Coloração de Gram

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Coloração de Gram
A coloração de Gram é baseada na composição química e integridade da parede celular bacteriana. Dependendo da cor que adquirirem, as bactérias serão classificadas em Gram-positivas (quando ficam roxas) ou Gram-negativas(quando avermelhadas). Geralmente as Gram-positivas são mais patogênicas. A técnica é fundamental para a taxonomia e identificação das bactérias, sendo utilizada como técnica de rotina em laboratórios de bacteriologia.
Procedimento do método de Gram:
O primeiro passo é o preparo do esfregaço bacteriano que pode ser feito de dois modos: A partir de colônias bacterianas ou a partir de culturas em meio líquido.
A partir de Colônias Bacterianas:
Colocar uma gota de solução salina estéril na lâmina;
Tocar a colônia bacteriana com uma alça de níquel-cromo e homogeneizar o material da alça na gota salina colocada na lâmina;
Distender a suspensão bacteriana com movimentos elípticos até que esta forme um “filme” tênue e homogêneo (ESFREGAÇO);
Deixar o esfregaço secar a temperatura ambiente;
A partir de Culturas em meio líquido:
Colocar uma “alçada” da cultura na lâmina;
Distender a suspensão bacteriana com movimentos elípticos até que esta forme um “filme” tênue e homogêneo;
Deixar o esfregaço secar a temperatura ambiente;
Antes de iniciar a coloração, assegure-se de que o esfregaço esteja seco. Não fixe o esfregaço em chama, pois este processo promove a desidratação brusca dos constituintes celulares. Lembre-se de que a violeta-de-metila já contém fixador químico. Depois disso é feito a coloração do esfregaço através do método de Gram. Esse método deve proceder da seguinte forma:
Cubra o esfregaço com violeta-de-metila e deixe por aproximadamente 15 segundos;
Adicione igual quantidade de água sobre a lâmina coberta com violeta-de-metila e deixe agir por 45 segundos;
Escorra o corante;
Lave em um filete de água corrente;
Cubra a lâmina com lugol diluído (1/20) e deixe agir por aproximadamente 1 minuto;
Escorra o lugol e lave em um filete de água corrente;
Adicione álcool etílico (99,5º GL) sobre a lâmina; descorando-a, até que não desprenda mais corante;
Lave em um filete de água corrente;
Cubra a lâmina com safranina e deixe agir por aproximadamente 30 segundos;
Lave em um filete de água corrente;
Deixe secar ao ar livre, ou seque suavemente, com o auxílio de um papel de filtro limpo;
Coloque uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço;
Leia em objetiva de imersão (100 X)
Como funciona o método da coloração de Gram?
Quando as estruturas celulares são cobertas pela violeta-de-metila, todas se coram em roxo. Com a adição do lugol, também chamado de mordente, ocorre a formação do completo iodo-pararosanilina. Esta reação tem a propriedade de fixar o corante primário nas estruturas coradas. Algumas estruturas perdem a cor violeta rapidamente, quando se aplica um agente descorante, como álcool etílico, enquanto outras perdem sua cor mais lentamente ou não perdem a cor. A safranina cora as estruturas que foram descoradas.
As bactérias que têm a parede celular composta por mureína (peptídeoglicano – peptídeo de ácido n-acetil murâmico), durante o processo de descoloração com álcool etílico, retém o corante. Já as bactérias com parede celular composta predominantemente por ácidos graxos (lipopolissacarídeos e lipoproteínas) perdem o complexo iodo-pararosanilina, assumindo a cor do corante de fundo.
Gram+ e Gram- 
Ambas estão quase iguais no que se refere a número e importância. A diferença básica entre um tipo e outro de bactéria está na sua parede celular. As Gram-positivas possuem parede celular com uma única e espessa camada de peptidoglicanos. Quando este tipo bacteriano entra em contato com a coloração de Gram adquirem a cor púrpura ou azul quando fixada com cristal violeta. Isto se explica porque estas bactérias retêm o corante presente nestas substâncias. As Gram-negativas possuem parede celular mais delgada e apresentam uma segunda membrana lipídica, diferente da membrana plasmática. Quando em contato com a coloração Gram o lipídio da membrana mais externa é dissolvido no álcool e libera o primeiro corante, o cristal violeta. Ao fim do processo essas bactérias estão na cor rosa-avermelhada do segundo corante, a safranina.
 
 
As diferentes reações virulentas
Um P.S.: Para quem não sabe, virulência é a capacidade patogênica de um microorganismo, ou seja, a capacidade deste em transmitir doenças infecciosas, medida através da taxa de mortalidade que ele produz e/ou por seu poder de invadir tecidos do hospedeiro.
As bactérias gram-positivas e gram-negativas possuem formas diferentes de ataque virulento. As gram-negativas possuem característica patológica, devido a substancia LPS.
As gram-positivas possuem a característica de aderência, devido à exotoxina, composta pelo ácido lipoteinóico. No envelope celular das bactérias gram-negativas encontramos quimicamente de 20 a 25% de fosfolipídios e 45 a 50% de proteínas, sendo os 30% restantes de uma lipoproteína, o lipopolissacarídeo.