histologia e processamento

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PROCESSAMENTO DE 
MATERIAL HISTOLÓGICO
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIA DA SAÚDE
ESCOLA TÉCNICA DE SAÚDE
 
Professora. Claudenice Rodrigues
PROCESSAMENTO
 Introdução O procedimento mais utilizado no estudo dos
tecidos ;
 É a preparação de cortes histológicos que podem ser
examinados com o auxílio de um microscópio.
 Este processo consiste numa série de etapas que busca a
obtenção de um corte que preserve ao máximo as
características da estrutura viva, além de uma longa vida
útil.
ETAPAS DO PROCESSAMENTO
 Obtenção de amostras (Eutanásia) 
 Fixação 
 Desidratação 
 Diafanização
 Impregnação 
 Inclusão 
 Microtomia
 Coloração 
 Montagem 
Coleta de amostras 
 Eutanásia e retirada de órgãos 
 Intervalo entre óbito e processamento: 
entre 2h e 6h, 
quanto maior o tempo mais as células 
se degradam e mudam sua estrutura;
 Dimensão do fragmento: na amostra em 3
dimensões, uma das superfícies precisa ter
no máximo 5mm, para que a peça consiga
receber a substancia a qual foi mergulhada
para conseguir ser conservada;
 Formato: reto;
 Instrumento de corte: lamina de bisturi;
 Limpeza do fragmento;
 Cuidados durante a manipulação;
 Acondicionamento e identificação: cacete,
plástico, vidro;
Coleta de amostras 
Fixação 
 Função: Preservação de uma amostra de material biológico o
mais próximo do seu estado natural por meio de um fixador
adequado.
 Fixadores são substancias químicas que mantém a
integridade do tecido após a morte do animal.
 As finalidades básicas dos fixadores são: 
▪ Evitar alterações da constituição química celular,
fixar proteínas, inativar enzimas proteolíticas
responsáveis pelos fenômenos de autólise e
permitir o estudo da célula como se estivesse in
vivo.
▪ A característica da fixação é o endurecimento do
tecido.
▪ O fixador usual é o FORMOL A 10% NEUTRALIZADO.
▪ O formol é uma mistura homogênea composta por
água e pelo menor aldeído existente, o metanal.
Propriedades de um bom fixador 
 Facilidade de penetração; 
 Atuação sobre enzimas intracelulares; 
 Ação sobre microrganismos; 
 Capacidade de insolubilizar constituintes celulares; 
 Efeitos sobre a peça: encolhimento/dilatação,
enrijecimento, distorção da arquitetura, ligação a
corantes.
Fixadores Comumente Utilizados
 Formalina a 10% tamponada 
 Ácido pícrico 
 Bicromato de potássio 
 Ácido acético 
 Álcool etílico absoluto 
 Clorofórmico 
 Glutaraldeido
 Tetróxido de ósmio 
▪ Combinações de agentes fixadores (mistura 
fixadora) 
➢ Bouin
➢ Helly
➢ Zenker
➢ Carnoy
CUIDADOS ESPECIAIS DURANTE A FIXAÇÃO 
 Relação volume de fixador/ volume de amostra:
usar um volume 20 vezes maior de formol do que o
tamanho da peça;
 Tempo de exposição de fixador: mínima de 24h;
 Imersão completa do fragmento: ao ser imerso
na substancia vários fragmentos, devido à baixa
densidade ou a presença de ar, pode ter parte de sua
amostra absorvido o fixador ou não;
 Espessura do tecido; 
Descalcificação
Definição: remoção dos sais de cálcio que se
encontram depositados nos tecidos orgânicos sem
alteração da sua estrutura celular.
Justificativa: A descalcificação, por remover os sais de
cálcio, se faz necessária para tecidos mineralizados,
pois os cristais cálcio destroem o fio
da navalha, criando dentes que impedem a confecção
de
bons cortes e levam ‡ formação de artefatos técnicos,
impedindo a análise histológica adequada.
Agentes descalcificadores:
➢ Nítrico,
➢ Fórmico,
➢ Tricloacético,
➢ Clorídrico,
➢ Pícrico,
➢ EDTA,
➢ Sulfossalicílico.
Escolha do descalcificador: A escolha do método de descalcificação depende
da urgência, do grau de mineralização, do interesse da investigação, das
técnicas de coloração que se pretende empregar e do tipo de fixador
utilizado. Quanto mais rápida for a ação de um descalcificador, pior será a
preservação morfológica do tecido.
Desidratação 
Definição: A desidratação consiste na remoção da água dos tecidos, 
pois as substâncias previamente utilizadas para inclusão em parafina 
não se combinam homogeneamente com a água. 
Soluções empregadas: 
➢ Álcool 
➢ Acetona 
➢ Éter 
➢ Clorofórmio 
➢ Óxido propileno
Cuidados especiais: 
Uso de reagentes de qualidade confiável: se a amostra 
continuar com presença de água, todo o procedimento será 
prejudicado; 
Respeito aos períodos adequados: 6h à 24h dependendo do 
tamanho da peça. 
Procedimento: submersão sucessiva de concentrações 
crescentes de álcool. 
Relação volumétrica: O volume de álcool utilizado deverá ser 
de 10 a 20 vezes maior que o volume da peça.
Turvação do solvente
Prolongamento do tempo de exposição: de 1h à 6h 
dependendo do volume. 
Riscos de manipulação e destinação dos reagentes.
Impregnação
Definição: preenchimento interno da 
amostra com parafina liquida. 
➢ Parafina penetra nos vasos, nos
espaços intercelulares e no interior
das células, impregnando o tecido
e tornando mais fácil a obtenção
dos cortes.
Cuidados especiais 
• Com a estufa: ajuste e verificação da 
temperatura (60º C), frequência de abertura; 
• Com a parafina: filtração e fusão completa; 
• Com o fragmento: identificação e temperatura 
da estufa . 
• Processamento automático ou manual
Inclusão 
Definição: A inclusão se baseia em colocar, os tecidos que foram
previamente infiltrados em parafina no interior de um molde que já
contém parafina líquida com a superfície a ser seccionada (a ser
cortada ao micrótomo) para baixo
Cuidados especiais: 
• Posicionamento da amostra no bloco 
• Identificação da amostra 
• Resfriamento progressivo do bloco 
• Conservação em baixa temperatura 
• Reciclagem da parafina
Microtomia
Definição: Para permitir a análise dos tecidos ao microscópio de
luz, eles devem ser seccionados em fatias bem finas e uniformes.
A espessura ideal varia de acordo com o objetivo de estudo;
Recomenda -se a espessura de 4 a 5 mm na rotina dos
laboratórios.
O instrumento capaz de confeccionar cortes com tal precisão é o
micrótomo.
Considera-se, ainda, que em alguns modelos possua duas
manivelas, uma manivela de ajuste e outra de corte.
Tipos de micrótomo: rotativo, corrediça, ultramicrotomo, e
congelamento.
MICROTOMIA
Coloração
Definição: A utilização de corantes 
é fundamental para visualizar os 
tecidos ao microscópio de luz. 
Após a microtomia, as células e o
material extracelular são
habitualmente transparentes e os
corantes melhoram a visualização
das estruturas teciduais.
Corantes: Corantes são compostos orgânicos
aromá ticos formados pelo cromógeno e
autódromo e coram seletivamente os
componentes teciduais, como as células e a
matriz extracelular. De acordo com a carga única,
os corantes podem ser ácidos, básicos ou
neutros.
As colorações podem se caracterizar segundo a
ação:
• Diretas: quando o corante penetra no interior
dos tecidos sem tratamento intermediário com
mordente.
• Indiretas: quando é necessário um tratamento
intermediário com uma solução mordente para o
corante se ligar ao tecido durante a coloração.
Podem ser classificadas segundo o Tempo: 
Progressiva: a coloração é feita gradualmente sem a
necessidade de se proceder sua diferenciação, isto é, que
seja retirado o excesso do corante.
Regressiva: hipercora-se o tecido e posteriormente
remove-se seu excesso pela diferenciação para melhor
visualização dos elementos teciduais.
Passos pré e pós Coloração
• Captação do corte distendido e distensão complementar; 
• Desparafinização e hidratação; 
• Coloração; 
• Desidratação e diafanização finais; 
• Montagem
Montagemdos cortes 
• Preparo das laminas e lamínulas: lavagem, 
conservação e secagem; 
• Preparo e aplicação da substancia adesiva;
• Montagem da lamínula.