Western Blotting Aula Moacyr

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Western Blotting 
Prof. Moacyr Rêgo 
moacyr.rego@gmail.com 
Plano de Aula 
• Histórico 
• Aplicações 
• Eletroforese 
• Transferência 
• Bloqueio 
• Anticorpo Primário – 1 ou 2 etapas 
• Anticorpo Secundário 
• Revelação/Detecção 
• Análise 
Etapa 
1 
5x106 células 
em placas de 6 
poços 
Cultivo de 
células 
Extração de 
proteínas 
(tampão de 
lise Tris + 
PMSF + SDS) 
Quantificaçã
o de 
proteínas (Kit 
Pierce BCA) 
Etapa 
2 
Eletrofores
e em gel 
SDS-PAGE 
10% 
Etapa 3 
Etapa 
5 
Transferên
cia para 
membrana 
de PVDF 
Bloqueio (leite 
desnatado + 
PBS1x + 
Tween20) e 
incubação com 
anticorpos 
primários 
Incubação 
com 
anticorpos 
secundários 
anti-mouse 
ou anti-
rabbit 
(1;100) 
Revelação 
por solução 
DAB + H2O2 
Análise: 
captura da 
imagem 
(AlphaImager 
Mini) e 
densitometria 
das bandas 
(ImageJ) 
Etapa 
7 
Etapa 
8 
Etapa 
9 
Etapa 
10 
Overnigh
t 
2h 
Etapa 4 
2h 
1h 
2h-4 
1h 
1h 
1h 
Histórico 
• O nome Western Blotting é um trocadilho do nome Southern 
Blotting, uma técnica para detecção de DNA desenvolvida 
anteriormente por Edwin Southern 
 
• Northern blot -James Alwine e George Stark 
 
• Laemmli foi o idealizador da técnica quando a utilizou com a 
finalidade de determinar a mobilidade das proteínas em gel 
submetido à corrente elétrica. 
• Western blot para Proteinas. Desenvolvido por George Stark 
utilizando anticorpos para localização de proteínas 
 
 
 
Histórico 
Western Southern Northern 
Objeto de estudo Proteína DNA RNA 
Eletroforese Vertical Horizontal Horizontal 
Obtenção das 
amostras 
Mecânica e/ou 
soluções 
Mecânica e/ou 
soluções 
Mecânica e/ou 
soluções 
Tipo de gel Acrilamida Agarose Agarose 
Preparação das 
amostras 
Desnaturação por B-
mercaptoetanol 
Enzimas de restrição Desnaturação por 
formaldeído 
Tipo de suporte de 
transferência 
PVDF ou nitrocelulose Nylon ou nitrocelulose Nitrocelulose 
Tratamento do gel 
Não Sim. HCl e solução 
alcalina 
Sim. Folmaldeído 
Incubação 
Tampão 
Ac Primário 
Ac Secundário 
Enzima + Substrato 
Tampão + DNA 
radiomarcado 
Tampão + RNA 
radiomarcado 
Detecção 
Colorimétrico 
Quimioluminescência 
Fluorescência 
Auto-radiografia Auto-radiografia 
Conceito e Aplicação 
• Tecnica analitica usada na detecção de proteinas 
específicas – Tecido, Homogeinato, Extrato 
 
• Utilizado para imunodetecção de proteínas após a 
separação destas por eletroforese em gel e transferência 
para membrana adsorvente 
 
• Não é uma técnica de screning – Técnica de confirmação 
 
• Teste suplementar confirma 
• um ensaio imunoenzimático – ELISA 
 
 - Confirmar resultado de HIV 
 - Encefalopatia espongiforme bovina 
 - Confirmar formas de doença de Lyme 
 - Confirmação de hepatite B. 
 
Conceito e Aplicação 
Conceito e Aplicação 
• Também conhecido como 
– Protein blotting 
– immunoblotting, 
• Permite detectar 
• caracterizar 
• Quantificar 
• múltiplas proteínas 
• Principalmente aquelas que estão em 
baixas quantidades em determinada 
amostra 
 
Vantagens X Desvantagens 
• Vantagens 
• Alta sensibilidade 
• Alta especificidade 
• Reconhecimento de 
antígeno individuais 
• Realização de perfil de 
reconhecimento de 
antígenos 
• Cinética de expressão de 
proteínas celulares 
• Desvantagens 
• Custo médio a alto 
• Procedimento longo 
• Grandes chances de erro 
em diversos pontos 
• Problemas de 
segurança/biossegurança 
dependendo do sistema de 
revelação 
Etapas do Protocolo 
• Preparação/solubilização das amostras 
 
• Execução da eletroforese em gel 
 
• Transferência das proteínas separadas do gel para uma 
membrana adsorvente 
 
• Bloqueio de ligações inespecíficas 
 
• Adição de anticorpo específico 
 
• Detecção da reação 
 
• Geração e análise de imagens 
 
 
Preparação das amostras: Tipos de extração 
• Homogeneização mecânica 
– Homogenizador 
– Fácil de limpar e esterilizar 
– Ossos e cartilagens 
• Homogeneização ultrassônica 
– Sonicador 
– Pequenos pedaços de tecidos 
– Sangue, fígado e cérebro 
• Por pressão: 
– Microrganismos em suspensão 
• lise por detergentes: 
– Triton X-100 
– Tween 80 
– Nonidet P-40 (NP 40) 
– Saponinas. 
 
Centrifugação/Lavagem/Tampão +Inibidores/Lavagem/Tampõa+inibidores/L +C 
 
 
 
Extração de Proteínas 
• Amostras podem ser obtidas de tecidos, 
• cultura celular, bactéria, virus e amostras ambientais 
 
• Na maioria dos casos as amostras são sólidas 
 
• Inicialmente pode ser feito uma quebra mecânica usando pistilo 
ou homogeinizador ou sonicação 
 
• Uma combinação de técnicas bioquímicas e mecânicas podem 
ser usadas incluindo vários tipos de filtração e centrifugação 
 
• Para facilitar a lise das células e solubilizar as proteínas pode ser 
usado detergente, sal e tampões 
 
• Para previnir a digestão de amostras pelas próprias enzimas usar 
inibidores de fosfatases/glicosidades/proteases 
 
• Para evitar desnaturação o preparo do tecido e frquentemente 
feito em baixas temperaturas 
 
 
Quantificação de Proteínas 
• Para retirar uma alíquota do total de extrato, é necessário 
fazer uma quantificação. 
 
• Utiliza-se como padrão uma curva de BSA (5mg/mL) obtida por 
diluição seriada (7 pontos) 
 
• Dilui-se as amostras a serem quantificadas (FD=2) 
 
• Utiliza-se kit de quantificação 
 
• Obtem-se a quantidade de proteína (µg/µL) a partir da 
comparação da absorbância das amostras com o padrão de 
albumina 
 
Preparação das amostras: Tampão de amostra 
• Na solução de tratamento da amostra podem ser utilizados: 
– Agentes dissociantes (Uréia, EDTA) 
– Redutores (2-mercaptoetanol, ditiotreirol) 
– Detergentes aniônicos (SDS, desoxicolato de sódio) 
– Detergentes não-aniônicos são utilizados (Tween e Triton) 
 
– Necessidade de diluição do tampão de amostra 
 
Para que? 
– ligações dissulfido/hidrogênio 
– forças de Van derWaals 
– ligações iônicas 
– interações hidrofóbicas 
 
• diminuir a heterogeneidade da amostra o máximo possível  
Obtenção de resultados de alta qualidade 
 
 
Eletroforese em Gel de Acrilamida 
• As proteínas de uma amostra são separadas usando um gel 
• Empilhamento e corrida 
 
• A separação das proteínas pode ser feita por ponto isoelétrico, massa 
molecular, carga elétrica ou uma combinação desses fatores. 
 
• Mais comum gel: SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis) 
 
• Manter os peptídeos em um estado de desnaturação permite a 
separação das proteínas por massa molecular 
 
• O SDS é um detergente aniônico forma uma camada de cargas 
negativas, o qual as proteínas passam a ter uma carga intrínseca 
migrando para o eletrodo positivo. Desta forma, as proteínas podem 
ser separadas pelos seus pesos moleculares. 
 
 
Eletroforese em Gel de Acrilamida 
• Quanto maior a concentração de acrilamida 
melhor a resolução do gel para proteínas de baixo 
peso molecular 
 
• Quanto menor a concentração da acrilamida 
melhor a resolução de proteínas de alto peso 
molecular 
 
• Uma lane é reservada para um marcador de peso 
molecular – Misturas de proteinas com peso 
molecular definida – cores diferentes 
 
• Quando a voltagem é aplicada no gel as proteínas 
migram pelo gel em velocidade diferente 
 
• Pode ser feito também um gel bidimensional 
5% 7,5% 10% 12% 
200-60KDa 36-94KDa 16-70KDa 12-45KDa 
Eletroforese em Gel de Acrilamida 
Transferênciade Proteínas 
• No sentido de tornar as proteínas acessíveis aos 
anticorpos elas são movidas do gel para a 
membrana 
- Nitrocelulose 
- Polivinilideno difluorido (PVDF). 
- Membrana + Gel + Papel filtro 
• A PILHA é colocada em solução tampão – move-se 
do gel para membrana por capilaridade levando 
consigo as proteínas 
 
Transferência de Proteínas 
• Outro método é o eletrobloting que usa corrente 
elétrica para transferir as proteínas do gel para 
membrana 
• Molhada 
• Semi-seca 
 
Transferência de Proteínas 
• A interação da proteína coma membrana é baseada em carga e 
hidrofobicidade 
 
• Uma das maiores diferenças entre a membrana de nitrocelulose e 
PVDF esta relacionada com a capacidade de "stripping" – 
Reutilização da membrana 
• PVDF é mais grossa/resistente e pode ser mais reutilizada 
• Outra diferença entre as membrana de nitrocelulose, e PVDF é a 
necessidade da ultima precisar ser ativada em etanol, isopropanol 
ou metanol antes de uso 
 
Qualidade Transferência de Proteínas 
• A interação da proteína coma membrana é A uniformidade 
e a efetividade da transferência da proteína do gel a 
membrana pode ser observada através da membrana com 
coomassie ou ponceau 
 
• Ponceau S é o mais usado dos 2 pela maior sensibilidade e 
solubilidade em água tornando mas fácil a subsequente 
remoção do ponceau e subsequente marcação na 
membrana 
 
Bloqueio PBS/MOLICO 
• Etapa necessária para previnir a interação entre a membrana e 
anticorpo utilizado para detectar a proteína alvo já que a o 
anticorpo é uma proteína 
 
• Bloqueio de sítios não específicos é atingido colocando a 
membrana em uma solução diluída de proteínas  Tipicamente 
BSA e leite desnatado. 
 
• A proteína na solução diluida ataca membrana em todos os locais 
onde as proteínas alvo não foram transferidas 
 
• Isso reduz o ruido no produto final do WB tornando os resultados 
mais claros e eliminando falto positivos 
 
 
 
Incubação com anticorpos 
• Anticorpos (monoclonais ou policlonais) são utilizados para detectar uma 
proteína (antígeno ou epítopo) específica. 
 
• Posteriormente, esta reação antígeno/ anticorpo primário será exposta a um 
anticorpo secundário direcionado à porções espécie-específicas do 
anticorpo primário. 
 
• Normalmente, o anticorpo secundário está ligado à uma enzima reveladora - 
HRP que gera uma mudança de coloração ou um sinal fotométrico 
 
• Atenção com o fator de diluição dos Acs 
 
 
Detecção em duas etapas 
• Anticorpo primário (Anticorpos são gerados quando uma espécie 
hospedeira ou células imunes cultivadas são expostas a uma 
proteína de interesse ou parte dela). 
 
• Uma solução de anticorpo primário (0.5 and 5 micrograms/mL) é 
incubado com a membrana sobre uma gentil agitação de 30min a 
overnight em temperaturas diferentes 
 
• A solução é composta pela solução de bloqueio 
 
• Lavar para remover o excesso do primário 
 
• Secundário - a membrana é exposta a outro anticorpo dirigido para 
a porção específica do anticorpo primário 
• comumente conjugado a biotina ou a uma enzima reporter 
(FA/HRP). 
 
• Mais comumenta ainda usa-se um anticorpo secundário conjugado 
a peroxidase –cliva agente quimiluminescente para produzir 
luminescencia proporcional a quantidade de proteínas 
 
Detecção 
• Tipos de detecção: 
– Radioativo: ionização + autorradiografia = alto custo + riscos à saúde 
– Imunoenzimática: colorimétrico/quimioluminescência/fluorescência 
• Colorimétrico: 
– Ac Sec. + enzima (HRP ou Fosfatase Alcalina – FA) 
– Substrato da enzima (Diaminobenzidina - DAB) 
• Quimioluminescência: 
– Ac Sec. + enzima (HRP) 
– Substrato da enzima (Luminol) 
• Fluorescência 
– Ac Sec + fluorocromo 
• Revelação de uma etapa 
• Permite que o processo ocorra mais rápido e com gasto de menos 
consumíveis 
• Se usa o de 2 etapas por causa da facilidade em fazer os anticorpos de 
forma separada. – Combinação maior de anticorpos 
 
Detecção 
• Detecção coloriétrica 
• DAB + enzima reporter = converte em corante insolúvel 
• Cor diferente que precipita perto da enzima e marca a membrana 
• Níveis de proteínas podem ser avaliados por densitometria. 
• Quimiluminescencia 
• Substrato luminesce quando em contato com a enzima do secundário 
• A luz é detectada por um filme fotográfico e mais reccentemente por 
cameras CCD Imagem analisada por densitometria 
• Fluorescência 
• Marcador fluorescente é excitados por luz e a emissão da excitação é 
detectada por um fotosensor ou camara CCD 
• Metodo de detecção mais específico - quantitativo 
 
 
Detecção 
• A fluorescência/Luminescência ou coloração de banda é detectada 
por um filme fotográfico ou câmeras especiais que capturam uma 
imagem digitalizada do WB. 
• A imagem é analisada por densitometria, a qual avalia a quantidade 
de proteína colorida e quantifica os resultados em termos de 
intensidade óptica 
• Utiliza-se aparelho chamado fotodocumentador 
 
Detecção 
Detecção 
Problemas 
a) Background b) Bandas inespecíficas 
c) Sinal fraco d) Sinais dispersos 
e) Bandas fantasma