TÉCNICAS INOVADORAS NA DETECÇÃO DE MICRORGANISMOS

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SALVADOR 
 2018 
 
 
 
 
 UNIVERSIDADE ESTÁCIO DE SÁ 
 CURSO: NUTRIÇÃO 
 DANIELA RAMOS 
 LUANA SENA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 TÉCNICAS INOVADORAS NA DETECÇÃO DE MICRORGANISMOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 SALVADOR 
 2018 
Introdução: 
 
A elaboração deste trabalho tem conforme objetivo apresentar a importância da 
detecção prematura de microrganismos patógenos para indústria assim como na nossa 
alimentação, por meio de técnicas que podem ser inovadoras tais como: métodos 
imunológicos, moleculares e bioquímicos. 
 
Os métodos imunológicos podem ser pelo meio de imunocapturas, imunomagnetismo, 
imunoimobilização, imunocromatográfia. Os procedimentos moleculares são por sondas 
genéticas, Reação de Polimerase em Cadeia (PCR) e identificação por ribotipagem e os 
procedimentos bioquímicos que poderão ser feitos de forma manual, semi-automatizado 
ou totalmente automatizados. 
 
Independente do método utilizado, todos servem para detecção de tipos de 
microrganismos na indústria, fazendo com que haja uma maior segurança para o 
consumidor (através de fiscalizações por órgãos competentes) com relação a um 
determinado tipo de alimento e/ou medicação. 
Esses tipos de técnicas evitam desperdícios, pois através das analises é possível verificar 
qual o melhor local de armazenamento, distribuição e validade dos produtos, por 
exemplo. Com relação às doenças, os tipos de detecção tem um papel fundamental na 
prevenção e tratamento das mesmas. 
 
DEFINIÇÃO 
 
Conforme observado anteriormente, as técnicas inovadoras podem ser divididas em três 
métodos, o imunológico, molecular e bioquímico, os quais se explicam por: 
 
MÉTODO IMUNOLÓGICO: Esses métodos apresentam grande sensibilidade e 
elevada especificidade e, em função disso, vêm sendo empregados cada vez mais em 
Microbiologia de alimentos. Para a detecção de antígenos do patógeno ou anticorpos 
específicos produzidos pelo hospedeiro levaram ao desenvolvimento do EL ISA ( Enzy 
me Linked Immuno Sorbent Assay). O princípio básico da técnica consiste na 
imobilização de um dos reagentes (anticorpo ou antígeno) em uma fase sólida. Após a 
adição da amostra, o outro reagente ligado a uma enzima reagirá com o complexo 
antígeno - anticorpo. O s imunocomplexos são revelados ao adicionar-se o substrato da 
enzima e um cromógeno formando um produto colorido. Os resultados do EL ISA são 
expressos objetivamente pelas absorbâncias obtidas de espectrofotômetros, não 
dependendo de leituras subjetivas. 
Atualmente várias doenças infecciosas e parasitárias são pesquisadas pelos métodos 
imunológicos, sobretudo o ELISA. G raças à sua simplicidade (possibilidade de 
automação) pode ser usado para analisar grande número de indivíduos com um 
volume pequeno de amostra. 
 
MÉTODO MOLECULAR: Sendo possível, sondas genéticas: Nessa técnica é 
necessário submeter os microrganismos a um tratamento em que seu material genético é 
liberado e separado em duas fitas simples. Em seguida, adicionam-se sondas, que são 
fragmentos de DNA ou RNA específicos para o patógeno alvo, marca das com enzimas, 
normalmente cromogênicas e, quando há hibridização com a sonda, há desenvolvimento 
de cor e, portanto, a presença do microrganismo investigado é de tectada. Ou Reação de 
Polímeras e em Cadeia (PCR): É uma técnica muito utilizada em microbiologia para 
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amplificação do material genético de microrganismos. A PCR reproduz in vitro a 
habilidade natural de replicação do DNA, podendo ser repetida em larga escala. A 
metodologia requer, primeiramente, o conhecimento, pelo menos parcial, do DNA alvo 
de um de terminado organismo para o desenvolvimento de oligonucleotídeos 
iniciadores (primers) ou de sondas que irão hibridizar-se especificamente com a 
sequência alvo. 
 
MÉTODOS BIOQUÍMICOS: São baseados na avaliação da capacidade dos 
microrganismos de utilizarem determinados substratos ou de produzirem determinados 
metabólicos. Existem no mercado diversos “kits”, na maioria miniaturizados onde os 
testes são executados com pequenos volumes de meio de cultura, os quais se encontram 
na forma desidratada ou liofilizada, e são reidratados pela adição de pequeno volume de 
amostra a ser testada. Após a incubação faz-se a leitura dos resultados, normalmente 
através de uma combinação de números obtidas de acordo com o resultado de cada um 
dos testes que faz parte do sistema. Cada combinação de números corresponde a um 
microrganismo diferente. 
 
APLICAÇÃO DAS TÉCNICAS 
Os prosseguimentos exposto dentre mais de 1.000 vírus e 135 bactérias tem 
disponibilizado o desenvolvimento de testes diagnósticos promissores. Este amplo 
avanço da biologia molecular e celular vem atuando em várias da microbiologia. Os 
microarranjos de DNA (DNA microarray) vêm sendo utilizado à expressão dos genes 
dos agentes infecciosos e do hospedeiro em resposta à infecção e poderá resultar em 
descobertas de novos biomarcadores da doença ou de novos alvos para o diagnóstico. 
Os microarranjos de D NA são definidos como pequenos suportes sólidos nos quais 
milhares de sondas estão imobilizadas ou ligadas de forma organizada em posições 
conhecidas. Usualmente o suporte sólido é uma lâmina de vidro especial de 
microscopia, mas também pode ser um chip de silicone. O DNA é impresso, depositado 
ou sintetizado diretamente no suporte. Essas sondas podem ser produtos de PCR ou 
oligonucletídeos e os alvos podem ser produtos de PCR, DNA genômico, RNA total, 
RNA amplificado, DNA complementar, DNA plasmidial ou, simplesmente, amostras 
clínicas. Estudos recentes têm mostrado a aplicação dos microarranjos de DNA na 
identificação de diversos microrganismos: vírus influenza e adenovírus, Entamoeba 
histolytica, E. Dispar, Giárdia lamblia e Cryptosporidium parvum. A tecnologia de 
microarranjos de DNA apresenta-se como um método promissor para detecção de genes 
de resistência antimicrobiana e resistência mutacional. A detecção e identificação de 
genes de resistência à tetraciclina foram recentemente demonstradas por este método, 
por exemplo. Quando a PCR é usada para detecção de DNA em amostras clínicas, os 
microarranjos podem ser usados para identificar os produtos amplificados por 
hibridização com sondas patógeno-específicas. Um exemplo desta aplicação é a 
realização da PCR com iniciadores universais, capazes de detectar múltiplos patógenos 
simultaneamente e a utilização dos microarranjos para verificar a amplificação de uma 
bactéria ou vírus específico. Adicionalmente, esse modelo vem sendo trabalhado para o 
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desenvolvimento de um método para detecção de anticorpos específicos (antigen 
microarrays for serology). Nesse modelo, um arranjo de proteínas de vários agentes 
infecciosos estaria disponível para a ligação com anticorpos presentes em soro. Isso 
possibilitaria uma triagem sorológica completa do paciente. Já foi desenvolvido um 
microarranjo com antígenos específicos de Toxoplasma
gondii, citomegalovírus, 
herpesvírus 1 e 2 e vírus da rubéola, cujos resultados foram favoráveis para a detecção 
de imunoglobulinas. A citometria de fluxo, desenvolvida nos anos 50, é um método 
automatizado para avaliar as propriedades ópticas (dispersão da luz e fluorescência) de 
partículas e/ou células que fluem numa suspensão líquida. O sistema operacional do 
citômetro de fluxo é constituído de fontes luminosas do tipo laser e de um conjunto de 
lentes que proporciona a avaliação de múltiplos parâmetros. Células variadas podem ser 
identificadas utilizando-se anticorpos monoclonais conjugados à fluorocromos, que se 
liga a antígenos da superfície celular ou intracitoplasmáticos. Quando a célula intersecta 
o laser, ocorre um processo de dispersão fotônica e/ou emissão de fluorescência. O 
tamanho e a complexidade celular (aspectos morfológicos) são avaliados mediante a 
dispersão luminosa frontal e lateral, respectivamente. Os sinais fluorescentes são 
decorrentes da positividade dos antígenos de membrana nas células examinadas que são 
captados, analisados e quantificados por um programa de computador. A citometria de 
fluxo te m sido usada para quantificar antígenos virais dentro ou sobre superfícies de 
células infectadas. Além disso, ácidos nucléicos virais podem ser detectados e 
quantificados por hibridização instituem suspensões celulares e, simultaneamente, a 
citometria pode, também, identificar fenotipicamente quais células estão infectadas. Isso 
tem sido utilizado para a pesquisa de muitos vírus, principalmente HIV e 
citomegalovírus. Outra aplicação da citometria de fluxo é a detecção de imunoglobulinas 
específicas, presentes na amostra graças à utilização de microesferas ligadas aos 
antígenos dos microrganismos. Os anticorpos da amostra são detectados após a adição 
de um segundo anticorpo conjugado a um corante fluorescente. O sistema Luminex, 
baseado neste método da citometria de fluxo, foi projetado para atender às necessidades 
da medicina do laboratório, porém vem sendo também utilizado no ambiente da 
pesquisa. Dessa forma, vários microrganismos podem ser detectados diretamente pelos 
citômetros de fluxo. Essa tecnologia já tem sido aplicada com sucesso para a 
identificação de um vasto número de bactérias presentes em sangue, urina, exsudatos, 
bile, lavado brônquico e até em fezes. Recentemente, a pesquisa dos anticorpos 
específicos a HI, vírus sincicial respiratório a Trypanosoma cruzi, a Leishmania chagasi, 
ao Mycobacterium tuberculosis, Cryptosporidium hominis e C. parvum, entre outros, 
tem sido realizada por esta metodologia. A versatilidade da citometria de fluxo propicia 
um grande número de aplicações na microbiologia clínica e isso pode rá ser visto em um 
futuro próximo. Os aparelhos são agora mais fáceis de utilizar e também mais 
econômicos. Além disso, segundo Raoult, o desenvolvimento de citômetros portáteis 
poderá facilitar suas aplicações, por exemplo, em aeroportos e portos para a 
identificação rápida de doenças e a detecção de microrganismos usados como agentes 
de bioterrorismo. A análise do proteoma (conjunto de todas as proteínas codificadas do 
genoma de um organismo) tem criado oportunidades para identificar as proteínas-alvo, 
que são expressas diferencialmente na saúde e na doença. Esses novos conhecimentos 
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estão relacionados às vias de sinalização celular, conjuntos de proteínas reguladoras, 
modificações pós-transducionais, bem como outras informações cruciais sobre os 
estados fisiológicos e fisiopatológicos de células e organismos. Atualmente, as 
principais técnicas utilizadas na proteômica são a eletroforese bidimensional e a 
espectrometria de massa. 
O aprimoramento dessas técnicas tem possibilitado a detecção de proteínas com alta 
Sensibilidade e especificidade em pequenos volumes de amostra, como no sangue e na 
urina. 
A proteômica tem trazido informações importantes sobre os microrganismos, auxiliando 
no desenvolvimento de novos métodos para diagnosticar, eficientemente, algumas 
doenças em estágios latentes e, assim, facilitar o tratamento e a cura dos pacientes. 
Proteínas secretadas foram identificadas em isolados clínicos comuns e analisadas como 
potenciais antígenos para o imunodiagnóstico da tuberculose, mostrando elevada 
sensibilidade e especificidade. Uma triagem sorológica que pudesse detectar a infecção 
pré- clínica da tuberculose permitiria o tratamento precoce, reduzindo a transmissão da 
doença. Da mesma forma, por meio da análise do soro de pacientes com a síndrome 
respiratória aguda severa, foram identificadas proteínas que poderão ser usadas para o 
diagnóstico e o desenvolvimento de vacinas. 
Apesar de a maioria dos estudos a respeito da identificação e caracterização de 
marcadores biológicos específicos estarem voltada para o diagnóstico de cânceres, 
Alzheimer e doenças autoimunes, a análise proteômica pode rá ser útil para o 
diagnóstico precoce de doenças infecciosas e parasitárias e para o acompanhamento da 
evolução do tratamento. A utilização da espectrometria de massa para o diagnóstico de 
calicivírus tem sido proposta, porém ainda é uma promessa. 
 
Vantagens e Desvantagens 
Inúmeros métodos de análise pode m ser utilizados, sendo comum que estes métodos 
sejam classificados em tradicionais e rápidos. Os métodos tradicionais foram 
desenvolvidos há mais de um século e, desde então, vêm sendo utilizados como 
métodos de rotina nos Laboratórios de Microbiologia de Alimentos. Já os métodos 
rápidos surgiram na década de 70, como consequência da necessidade de se simplificar 
e/ou automatizar os métodos tradicionais, melhorando a produtividade e abreviando o 
tempo para obtenção de resultados. A essas vantagens aliam-se outras, como 
sensibilidade e especificidade. Métodos tradicionais são trabalhosos, demorados, 
exigem mão de obra intensiva e treinada e requerem preparo de material, gerando 
resíduo. Além disso, estão sujeitos a falhas humanas, devido às etapas de preparo do 
material, execução da análise, leitura e interpretação dos resultados. Há várias razões 
para isto, dentre elas, que o microrganismo pode está presente em baixas concentrações 
em relação à flora competidora existente e o alimento ser uma matriz complexa 
causando interferência. Sendo assim, os métodos tradicionais utilizam as técnicas de 
pré-enriquecimento, para elevar a população viável, enriquecimento seletivo, para 
selecionar o microrganismo alvo e a semeadura, para obter colônias isoladas e detectar o 
alvo. Por esses motivos e por outros, como, crescente demanda dos países importadores, 
procura por produtos frescos e produtos com validade curta, houve uma necessidade de 
desenvolver métodos mais fáceis e rápidos para a detecção de patógenos em alimentos. 
Métodos rápidos oferecem ganhos em tempo e mão de obra, através da simplificação do 
trabalho, aumento da capacidade analítica, facilidade de uso, estocagem e descarte, 
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levando a uma maior produtividade. São padronizados, dando uma melhor 
reprodutibilidade e repetibilidade e possui Certificado de Análise, necessário para a 
acreditação do laboratório pela ISO 17025, através do INMETRO. Outros pontos 
importantes são a redução de tempo para obtenção dos resultados e aumento na 
confiabilidade, mesmo que necessitem de enriquecimento. Todos estes fatores levam a 
uma redução de custos internos. As principais vantagens dos métodos tradicionais são
consideradas desvantagens para os métodos rápidos, como exemplo, sofrem menos 
interferência da matriz, não necessitam de aprovações por agências de validação 
internacionalmente aceitas e não precisam ser verificados na fase de implantação. São 
considerados “métodos de referência”. Apesar de todas as vantagens mencionadas 
acima, os métodos rápidos para detecção de patógenos são considerados TRIAGEM e 
todo resultado positivo é apenas PRESUNTIVO, necessitando de confirmação pelos 
métodos tradicionais de cultura. Além da vantagem de simplificar o trabalho do 
microbiologista, os kits comercializados por empresas idôneas são submetidos a 
rigorosos testes de qualidade, o que garante sua confiabilidade e reprodutibilidade. O 
universo dos métodos rápidos está se expandido e mudado, contudo inovações 
precisaram ser feitas para atender as novas demandas do mercado, como análises 
quantitativas e detecção de microrganismos específicos. 
Métodos rápidos do uso de material inovador: 
 
VANTAGENS 
 
1- Agilizam o trabalho no laboratório 
 Prontos para uso; 
 Requerem muito suprimentos (vidraria, equipamentos); 
 Demanda menos mão de obra; 
 Possíveis de automação; 
2- Pode m reduzir significativamente o tempo para obtenção de resultados 
 Alguns “pulam” etapas do método convencional; 
 Alguns dão respostas instantâneas 
3- São padronizados 
 Melhor reprodutibilidade; 
 Melhor repetibilidade; 
4- Têm certificado de fabricação 
 Necessários para validação de sistemas de qualidade em laboratórios; 
 Necessários para aceitação e acreditação de laboratórios (ISO17025); 
 
DESVANTAGENS 
 
1- Podem sofrer interferência da matriz alimentar; 
2- Custo elevado de material; 
3- Necessitam de aprovação por agências de validação internacionalmente aceitas. 
 
 
 
 
 
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Referências 
FRANZ R. Novak, ALMEID A, João Aprígio Guerra. Teste alternativo para 
detecção de coliformes em leite humano ordenhado. 
GONÇALVES, A.; FE KL, G. S.; B ITT ENCOURT, J.V. M. Utilização de culturas 
padrões de Salmonela para diagnóstico molecular. Arq. Ciênc. Saúde UNIPAR, 
Umuarama, v.17, n. 1, p. 15-18, j a n./a br. 2013. 
 
https://foodsafetybrazil.org/deteccao-de-patogenos-metodos-tradicionais-x-metodos-
rapidos/ 
https://quimicadealimentos.files.wordpress.com/2009/08/metodos-rapidos-de - 
analise-microbiologica.doc