Anotações Aula BQ

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P1- Bioquímica 
 
Replicação do DNA 
➔ Ligação fosfodiéster 
◆ Direção 5’-3’ 
➔ Replicação 
◆ Modelos conservativos e semi-conservativos 
◆ Teste com N14 e N15 
● Modelo semi-conservativo 
➔ Mecanismo para a manutenção do modelo semi-conservativo 
◆ Fita anti-paralelas 
◆ Hormônios citocinas, fatores de crescimento: sinais para a replicação 
➔ Movimento das forquilhas cria superenrolamento 
◆ Topoisomerase (girase): mecanismo de funcionamento da topoisomerase 
● Diminui a tensão em uma região do DNA momentaneamente 
○ Durante a abertura da fita 
◆ Quebra a ligação fosfodiéster 
◆ Sentido 3’-5’: Fita descontínua/ Fragmentos de Okazaki 
◆ Sentido 5’-3’: Fita contínua/ 
◆ Primase (RNA primer): inicia a síntese 
◆ DNA polimerase: Retira o iniciador e torna a fita 
contínua/Sintetiza a nova fita 
◆ DNA ligase: Une fragmentos de Okazaki 
◆ “Sliding-clamp”: não há síntese de DNA se a DNA 
polimerase não estiver ligada a esta enzima “braçadeira”: 
TCNA 
● TCNA: acelera a velocidade da DNA polimerase 
● Marca a proliferação de DNA: câncer 
 
 
◆ DNA polimerase 1: tem atividade de polimerase e 
exonuclease: verificação de eventuais nucleotídeos 
colocados errados 
➔ Forquilha de replicação (replicossomo) 
◆ Helicase: abertura da fita 
● Rompe as ligações de hidrogênio 
○ Abertura da dupla de DNA 
◆ SSBP (​single-standing binding protein) 
● Ligam-se a cada uma das fitas, impedindo a formação das ligações de 
hidrogênio 
◆ Topoisomerase 
● Diminui a tensão durante a abertura da fita de DNA 
○ Quebra e religa imediatamente a ligação fosodiéster 
◆ RNA primase 
● Iniciadores da fita contínua e descontínua 
● Usa nucleotídeos de RNA 
◆ DNA-polimerase (associada a TCNA) 
● Sintetiza a nova fita, formando as ligações fosfodiéster 
● Sentido 5’-3’ 
● Ação exonuclease 
○ Verificação de eventuais nucleotídeos colocados errados 
◆ PCNA 
● Se complexa com a DNA-polimerase 
● Acelera a velocidade da DNA-polimerase 
◆ Ligase 
● Une fragmentos de Okazaki da fita descontínua 
➔ Encurtamento do DNA durante a replicação 
◆ Remoção do RNA primer gera um espaço 
◆ Telomerase: transcriptase reversa (RNA -> DNA) 
● Utiliza seu molde de RNA -> DNA 
● Reverter o possível encurtamento dos telômeros 
◆ Telomerase não faz parte do replicossomo 
● Age no final da replicação 
 
Transcrição - Prof.Carina 
➔ RNA 
◆ Fita simples 
◆ Possui uracila 
◆ RNAm, RNAt, RNAr 
➔ Gene 
 
 
➔ 
◆ Parte do DNA que codifica proteína 
◆ DNA codificante: 1% 
◆ DNA não codificante: 99 % 
● Cresce ao longo da evolução 
● Regula o DNA codificante 
◆ Região promotora (promotor): início 
● Mostra o início do gene 
● Pode ser tanto do lado direito quanto do esquerdo 
○ Depende do gene 
◆ Região final (terminadora): final 
◆ Entre essas duas regiões, há éxons (fica) e íntrons (sai) 
● Éxons são codificantes 
◆ Em seres complexos, a parte não codificante vai aumentando na evolução 
● A parte não codificante tem uma função regulatória dos genes 
➔ Início 
◆ Em humanos: Fatores de transcrição 
● Fatores de transcrição (proteínas) ligam-se ao promotor 
○ Formação do complexo proteico que se ligam no promotor 
◆ Esse fatores de transcrição ligados ao promotor dobram a 
fita de DNA 
● RNA polimerase liga-se ao complexo proteico 
○ A RNA polimerase não consegue se ligar ao DNA sozinha 
◆ Depende desse complexo proteico de fatores de 
transcrição para que ela se ligue ao DNA 
● RNA polimerase é fosforilada e se solta desse complexo proteico 
○ Inicia-se o processo de transcrição 
◆ Em bactérias: fator sigma reconhece o promotor 
 
 
● Fator sigma reconhece o promotor com a RNA polimerase 
○ Fator sigma se desprende 
◆ RNA polimerase começa a atividade: produção de RNA 
20:40 audio fita molde 
➔ Elongação 
◆ Formação da fita de RNA 
◆ Sense 5’-3’ 
◆ Anti-sense: 3’-5’ 
◆ 3 tipos de RNA polimerase: 
● RNA polimerase 1 
○ RNA ribossomal 
● RNA polimerase 2 
○ Faz os RNAm’ 
○ Não consegue resolver o problema do superenrolamento: 
◆ Recebe ajuda da topoisomerase 
● RNA polimerase 3 
○ RNA transportador e ribossomal 
◆ Duas enzimas principais da transcrição 
● RNA polimerase II 
● Topoisomerase 
◆ RNAm tem a mesma sequência da fita codificadora (a fita que não serve como 
molde). Apenas troca T por U 
● RNAm é complementar a fita molde 
● Igual a fita codificadora 
➔ Terminação 
◆ Em humanos, não se sabe ao certo qual a sequência de terminação da 
transcrição 
● Em uma determinada sequência a RNA polimerase perde afinidade com 
o DNA 
○ RNA polimerase se solta do DNA 
◆ Fim da transcrição 
◆ RNA polimerase encontra a região de terminação e se desgruda do DNA 
➔ Processamento pós-transcrição 
◆ Adição de um cap na ponta 5’ 
● Cap: nucleotídeo G metilado e invertido 
● Liga-se ao RNAm de ponta cabeça 
○ Ligação 5’-5’ 
● RNA-ase: degrada RNA no citoplasma 
○ Principal função da RNA-ase: Degradação de material genético 
viral 
○ Começa a degradação do RNA pela ponta 
 
 
○ Cap: 
◆ Protege contra a degradação 
● Estabiliza o RNAm 
○ Fica mais tempo no citoplasma 
● RNA-ase não reconhece a ligação 5’-5’ causada 
pelo cap 
◆ Splicing: 
● Retirada dos íntrons 
● Íntrons podem ser retirados por duas formas: 
○ 90% do splicing por spliceossomo (complexo de proteínas e 
SNRNA) 
◆ SNRNA reconhece a ponta do íntron 
◆ Complexos se unem 
● Aumenta a afinidade e se dobram formando uma 
alça 
● Forma uma alça 
○ Íntron é clivado (retirada do íntron) 
○ Exóns se unem 
● Autosplicing 
○ RNA retira o próprio íntron se nenhuma enzima 
◆ RNA do tipo ribozima 
◆ Tem sua própria função catalítica 
○ Os próprios nucleotídeos se atacam e se clivam 
◆ Cauda poli A 
● No final: adição de cauda poli A na ponta 3’ 
○ RNAm torna-se maduro e sai do núcleo 
◆ Vai para a tradução 
● Quando o RNAm passa por esse processos, essa 
molécula é reconhecida por fatores de tradução no 
citoplasma que sinalizam para as subunidades do 
RNAr 
○ Início da formação do complexo de 
iniciação (da tradução) 
◆ Splicing alternativo 
● Nem todos tecidos reconhecem éxons e íntrons da mesma maneira 
○ Alguns tecidos não reconhecem alguns éxons 
○ Gera isoformas ou isoenzimas 
● Splicing alternativo do pré-RNAm 
○ Gera RNAm’s alternativo 
➔ Eucarioto x Procarioto 
◆ Eucarioto tem processamento 
◆ Procarioto não tem processamento (tudo é codificado) 
 
 
➔ Análise da expressão gênica 
◆ Consiste em analisar o quanto um gene produz de proteína 
○ Formas de análise: 
◆ Identificar a quantidade de RNAm produzido 
◆ Transcrição de um tecido para outro é diferente 
◆ Transcrição reversa 
● Primeiro passo da análise da expressão gênica 
● Célula de interesse 
○ Sofre lise 
○ Extração de RNA 
● RNA vira DNA (DNA complementar) por transcrição reversa 
● Para ocorrer a transcrição reversa é necessário um primer 
○ Adição de oligonucleotídeo TTT (iniciador TTT) 
◆ Reconhece RNAm 
● Pega somente RNAm (possui cauda poli A) 
○ Após isso, a transcriptase reversa transforma RNA em DNA 
● Quando o RNA vira DNA (dupla fita) o DNA ganha a capacidade de se 
replicar 
◆ Polimerase Chain Reaction (PCR) 
● Segunda etapa da análise da expressão gênica 
● Coleta-se um material a ser estudado (células nucleadas) 
○ cDNA 
● In vitro: adiciona-se cDNA, primers, nucleotídeos e DNA polimerase 
○ Coloca-se um iniciador específico para o gene de interesse 
○ DNA polimerase é dependente de primers 
● Material é colocado no termociclador 
○ 95 graus: rompimento da dupla hélice do DNA 
○ 57 graus: ligação dos primers às suas sequências 
complementares nas fitas de DNA 
○ 72 graus: ideal para o funcionamento da DNA polimerase 
◆ Formação das cadeias complementares 
○ Fechamento do primeiro ciclo da PCR 
○ Em média: necessário35 ciclos 
◆ A cada ciclo há um aumento exponencial de moléculas de 
DNA amplificadas 
◆ Eletroforese 
● Utiliza-se o produto da PCR e coloca-se na eletroforese 
○ Banda espessa: mais RNAm na amostra 
○ Banda fina: menos RNAm 
◆ Análise de fluorescência: PCR em tempo real 
● Feito no computador 
◆ Teste de HIV 
● Coleta-se o material e adiciona-se primers com material genético viral 
 
 
● Análise específica para os genes virais 
● Caso ocorra a amplificação: HIV postivo 
○ A pessoa possuia material genético viral 
➔ Hidbridização 
◆ Utiliza-se oligonucleotídeos com fluorescência/ radioatividade na ponta que 
pareiam apenas com o gene de interesse 
● Sonda: oligonucleotídeo marcado 
◆ Coloca-se esses oligonucleotídos junto com a mostra (pool de DNA’s) 
◆ Oligonucleotídeo vai parear somente com o gene de interesse 
◆ Pega-se a amostra de DNA 
● Esquenta 
● Adiciona-se a sonda 
● Esfria 
● Lava-se a amostra 
○ Caso haja fluorescência na análise via microscópio, isso indica 
que a sonda se ligou com o gene de interesse 
○ Caso não haja fluorescência, isso mostra que a sonda foi levada 
embora pois não se ligou com o gene de interesse 
◆ É possível analisar tanto a presença do gene (fluorescência) quanto a 
quantidade dos genes (intensidade da fluorescência) 
◆ Mais uma opção de análise da expressão gênica 
 
Tradução 
➔ Peptídeo 
◆ Leitura: amino terminal -> carboxila terminal (N terminal -> C-terminal) 
◆ O código genético mitocondrial há diferenças e relação ao código genético 
universal 
◆ Códon-stop: UGA, UAA,UAG 
◆ Codigo genético degenerado: 1 AA pode ser codificado por mais de 1 códon 
➔ Enzima telomerase 
◆ Age após a replicação 
◆ Alonga o terminal do cromossomo 
➔ RNAt: funciona como um adaptador 
◆ Aminoácido só entra na síntese proteica se estiver carregado pelo RNAt 
(ativação do aminoácido) 
◆ Cadeia polipeptídica única 
◆ Extremidade 3’: onde se liga o AA 
◆ Anti-códon: complementar ao RNAm 
● Por ligações de hidrogênio 
◆ Pareamento ou posição de Wobble 
● Na terceira posição, o pareamento não precisa ser precisa 
 
 
● O pareamento entre a primeira e a segunda posição do códon/anti-códon 
precisa ser perfeito. Já a terceira posição, não. 
○ Código genético degenerado 
○ Ex: leucina 
◆ U e C definem a tradução para leucina 
◆ A terceira posição varia, mas é indiferente pois codificam o 
mesmo aminoácido 
➔ RNAr 
◆ Apresenta duas subunidades: maior e menor 
◆ Ribossomo dos procariotos é diferente de ribossomos de eucariotos 
➔ Drogas que interferem na síntese proteica 
◆ Mecanismo de ação da maioria dos antibióticos 
● Agem no mecanismo de síntese proteica das células procarióticas 
○ Interação com o ribossomo da bactéria 
◆ Importância dos tamanhos diferentes de RNAr entre 
procariotos e eucariotos 
➔ Complexo inicial da tradução 
◆ Subunidade maior e menor do RNAr, RNAm e RNAt 
● Complexo inicial essencial para o inicio da síntese proteica 
◆ Sítio A: amino-acil 
◆ Sítio P: peptidil 
◆ Procariotos 
● Formil-metionina 
◆ Eucariotos 
● Metionina 
➔ 1º Etapa: Ativação de aminoácidos 
◆ Ocorre no citoplasma 
◆ Depende de uma enzima (aminoacil-RNAt-sintase) e consumo de ATP 
● Existe uma enzima específica para cada RNAt e seu aminoácido 
● Realiza o encontro entre o aminoácido e o RNAt no citoplasma 
○ Consumo de 1 molécula de ATP 
➔ 2º Etapa: Iniciação da síntese proteica -> Formação do complexo de iniciação 
◆ Complexo de iniciação 
● Deve possuir o RNAm com o códon AUG inicial no sítio A e o RNAt com 
a metionina que entrará no sítio P 
◆ Envolve a interação entre as subunidades do RNAr, RNAm e RNAt 
◆ Ribossomo deve reconhecer o RNAm 
● Existe um pareamento entre os RNAr das subunidades do ribossomo 
com o RNAm 
● As sequências não foram ainda identificadas nas células eucarióticas 
● Formação do complexo de iniciação 
○ RNAm, ribossomo, RNAt (RNAm com o primeiro códon AUG 
entra no sítio P) 
 
 
◆ Primeiro RNAt entra no sítio P 
◆ Todos os demais RNAt entram no sítio A 
◆ Enzima translocase 
● Movimenta o ribossomo ao longo do RNAm 
● Consome um molécula de GTP 
● Sitio A: Onde entra o aminoácido 
● Sítio P: Peptídeo que está sendo sintetizado é deslocado 
45min audio rever 2 etapa 
➔ 3º Etapa: Elongação (polimerização) 
◆ Ribozima une aminoácidos: ligação peptídica 
● Aproveita energia do desligamento do aminoácido do RNAt do sítio P 
● Realiza duas catálises: 
○ Desligamento do aminoácido do RNAt do sítio P 
○ Ligação peptídica 
◆ Enzima translocase: movimenta o ribossomo ao longo do RNAm 
● Consome um molécula de GTP 
● Sitio A: Onde entra o aminoácido 
○ O peptídeo é deslocado para o sítio P 
● Sítio P: Peptídeo que está sendo sintetizado é deslocado 
◆ Quando ocorre a ligação peptídica, o aminoácido se desliga de um aminoácido 
do RNAt do sítio P 
● Essa energia é suficiente para fazer a ligação peptídica 
○ A enzima que faz a ligação peptídica, portanto, não precisa de 
energia 
● A energia para síntese proteica é para o deslocamento do ribossomo e 
para a ativação do AA. 
● A energia para fazer a ligação peptídica ocorre ao mesmo tempo em que 
o aminoácido é desligado do transportador 
◆ Desligamento do RNAt com o AA fornece energia para uma enzima do tipo 
ribozima 
● A ribozima realiza a catálise tanto da ligação peptídica quanto do 
deslizamento do AA com o RNAt 
◆ Quando o ribossomo reconhece o códon de terminação ele desfaz o complexo e 
termina a síntese proteica 
➔ Mecanismos pós-tradução 1h 06 min 
◆ Glicosilação 
● Proteínas podem seguir diferentes caminhos: 
○ São sintetizadas e vão para dentro da vesícula do retículo 
○ Ou ficam associadas na membrana do retículo endoplasmático 
● A proteína pode forma uma vesícula com o retículo e ir para o Golgi 
 
 
○ Sofrem um endereçamento para o local onde essas proteínas vão 
agir 
○ RER -> Golgi cis -> Golgi medial -> Golgi trans 
● Proteínas no complexo de Golgi 
○ Sofrem glicosilação 
◆ Proteínas ganham açúcar (recebem resíduos de açúcar) 
● Formam uma glicoproteína 
○ Quase 100% das proteínas sofrem glicosilação 
◆ Importante para sinalizar o endereçamento das proteína 
◆ Ocorre no Golgi 
◆ É um tipo de processamento pós-tradução 
◆ Proteólises: remoção de AA’s iniciais 
● Insulina 
○ Necessita de um processamento pós-tradução para que obtenha 
uma conformação final que possa ser fisiologicamente útil 
● Após a glicosilação, há outra proteólise 
◆ Folding de proteínas: 
● Empacotamento de proteínas 
● Chaperonas: proteínas que ajudam proteínas a terem sua conformação 
final 
○ Complexam-se com outras proteínas para obtenção da 
conformação final 
○ Há gasto de energia: consumo de ATP 
◆ Ubiquitinação 
● Degradação de proteínas 
● Proteínas têm uma vida útil 
○ Ubiquitinação promove a degradação 
● Sinal de degradação: proteína-alvo recebe ubiquitinas (peptídeos) 
○ Endereça a proteína para proteossomos 
◆ Esses proteossomos possuem enzimas proteolíticas que 
realizam a proteólise 
● Ligação de proteínas com ubiquitinas feita por outras enzimas 
○ Há gasto de ATP 
Controle da Expressão gênica - Prof. Ricardo 
➔ Expressão gênica 
◆ DNA (gene/ informação armazenada) 
● mRNA (intermediário da informação) 
○ Proteína (produto final) 
◆ Efeito biológico 
➔ Controle da expressão gênica em eucariotos 
◆ Estratégia da regulação 
● Regulação temporal 
 
 
○ Quando determinado gene/ proteína só é expressa em um 
determinado “tempo” 
○ Ferritina: Proteína citoplasmática de armazenamento de Fe²+ 
○ Alta quantidade de Fe²+ livre: menor expressão de ferritina 
○ Baxa qtd. De Fe²+ livre: maior expressão de ferritina 
○ A expressão do gene da ferritina varia em função da 
concentração livre de ferro no citoplasma 
● Regulação espacial 
○ Quandoa expressão do gene/ proteína é diferente dependendo 
do tipo celular 
○ Somente para organismos pluricelulares 
○ Fibras musculares, neurônios e adipócitos 
◆ Mesmo conteúdo de DNA (mesmo genoma) 
● Regulação espacial da expressão gênica 
○ Composição de proteínas distintas 
◆ Há mecanismos de controle da 
expressão gênica 
➔ Níveis de controle da expressão gênica 
◆ 
◆ DNA -> RNA transcrito 
● Controle transcricional 
◆ RNA -> RNAm 
● Controle do processamento do RNA 
◆ mRNA (núcleo) -> mRNA (citoplasma) 
● Controle de exportação do mRNA para o citoplasma 
◆ mRNA -> mRNA inativo 
● Controle de degradação do mRNA 
◆ mRNA -> Proteína 
● Controle de tradução 
◆ Proteína -> Proteína ativa/ inativa 
● Controle da atividade da proteína (processamento da proteína) 
○ Ex: Ativação do zimogênio, fosforilação, ubiquitinação 
 
 
➔ Controle da expressão gênica pelo início da transcrição 
◆ Estrutura da cromatina 
● DNA na célula está associado com complexos proteicos denominados 
histonas: nucleossomo 
● Heterocromatina: DNA compactado (genes de baixa expressão) 
● Eucromatina: DNA descompactado (genes de alta expressão) 
● Empacotamento do DNA x Transcrição 
○ RNA polimerase e fatores de transcrição têm acesso restrito ao 
DNA empacotado 
○ Quanto mais compactado está o DNA, menor a ação da 
DNA-polimerase e menor a expressão gênica 
○ Modificação química das histonas por acetilação (enzima HAT) 
favorece a formação de eucromatina: favorece a alta expressão 
◆ Acetilação favorece a descompactação 
○ Efeito reversível (enzima HDAC) 
◆ Favorece a formação de heterocromatina 
● Exemplos da expressão pelo empacotamento do DNA 
○ Inativação do cromossomo X 
◆ Totalmente compactado 
◆ Metilação do DNA 
● Metilação de citosinas 
○ Mamíferos 
◆ Metilação do DNA ocorre principalmente em citosinas de 
dinucleotídeos CG 
● Citosina vira 5-Metilcitosina 
◆ A metilação de regiões de DNA ricas em CG (“ilhas CpG”) 
causa redução da expressão de genes próximos 
◆ Padrão de metilação de citosinas é transmitido às células 
filhas 
● Alta metilação de DNA: células diferenciadas, 
celulas reprodutivas, zigoto 
○ Muitos genes já foram desligados 
● Baixa metilação de DNA: células tronco 
embrionárias 
◆ Desmetilação ocorre apenas em situações muito 
particulares 
◆ Ligação de proteínas a ​enhancers 
● Enhancers são sequências específicas de nucleotídeos do DNA ao qual 
se podem ligar proteínas que aumentam a transcrição do RNAm 
○ Proteína liga no enhancer 
○ Fita de DNA se dobra 
○ Esse proteína se liga no complexo da RNA polimerase 
 
 
○ Aumenta a transcrição 
● A região controladora da expressão de genes eucarióticos contém 
enhancers: 
○ Sequências específicas de DNA 
○ Sítios de ligação de proteínas ativadoras da transcrição 
○ Exemplos: 
◆ GRE: elemento de resposta glicocorticóide 
◆ MRE: elemento de resposta a metais 
◆ CRE: elemento de resposta a cAMP 
● Promotor: Sítio do DNA onde o RNA-polimerase se liga 
● Enhancer são sítios de ligação da proteína 
○ Liga uma proteína que irá auxiliar na transcrição 
● Ação de enhancers 
○ Situam-se na região controladora do gene 
◆ A região controladora do gene fica,principalmente, antes 
da parte codificante 
○ Facilita a ligação de RNA polimerase (estímulo da transcrição 
○ Independe da distância ao promotor 
○ Forma um alça: liga o enhancer com o promotor (sítio onde a 
RNA polimerase se fixa) 
● Complexos de transcrição 
○ Ativadores de transcrição 
○ Proteínas de modificação da cromatina (por exemplo: histona 
acetil transferase) 
○ Coativadores (mediadores) 
○ Fatores de transcrição (proteínas acessórias da RNA polimerase) 
● Enhancers podem recrutar enzimas de regulação de modelagem de 
histonas 
● Relação com hormônios 
○ Hormônios glicocorticóides 
◆ O receptor ativado liga-se ao DNA (enhancer GRE) 
◆ GRE: elemento de resposta a glicocorticóides 
◆ Ativação da transcrição de genes específicos 
◆ Controle temporal da expressão gênica 
Audio 61 min 
➔ Degradação do mRNA 
◆ Silenciamento gênico 
◆ Regulação por miRNA (micro RNA) 
● miRNA: pequenos RNA não codificantes de proteína 
● Fita simples de miRNA processado se associa a RISC (complexo 
silenciador induzido por RNA) 
○ RISC é um agregado de proteínas que tem propriedade catalítica 
● RISC ativo degrada mRNAs com complementariedade ao miRNA maduro 
 
 
● Degradação do miRNA 
➔ Controle da tradução 
◆ Ferritina: proteina de armazenamento intracelular de Fe²+ 
◆ Em baixo Fe²+, a tradução da ferritina é inibida 
◆ Baixo Fe²+: ativação da proteína IRE-BP 
● IRE-BP é uma proteína circulante na célula 
◆ IRE-BP liga-se ao mRNA da ferritina e bloqueia ribossomo 
◆ Active IRE-binding protein localiza-se antes de AUG 
● Iron-responsive element (IRE) se liga a essa proteína 
● Dificulta a ligação do RNAr com o RNAm ,atrapalhando a tradução 
◆ Alto ferro, a tradução da ferritina é ativada 
◆ Alto ferro: inibição da proteína IRE-BP 
◆ IRE-BP desliga-se do mRNA da ferritina, permitindo a tradução 
➔ Controle da atividade da proteína G 
◆ Regulação enzimática por fosforilação 
 
Aplicação da biologia molecular 
➔ Ciclo do PCR 
◆ Replicação in vitro 
◆ Tubo no aparelho 
● Aquecimento (95 graus) 
○ Desnaturação do DNA 
○ Rompimento das ligações de hidrogênio 
● Resfriamento (50 graus) 
○ Primers se ligam ao DNA: anelamento 
● Reaquecimento (72 graus) 
○ Temperatura ótima da Taq polimerase 
◆ Começa a sua atividade 
● Extensão da fita molde 
○ Extensão da fita 
◆ Eletroforese 
● Separa por tamanhos 
○ DNA grande: pequena migração 
○ DNA pequeno: grande migração 
● Detecção do DNA amplificado 
● Examina o tamanho dos DNA pela migração de um polo positivo para um 
polo negativo 
○ DNA: carga negativa 
◆ PCR em tempo real 
● Detecção por fluorescência 
● Não necessita de eletroforese 
 
 
◆ PCR: polimerase chain reaction 
● Aumenta a síntese de DNA 
● Amplificação 
● Aplicações (exames laboratoriais) 
○ HIV 
◆ Realização de um PCR indica a presença de um molde: 
HIV positiva 
◆ Teste de paternidade (VNTR ou DNA fingerprint) 
● Sequência repetitiva 
● Gene - região intergênica - gene 
○ Região intergênica (VNTR): DNA genômico 
◆ VNTR: Número de Repetições Variáveis Tandem 
◆ Possui muitas repetições de nucleotídeos 
◆ Número de repetições na região intergênica é individual 
● Paternidade 
○ Possuímos duas cópias do mesmo cromossomo (homólogos) 
○ Em um cromossomo há o mesmo número de repetições do pai e 
da mãe 
○ A mãe sempre é considerada verdadeira 
● Análise forense 
◆ Análise da expressão gênica 
● Análise da expressão gênica por meio da quantidade de RNAm 
○ Controle de expressão gênica é diferente de um tecido para outro 
● Diferentes quantidades de RNAm gera quantidades diferentes de 
proteínas 
● Obtenção de um parâmetro da quantidade de proteínas pela quantidade 
de RNAm que varia em função do tempo ou do tecido 
● Pool de RNAm (simples fita) 
○ Torna-se dupla fita (cDNA) por transcrição reversa 
◆ Realiza-se PCR 
◆ Utiliza-se iniciadores específicos e ocorre amplificação 
somente do gene de interesse 
● Quanto maior a amplificação, maior a quantidade 
desse gene 
➔ Método de Sanger 
◆ Princípio 
● Reação de PCR 
● Com nucleotídeo normal e modificado 
○ Sem a hidroxila no carbono 3’ 
◆ Interrompe a replicação da fita 
○ Possui fluorescência 
◆ É possível determinar qual o último nucleotídeo modificado 
entrou na fita 
 
 
◆ Ligação do DNA original com nucleotídeos modificados (ddNTP’s) 
● Não possuem hidroxila livre 
○ Impede o crescimento do fragmento de DNA em replicação pela 
ação da DNA polimerase 
● Adição de indicadores 
○ Fluorescência na ponta 
● Separação dos fragmentos por tamanho 
○ Máquina querealiza a eletroforese 
➔ Clonagem 
◆ Conceito amplo 
● Qualquer material genético que se introduz em outro organismo 
◆ Ovelha Dolly 
● Núcleo de uma ovelha + citoplasma de outra ovelha 
● Célula ovo implantada em uma terceira ovelha como barriga de aluguel 
● Dolly: rápido envelhecimento 
○ Encurtamento dos telômeros 
◆ OGM transgênicos 
● Insere-se uma qualidade melhorada em uma espécie 
● OGM por meio de clonagem 
○ DNA de um organismo é introduzido em outro 
◆ Bactérias geneticamente recombinadas 
➔ DNA recombinante 
◆ Conjunto de técnicas que permitem a manipulação de moléculas de DNA 
● Material genético manipulado 
➔ Produção de insulina 
◆ Passado: fonte animal 
◆ Hoje: insulina recombinante 
● Inserção do gene da insulina humana em bactérias 
● Plasmídeo: DNA circular da bactéria 
○ Abertura do plasmídeo por enzima de restrição 
○ Inserção do gene de interesse 
○ Liga por DNA ligase: Liga fragmentos de Okazaki 
◆ Liga DNA do plasmídeo com o DNA de interesse 
○ Introdução desse complexo por choque térmico 
◆ Poros da membrana da bactéria se abrem e se fecham 
○ É possível produzir anticorpos recombinantes 
➔ Terapia gênica (as 3 primeiras não são de fato terapias gênicas) 
◆ Clonagem 
● iPSC: célula tronco pluripotente induzida 
○ Cultiva-se células doadoras 
◆ Transferem-se os genes das células-tronco para as 
células doadoras 
◆ Ocorre a transformação de fibroblastos em células-tronco 
 
 
○ Célula - tronco: célula que dá origem a diferentes tecidos 
○ Geralmente, pega-se célula de pele: fibroblasto 
◆ Coloca o plasmídeo para superexpressar: produzir uma 
proteína mais do que geralmente é produzida 
◆ O plasmídeo tem uma sequência que o corpo humano 
reconhece 
◆ A célula humana (fibroblasto) entende que o material 
genético é dela 
◆ Fibroblasto começa a produzir fatores de transcrição que 
regulam o controle da expressão gênica de células-tronco 
◆ Fibroblasto vira célula-tronco 
◆ Fibroblasto , então, pode virar qualquer célula 
◆ Utilização 
● Medicina regenerativa 
○ Construir um tecido a partir de 
células-tronco 
● Diagnóstico para transformação psiquiátricas 
○ Utiliza-se um pedaço de pele que virará um 
neurônio 
○ A pele tem o mesmo genoma das células 
do tecido cortical 
◆ CRISPR-Cas9 
● Defesa de bactérias 
○ Entra material genético de vírus 
○ A célula reconhece esse material genético e cliva pelo sistema 
CRISPR-Cas9 (complexo proteína/ RNA) 
● CRISPR: sequência guia de RNA 
● Cas9: proteína 
● Inserção da Cas9 dentro da célula eucariótica com o RNA desenhado 
com o gene de interesse (esse RNA é chamado de CRISPR) 
○ Esse RNA vai parear com gene de interesse e a Cas9 vai cortar 
◆ Pode ocorrer uma deleção 
● Knockout: não funcionamento do gene por deleção 
◆ Corte das duas fitas 
● DNA sabe que tem um corte mas não sabe com o 
que substituir 
● DNA fica doido 
● Se tiver alguma sequência de DNA livre, ele usa 
essa sequência para tapar o buraco 
○ Correção de mutações 
○ Utilização 
◆ Curar a anemia falciforme 
◆ RNA de interferência (RNAi) e microRNA 
 
 
● Silenciamento ou knockdown 
○ Redução dos níveis de RNAm de determinados genes que podem 
ser responsáveis por uma patologia 
● RNA sintético é inserido dentro da célula 
○ Esse RNA pareia com o RNAm de interesse 
○ RNAm pareado -> Complexo RISC degrada o RNAm 
○ Complexo RISC (RNA induced silencing complex) 
● Sequência sintética: RNAi 
● Sequência parecida: microRNA 
● Amiloidose familiar por transtirretina 
● Doença de Hunting