácido ósmico, o formol, o éter, os sais de mercúrio, etc. 
Os corantes são substâncias dotadas de cor própria e que uma vez dissolvidas comunicam essa 
cor às estruturas com as quais são postas em contato. Os corantes usados em microbiologia são 
produtos artificiais ou sintéticos. Os corantes são sais e podem ser classificados em corantes ácidos 
e básicos. Os corantes básicos são corantes de eleição da Bacteriologia uma vez que as bactérias 
possuem carga elétrica negativa. Deste modo, a afinidade eletroquímica torna possível a fixação do 
radical corado sobre as estruturas celulares das bactérias, o que não sucede com os corantes ácidos 
cujo radical corado é eletronegativo. 
Os mordentes são substâncias que reforçam a ação dos corantes, são principalmente usados 
como mordentes em Bacteriologia, o ácido tânico, o ácido crómico, o ácido fênico, o iodo (Soluto 
de Lugol), o calor, os álcalis; estas substâncias aumentam a energia de fixação das cores sobre as 
estruturas celulares. 
A coloração pelo método de Gram é chamada de coloração diferencial porque são utilizados dois 
corantes e as bactérias ficam coradas em tonalidades diferentes. Isso é possível devido à 
composição da parede celular das mesmas. Muitas são patogênicas e outras, membros da microbiota 
normal do corpo humano. A maioria dos cocos são Gram-positivos com exceção dos gêneros 
Neisseria e Veillonella que são os únicos Gram-negativos; entre os bacilos Gram-positivos incluem-
se aqueles pertencentes aos gêneros Corynebacterium, Listeria, Bacillus, Lactobacillus e 
Clostridium; os demais bacilos são Gram-negativos (a maioria); os víbrios são Gram-negativos. A 
investigação das características morfológicas e de coloração (morfo-tintoriais) das bactérias é etapa 
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inicial de grande importância no isolamento e identificação de bactérias de material clínico bem 
como de alimentos. No entanto, a identificação completa de uma bactéria sempre necessitará de 
dados fisiológicos ou genéticos da mesma. 
O mecanismo da coloração de Gram se refere à composição da parede celular, sendo que as G+ 
possuem uma espessa camada de peptideoglicano e ácido teicóico, e as G-, uma fina camada de 
peptideoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta por lipoproteínas, fosfolipídeos, 
proteínas e lipopolissacarídeos. Durante o processo de coloração, o tratamento com álcool (ou 
ácool-acetona) extrai os lipídeos, daí resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da 
parede celular das G-. Assim, o complexo cristal violeta-iodo (CV-I) pode ser retirado e as G- são 
descoradas. A parede celular das bactérias G+, em virtude de sua composição diferente, torna-se 
desidratada durante o tratamento com álcool, a porosidade diminui, a permeabilidade é reduzida e o 
complexo CV-I não pode ser extraído. Outra explicação baseia-se também em diferenças de 
permeabilidade entre os dois grupos de bactérias. Nas bactérias G+, o complexo CV-I é retido na 
parede após o tratamento pelo álcool, o que causa, provavelmente, uma diminuição do diâmetro dos 
poros da camada de glicopeptídeo ou peptideoglicano da parede celular. Os poros da parede das 
bactérias G- permanecem suficientemente grandes, mesmo depois do tratamento pelo álcool, 
possibilitando a extração do complexo CV-I. 
 
2. MATERIAL UTILIZADO 
 
 Lâminas; 
 Culturas em meios sólido; 
 Alça de platina; 
 Cristal violeta; 
 Lugol; 
 Álcool acetona; 
 Bico de Bunsen; 
 Isqueiro. 
 
3. PROCEDIMENTO 
 
1. Preparar um esfregaço: 
a) Com a alça de platina transferir uma pequena gota de água para a lamina; 
b) Flambar a alça corretamente; 
c) Esfriá-la no meio sólido (região sem colônias); 
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d) Coletar 1 colônia e transferir para a pequena gota de água na lâmina. Espalhar bem com 
movimentos suaves evitando a quebra dos agrupamentos bacterianos; 
e) Secar a temperatura ambiente; 
f) Após o esfregaço ficar completamente seco, com auxilio da pinça de madeira, fixá-lo na 
chama do bico de Bunsen, passando a lâmina 2 a 3 vezes pela chama; aguardar até o resfriamento 
da lâmina 
g) Realizar a coloração. 
 
2. Cobrir o esfregaço seco e fixado com a solução de cristal violeta (corante) durante 1 
Minuto. 
3. Esgotar a lâmina e cobrir com lugol (mordente) durante 1 minuto. 
4. Inclinar a lâmina 45° e lavar em água corrente; 
5. Mantendo-a inclinada, diferenciar (lavar) com álcool 95° GL ou álcool/acetona 
(diferenciador). 
6. Lavar e depois cobrir a preparação com solução diluída de fucsina (contracorante) (15 a 30 
segundos). 
7. Esperar secar. 
8. Colocar uma gota de óleo de cedro (imersão) no centro do esfregaço. 
9. Observar com a objetiva de imersão. 
 
OBS.:ATENÇÃO PARA NÃO COLOCAR A LÂMINA INVERTIDA!!!!!!!! 
 
 
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4. INTERPRETAÇÃO E EMISSÃO DO LAUDO 
 
Positivo: 
Descrever a morfologia e agrupamento dos microrganismos observados ou quantificar 
Ex: Cocos Gram positivos aos pares; 
 
 
 
Negativo: 
Não foram observados microrganismos coráveis pelo método de Gram. 
QUESTÕES PARA RELATÓRIO 
 
1. Descreva como são e do que se compõem as paredes das bactérias Gram-positivas e 
Gram-negativas. 
2. Faça um desenho esquemático de cada uma das bactérias que foram observadas em 
aula: 
 
 
 
 
 
 
 
 
3. Comente cada uma das etapas da coloração de Gram.