Manual de Práticas MICRO 2015.1

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PROCEDIMENTOS OPERACIONAIS DE AULAS PRÁTICAS: Microbiologia de 
Alimentos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2015 
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SUMÁRIO 
PRÁTICA 
 
Pág. 
 1 Normas de biossegurança em laboratório 4 
 2 Fatores intrínsecos e extrínsecos – Contagem Padrão em Placa 5 
 3 Pesquisa de coliformes totais e termotolerantes em água ou alimentos 6 
 4 Contagem de bolores e leveduras 8 
 5 Contagem de bolores e leveduras. 9 
 6 Avaliação da eficácia da higienização de mãos, superfícies 10 
 
 
 
 
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ASSUNTO: Procedimentos Operacionais de Aulas Práticas 
Disciplina: Microbiologia de Alimentos 
Código da Disciplina SDE0381 
Curso: Nutrição 
Semestre: 3º 
Local de Execução 
das Aulas Práticas: 
Laboratório de Microbiologia 
Nº Máximo de Alunos 25 
 
Equipe de Elaboração dos Procedimentos 
 
 
Bibliografia básica: 
 
FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos Alimentos, Editora Atheneu, 
1996, 182p. 
SILVA, Neusely da et al. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos e 
água. 4. ed. São Paulo, SP: Varela, 2010. 
JAY, J M. Microbiologia de Alimentos. 6ª. ed. Porto Alegre: Artmed, 2005. CAPÍTULO 
3 – Parâmetros Intrínsecos e Extrínsecos dos alimentos que afetam o crescimento 
microbiano. 
PELCZAR, CHAN, KRIEG. Microbiologia: conceitos e aplicações. 2ª Ed. Vol.1 São 
Paulo: Makron, 1997. 
 
 
 
 
 
 
Coordenador do Curso: Profa Rose Feliciano 
Professores da Disciplina: Profa Bethania M. Ramos 
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 PRÁTICA 1 - Normas de biossegurança em laboratório. 
 
1. INTRODUÇÃO 
Os laboratórios de microbiologia são locais onde promovemos a identificação e a multiplicação de agentes 
deterioradores e patogênicos ao homem, e principalmente para as pessoas que neles trabalham. Qualquer 
micro-organismo, por mais inócuo que seja, pode interagir com o ambiente ou com outra forma de vida. 
Devemos ressaltar que esta interação indesejável pode ser perigosa. Nas aulas práticas de microbiologia 
utilizaremos uma variedade de bactérias, portanto é essencial que as normas sejam seguidas, a fim de se 
evitar contaminações acidentais. Temos que conhecer e cumprir regras comportamentais durante a realização 
dos procedimentos laboratoriais com os micro-organismos. 
 
2. OBJETIVOS 
 Apresentação do laboratório de microbiologia, equipamentos e utensílios e as regras de biossegurança. 
 Aplicar as normas de segurança durante a realização dos procedimentos laboratoriais. 
 Cumprir e fazer cumprir, os procedimentos e comportamento durante a execução das aulas práticas. 
 
Conduta Pessoal: 
 O uso do jaleco, calça comprida, touca, máscara, luvas descartáveis e sapatos fechados durante as aulas 
práticas é obrigatório. 
 
 Cabelos longos devem ser amarrados de forma a não interagir com reagentes, equipamentos e fogo. 
 
 Limpar e desinfetar a superfície das bancadas antes e depois de cada aula prática. 
 
 O trabalho deve ser executado num ambiente limpo e organizado, com muita atenção e cuidados. 
 
 Lavar e sanificar as mãos antes de iniciar a análise, ao sair do laboratório e sempre que for necessário. Se 
for portador de algum ferimento nas mãos, procurar não tocar no material. 
 
 Identificar as amostras, bem como o material a ser utilizado antes de iniciar a análise. 
 
 Não é permitido fumar, comer e beber, bem como portar ou conservar alimentos no recinto do laboratório. 
 
 Utilizar exclusivamente material estéril para análise. 
 
 Antes de iniciar cada experiência ou serviço de rotina, é necessário ler com atenção a técnica (roteiro de 
aula prática) a ser executada. 
 
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PRÁTICA 2 - Fatores intrínsecos e extrínsecos – Contagem Padrão em Placa 
 
1. INTRODUÇÃO 
O desenvolvimento microbiano em alimentos é influenciado muitas vezes por condições inerentes ao próprio 
alimento (como teor de nutrientes e pH, por exemplo) ou inerentes ao ambiente em que este alimento é 
armazenado, como temperatura e umidade relativa do ar. Conhecendo quais condições são propícias para o 
desenvolvimento microbiano e as características de cada tipo de micro-organismo, é possível controlar e/ou evitar 
a deterioração de alimentos causada por estes seres vivos. 
 
2. OBJETIVO: 
Avaliar a influência dos fatores intrínsecos e extrínsecos no crescimento de bactérias. 
 
3. PROCEDIMENTO: 
a) Cada grupo receberá um alimento (suco de frutas) 
b) Pesar 25 g/ml do alimento 
c) Transferir para um erlenmeyer contendo água peptonada (225 ml) e homogeneizar (Diluição 10
-1
) 
d) Fazer diluições seriadas: retirar 1 mL do erlenmeyer, e transferir para um tubo de ensaio com 9 ml de água 
peptonada e homogeneizar (Diluição 10
-2
); 
e) Em seguida, retirar uma alíquota de 1 mL do tubo e transferir para outro com 9 mL de água peptonada 
(Diluição 10
-3
). 
f) Transferir uma alíquota de 0,1 ml, de cada diluição para placas de petri com meio PCA (padrão de contagem 
em ágar) (Obs: fazer em duplicata) 
g) Utilizar alça de drigalsky, até secagem da amostra; 
h) Incubar as placas a 35°C/48h (para bactérias mesófilas) e a 5°C/48h (para bactérias psicrotrófilas) 
 
4. RESULTADOS: Contagem em placas 
 
 Diluição 
 10
-1
 10
-2
 10
-3
 
Bactérias 
mesófilas 
(BM) 
 
Bactérias 
psicrotrófilas 
(BP) 
 
 
 
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PRÁTICA 3 - Pesquisa de coliformes totais e termotolerantes em água ou alimentos 
 
1. INTRODUÇÃO 
O grupo de coliformes totais inclui as bactérias na forma de bastonetes Gram negativos, não esporogênicos, aeróbios 
ou anaeróbios facultativos, capazes de fermentar a lactose com produção de gás, em 24 a 48 horas à 35ºC, o grupo 
inclui cerca de 20 espécies, dentre as quais se encontram tanto bactérias originárias do trato gastrintestinal do homem 
e dos animais como espécies não entéricas. O grupo de coliformes fecais (termotolerantes), restringeg-se aos 
membros capazes de fermentar a lactose com produção de gás, em 24 horas à 44,5-45,5ºC. O grupo coliformes fecais 
inclui pelo menos 3 gêneros: E. coli, Enterobacter, Klebsiella. 
 
2. OBJETIVOS 
Detectar a presença de coliformes totais e termotolerantes em água e em alimentos utilizando o método do Número 
Mais Provável (NMP). 
 
3. PROCEDIMENTO: 
- Cada grupo receberá uma amostra (sanduíche / salada de frutas / água, etc.). 
- Pesar 25g/ml de amostra. 
- Transferir para um erlenmeyer contendo água peptonada (225 ml) e homogeneizar. 
- Fazer diluições seriadas: preparar diluições 10
-1
, 10
-2
 e 10
-3
. 
 
A) Etapa 1: Teste Presuntivo de NMP de coliformes totais 
1. Transferir uma alíquota de 1 mL de cada diluição para 3 tubos de ensaio contendo 9 ml de caldo Lauril 
Sulfato Triptose (LST) com tubo de Duhran invertido. Homogeneizar. 
2. Incubar 35ºC por 24h e observar se há a formação de gás, em caso negativo reincubar por 24 horas e 
repetir a leitura. 
3. Contar o numero de tubos positivos com produção de gás. 
 
B) Etapa 2: Teste Confirmativo de Coliformes totais 
1. Identificar os tubos positivos (turvação e formação de gás). 
2. De cada tubo positivo retirar uma alçada e inocular em 3 tubos de caldo verde brilhante. 
3. Incubar a 35 ºC por 24 a 48h. 
4. Considerar como positivos os tubos turvos com produção de gás nos tubos de Durhan. 
 
C. Etapa 2: Teste Confirmativo de Coliformes termotolerantes 
1. Identificar os tubos positivos (turvação e formação de gás). 
2. De cada tubo positivo retirar uma alçada e inocular em 3 tubos contendo caldo EC (E. coli). 
3. Incubar a 45,5 ºC para determinar Coliformes Termotolerantes por 24h. 
4. Considerar como positivos os tubos turvoscom produção de gás nos tubos de Durhan. 
 
D. Etapa 3: Estimativa de coliformes pelo Número Mais Provável (NMP) 
1. Identificar os tubos positivos (presença de gás e turvação). 
2. Utilizar a Tabela do Número Mais Provável (NMP/g) para estimativa da contagem de coliformes (Anexo). 
 
 Diluição 
 
 
10-1 10-2 10-3 Total 
Colifomes totais 
 
 
7 
 
Coliformes 
termotolerantes 
 
 
ANEXO: Técnica do Número mais Provável (NMP) e intervalo de confiança ao nível de 95% de 
probabilidade, para diversas combinações de tubos positivos em séries de três e cinco tubos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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PRÁTICA 4 - Contagem de bolores e leveduras. 
 
1. INTRODUÇÃO: 
Os fungos, como os bolores, encontram-se naturalmente presentes em grãos, cereais e oleaginosas, etc. Podem 
apresentar perigo químico, pela possibilidade de produção de micotoxinas. Os produtores e beneficiadores de grãos 
devem adotar medidas de controle de fungos na plantação e armazenamento. 
 
2. OBJETIVOS: 
Detectar a presença de bolores, leveduras e fungos naturais em variados alimentos. 
 
3. PROCEDIMENTO: 
1. Contagem de bolores e leveduras: 
 
a) Cada grupo receberá uma fruta in natura ou fruta seca,. 
b) Pesar 25 g/ml do alimento. 
c) Transferir para um erlenmeyer contendo água peptonada (225 ml) e homogeneizar (Diluição 10
-1
). 
d) Fazer diluições seriadas: retirar 1 mL do erlenmeyer, e transferir para um tubo de ensaio com 9 ml de 
água peptonada e homogeneizar (Diluição 10
-2
). 
e) Em seguida, retirar uma alíquota de 1 mL do tubo e transferir para outro com 9mL de água peptonada 
(Diluição 10
-3
). 
f) Transferir uma alíquota de 0,1 ml de cada diluição preparada para placas de petri com meio Ágar 
Saboroud. 
g) Utilizar alça de drigalsky até secagem da amostra. 
h) Incubar as placas a 24°C/5 dias 
 
 
 Diluição 
 10
-1
 10
-2
 10
-3
 
Bolores 
 
Fruta In natura 
 
Fruta Seca 
 
Leveduras 
 
Fruta In natura 
 
Fruta Seca 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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PRÁTICA 5 - Pesquisa de Staphylococcus aureus. 
 
1. INTRODUÇÃO 
 
A contagem de Staphylococcus aureus em alimentos acima do padrão estabelecido indica principalmente falhas 
de higiene pessoal e falhas na manipulação de alimentos. O objetivo da contagem deste micro-organismo é: em 
primeiro lugar está relacionado com a saúde pública para a confirmação do envolvimento em surtos de 
intoxicação alimentar; em segundo com o controle de qualidade higiênico-sanitária dos processos de produção 
de alimentos. Este micro-organismo serve como indicador de contaminação pós-processo ou das condições de 
sanificação das superfícies em contato com os alimentos. 
 
2. OBJETIVOS 
Detectar a presença de Staphylococcus aureus em alimentos e em mãos de manipuladores de alimentos. 
 
3. PROCEDIMENTO 
 
No alimento 
a) Triturar 25g de amostra de alimentos (sanduíche natural) em 225 mL de água peptonada estéril. 
b) Fazer 3 diluições 10
-1
, 10
-2
 e 10
-3
 
c) Pipetar 0,1 mL de suspensão de cada diluição e colocar em placa com meio BP (Baird-Parker) e espalhar 
com uma alça de drigalsky. 
d) Incubar 35ºC por 48h 
 
Em mãos 
1. Espalhar o swab umedecido com água peptonada nas mãos (sem lavagem) meio BP (Baird-Parker) 
2. Espalhar o swab sobre a placa de petri com meio BP (Baird-Parker) e espalhar com uma alça de drigalsky. 
3. Incubar 35ºC por 48h 
 
As colônias típicas são pequenas pretas com halo incolor em volta 
OBSERVAÇÃO: Para confirmação é necessária a incubação das colônias suspeitas em caldo BHI e em meio 
TSA e a realização teste de catalase e coagulase para confirmação bioquímica. Será considerado Staphylococcus 
aureus se apresentarem resultados: Catalase + e Coagulase – OU Coagulase + e Catalase -. 
 
 
Responda as questões abaixo: 
a) O que pode causar a contaminação de alimentos por S. aureus? 
b) O que indica a presença de S. aureus em alimentos ou mãos? 
c) O alimento testado nesta aula prática encontra-se dentro dos padrões baseado na RDC nº12? 
 
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PRÁTICA 6 - Avaliação da eficácia da higienização de mãos, superfícies. 
 
1. INTRODUÇÃO: 
A correta higienização de alimentos, mãos e superfícies é fundamental para evitar contaminações que possam produzir 
efeitos extremamente prejudiciais ao consumidor, pondo em risco sua saúde e sua qualidade de vida. 
2. OBJETIVOS: 
 
- Verificar a eficácia de diferentes sanificantes na higiene de vegetais. 
- Verificar a eficácia de diferentes sanificantes na higiene de superfícies e das mãos. 
3. PROCEDIMENTO: 
 
a) Higiene das mãos: 
- Equipe 1: Passar a mão suja em placa contendo Agar simples e incubar a 30 ºC por 48h. 
 - Equipe 2: Lavar as mãos apenas com água e passar a mão em placa contendo Agar simples e incubar a 30 ºC por 
48h. 
- Equipe 3: Lavar as mãos com água e sabonete líquido e passar a mão em placa contendo Agar simples e incubar a 
30 ºC por 48h. 
- Equipe 4: Lavar as mãos com água, sabonete líquido enxaguar, passar álcool gel 70% ou clorexidina ou álcool 
iodado, deixar secar naturalmente e passar a mão em placa contendo Agar simples e incubar a 30 ºC por 48h. 
- Observar qual procedimento foi mais eficiente. 
 
 
b) Higiene de superfícies: 
- Molhar o swab em água peptonada estéril e passar em uma superfície qualquer. 
- Passar o swab sobre meio Agar simples em placa de petri estéril e incubar 30 ºC por 48h. 
- Umedecer um algodão em clorexidina, ou quaternário de amônio ou álcool 70% ou álcool iodado ou cloro a 200 ppm 
e passar sobre a mesma superfície testada anteriormente. Após, molhar o outro swab em água peptonada estéril e 
passar sobre esta mesma superfície já higienizada. 
- Passar este outro swab sobre meio Agar simples em placa de petri estéril e incubar a 30 ºC por 48h. 
- Comparar resultados. 
 
Responda as questões abaixo: 
a) Descreva o Procedimento padronizado para higienização da superfície estudada mais adequada baseado 
nos resultados obtidos. 
b) Por que você não aconselharia utilizar o álcool a 96ºGL para higienizar superfícies e utensílios?