Bioquímica de Enzimas - Resumão 2

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Bioquímica – P2: 
 
 
- Introdução: 
 Todas as enzimas são proteínas, com exceção de um pequeno grupo de moléculas de 
RNA catalíticas. Se esta é desnaturada ou dissociada nas suas subunidades, geralmente 
a atividade catalítica é perdida. 
 Algumas enzimas precisam de um componente químico adicional chamado de cofator, 
que pode ser um ou mais íon inorgânicos como ferro, magnésio, manganês ou zinco, 
 Dependem de uma molécula orgânica denominada coenzima, que age como 
carreadores transitórios de grupos funcionais específicos e são derivados das 
vitaminas, nutrientes orgânicos. 
 O grupo prostético é uma coenzima ou um íon metálico que se ligue muito 
firmemente. Uma enzima completa cataliticamente ativa junto com a sua coenzima 
e/ou íon metálicos é denominada holoenzima. A parte proteica de uma dessas 
enzimas é chamada de apoenzima ou apoproteína. 
 
 
- Eficiência da catálise por enzimas: 
 Aumento da concentração dos reagentes na superfície da enzima: “atração” dos 
reagentes para interação com a enzima. 
 Orientação correta dos reagentes (substratos): parte da energia de ativação 
representa o posicionamento adequado dos reagentes para que haja contato entre os 
átomos corretos. O sitio ativo da enzima favorece o posicionamento correto dos 
reagentes. 
 Aumento da reatividade dos reagentes: as cadeias laterais (R) dos aminoácidos da 
enzima ou co-fatores e coenzimas podem interagir diretamente com os substratos, 
dando-lhes carga elétrica ou polarizando-os, tornando-os quimicamente mais reativos, 
ou ainda cedendo ou transferindo certas funções químicas. 
 Indução de deformação física no substrato, por contato com as cadeias laterais (R) 
dos aminoácidos das enzimas, que desestabilizam a molécula do substrato e facilitam 
o rompimento de laços covalentes 
 
- Classificação: 
 
 
 
- Funcionamento: 
 Catálise enzimática é essencial, pois nas condições biológicas as reações não 
catalisadas tendem a ser lentas, visto que a maioria das moléculas são estáveis nas 
condições internas das células com pH neutro, temperatura amenas e ambiente 
aquoso. 
 A molécula que liga no sítio ativo e sobre a qual a enzima age é chamada 
de substrato. A superfície do sítio ativo é delimitada por resíduos de aminoácidos com 
grupos nas cadeias laterais que ligam o substrato e que catalisam sua transformação 
química. 
- Fatores que afetam a atividade enzimática: 
1. Condições do meio que afetam estabilidade protéica: 
• pH 
• temperatura 
2. Tempo da reação 
3. Concentração dos reagentes 
• a enzima 
• o substrato 
• co-fatore(s) 
pH: o pH ótimo de uma enzima reflete variações no estado de ionização de resíduos de 
aminoácidos do sítio ativo. A enzima está pelo menos parcialmente desnaturada em pHs 
afastados do pH ótimo. Quando o substrato é uma molécula ionizável, o pH ótimo da enzima 
também reflete o seu estado de ionização. 
Temperatura: 
Concentração: A [substrato] cai na mesma 
razão em que a [produto] aumenta em função 
do tempo. A enzima existe sob duas formas: 
enzima livre E e complexo enzima-substrato ES. 
No início da reação, a [E] livre cai e a do 
complexo [ES] aumenta e atinge um máximo, 
em que não há mais [E] livre no meio. Nessa 
situação (indicada no retângulo cinza), diz-se 
que a enzima está saturada (só existe no 
complexo ES). A velocidade da reação é a 
máxima. 
 
 
 
 
- Reação: 
 
 E, S e P representam a enzima, substrato e produto, 
ES e EP são complexos transitórios da enzima com o 
substrato e com o produto. 
 A função do catalisador é aumentar a velocidade 
da reação, mas a catálise não afeta o equilíbrio. O ponto de 
partida da reação direta e inversa é chamado de estado 
fundamental, que é a contribuição que uma molécula dá 
para a energia livre do sistema. O estado de transição é o topo da curva de energia, 
ponto no qual ocorre o decaimento para o estado S ou para o estado P. Já o estado de 
ativação é a diferença entre os níveis energéticos do estado basal e do estado de 
transição. 
 Quando uma reação tem várias etapas a velocidade final é determinada pela etapa 
com maior energia de ativação, que é denominada de etapa limitante da velocidade. 
A energia de ativação é uma barreira energética para as reações químicas e sem estas 
barreiras as macromoléculas poderiam reverter espontaneamente para formas 
moleculares mais simples. 
 
- Velocidade de reação e equilíbrio: 
 
 
 
 A concentração do substrato [S] é um fator que afeta a velocidade das reações 
catalisadas por enzimas. Mede-se a velocidade inicial (Vo), que pode ser explorada em 
função de [S], que é ajustada pelo investigador. 
 Em concentrações baixas de [S], Vo aumenta em pequenas quantidades em resposta 
ao aumento da [S]. É atingido um ponto além do qual um aumento em Vo é 
insignificantemente pequeno com o aumento de [S]. Esta região está próxima a 
velocidade máxima (Vmáx). 
 A enzima primeiro combina-se de modo reversível com o substrato, formando um 
complexo enzima-substrato em uma etapa reversível e relativamente rápida: 
 Então o complexo ES é rompido em uma segunda etapa 
que é mais lenta, fornecendo a enzima e o produto P: 
 
 A segunda reação deve limitar a velocidade da reação total, por ser mais lenta, e 
então a velocidade total deve ser proporcional à concentração da espécies que reagem 
na segunda etapa, isto é, ES. 
 A velocidade inicial máxima de uma reação (Vmáx) ocorre quando quase toda a 
enzima estiver presente como complexo ES e [E]. 
 
 
- Gráfico dos duplos recíprocos: 
 
Equação de Lineweaver-Burk é usada para as enzimas que obedecem a equação de Michaelis-
Menten: 
 
 
O gráfico de 1/Vo x 1/[S] (gráfico dos duplos recíprocos) 
é representado por uma linha reta. Essa linha tem uma 
inclinação de Km/Vmáx, um intercepto de 1/Vmáx no 
eixo de 1/Vo e um intercepto de ~1/Km no eixo de 1/[S]. 
Este gráfico permite uma determinação mais acurada de 
Vmáx que pode ser obtida apenas aproximadamente 
pelo gráfico Vo x [S]. 
 
 
 
 
 
 
 
O km pode variar muito de enzima para enzima e até mesmo para diferentes substratos de 
uma mesma enzima e seu termo muitas vezes é empregado como uma indicação da afinidade 
da enzima pelo seu substrato. 
O significado real de Km depende de aspectos específicos do mecanismo de reação, tais como 
número e as velocidades relativas dos passo individuai da reação. Assim, para reações com 
duas etapas utiliza-se: 
 
Quando K2 é limitante da velocidade, K2 << K-1 (equilíbrio) e Km se reduzem a K-1/K1, que é 
definida como a constante de dissociação, Kd, do complexo ES. Nesses casos, Km representa 
uma medida da afinidade da enzima pelos substrato no complexo ES. Porém, essas condições 
não se aplicam para a maioria das enzimas. Algumas vezes K2 >> K-1 e então Km = K2/K1. 
 
 
Vm também varia muito de uma enzima para outra, se uma enzima reage de acordo com o 
mecanismo de duas etapas Vm é equivalente a K2[Et], onde K2 é a etapa limitante da 
velocidade. Porém, quando a maior parte da enzima está na forma de EP na saturação e Vmáx 
= K3 [Et] é útil definir uma constante da velocidade mais geral, Kcat para descrever a 
velocidade limitante de qualquer reação catalisada por enzima na saturação. Se a reação 
tiver várias etapas e uma é a etapa limitante, Kcat é equivalente à constante de velocidade 
para aquela velocidade 
limitante (Kcat = K2). 
Kcat é uma constante de 
velocidade de primeira 
ordem e possui unidades 
recíprocas do tempo, pois é 
equivalente ao número de 
moléculas de substrato que 
se convertem em produto 
em certa unidade de tempo 
em uma única molécula de 
enzima quando ela for 
saturada com o substrato. 
Para se comparar as 
eficiências catalíticas de 
enzimas diferentes utiliza-
se: Kcat/Km para duasreações. Esse parâmetro é 
chamado de constante de 
especificidade e é a 
constante da velocidade para a conversão E + S até E +P, quando [S] for menor que Km. Logo: 
 
Nesse casso Vo depende da concentração de dois reagentes, 
[Et] e [S], por isso é uma equação de velocidade de segunda 
ordem com unidades M-1s-1. 
 
 
- Inibição: os inibidores enzimáticos são agentes moleculares que interferem com a catálise, 
diminuindo ou parando as reações enzimáticas. 
 
 
 
Mecanismos: 
 
 
 
 
 
 
1) Inibição Reversível: 
 
 Inibição Competitiva: se ligam ao centro ativo da enzima e não há alteração da 
Vmáx, mas Km aumenta devido a um fator alfa. 
 
Um inibidor competitivo compete com o substrato para o sítio ativo de 
uma enzima e enquanto o inibidor (I) ocupa o sítio ativo, ele impede a 
ligação do substrato à enzima, A inibição competitiva pode ser analisada 
pela cinética do estado estacionário. 
Os inibidores competitivos são compostos cujas estruturas moleculares e 
combinam com a enzima para formar o complexo EI, sem participar da 
catálise. Pode ser analisada segundo: 
 
Como o inibidor se liga reversivelmente à enzima, a competição pode se 
tornar favorável ao substrato pela adição de mais substrato. Quando [S] é 
muito maior que [I], a probabilidade de uma molécula do inibidor se ligar 
à enzima será menor e a reação terá um Vmáx normal. Porém, 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Inibição Incompetitiva: se ligam em regiões diferentes do sítio ativo e diminui a 
Vmáx e o Km 
 
Um inibidor incompetitivo liga-se a um sítio distinto do sítio ativo do 
substrato e ao contrário do inibidor competitivo, liga-se apenas no 
complexo ES. 
 
Em altas concentrações de substrato, Vo se aproxima de Vmáx/ α’ e 
assim um inibidor incompetitivo diminui a Vmáx e o Km aparente 
 
 
 
 
 
 
 
 Inibição Mista: se ligam em regiões diferentes do sítio ativo 
 
Um inibidor misto também se liga em um sitio distinto do sítio ativo do substrato, mas ele se 
liga tanto em E quanto em ES. Geralmente afeta tanto Km quanto Vmáx, Quando alfa = alfa' 
ocorre uma inibição não-competitiva. 
 
Geralmente afeta tanto Km como a Vmáx, quando α = α’, 
define-se como uma inibição não-competitiva. A inibição 
não-competitiva afeta Vmáx mas não o Km 
 
 
 
2) Inibição Irreversível: são aqueles que se ligam de forma covalente com ou destroem um 
grupo funcional de uma enzima, ou aqueles que formam uma associação não-covalente 
particularmente estável. 
 
 Proteicos: inibidores proteicos de enzimas proteolíticas desempenham importantes 
papéis fisiológicos. Entre esses estão as serpinas, inibidores de serino-proteinases, e 
as cistatinas, inibidores de cisteíno-proteinases. Em ambos os casos, os inibidores 
funcionam como “falsos substratos”, sendo reconhecidos e clivados pelas enzimas, 
que ficam “aprisionadas” num complexo com o inibidor. 
 Não Proteicos 
 Inibidores Suicidas: são relativamente pouco reativos até se ligarem ao sítio ativo de 
uma enzima específica. Em vez de ser transformado no produto normal, o inibidor é 
convertido em um composto muito reativo que se combina irreversivelmente com a 
enzima. Utilizam o mecanismo da reação enzimática normal para inativar a enzima. É 
muito utilizado nas drogas. 
 
 
- Especificidade: 
 
Enzimas Reguladoras: a atividade das enzimas reguladoras é modulada de várias maneiras e 
existem duas grandes classes de enzimas reguladoras nas vias metabólicas. As enzimas 
alostéricas funcionam por meio da ligação não-covalente reversível de compostos 
reguladores chamados moduladores alostéricos, que são pequenos metabólitos ou co-fatores. 
Outras enzimas são reguladas por meio de uma modificação covalente reversível. 
Além disso, as enzimas são ativadas ou inibidas quando estão ligadas por outras proteínas 
regulatórias. 
 
 
Modulação Covalente: Ao contrário da 
alosteria, em que os efetores ligam-se à 
enzima apenas por ligações fracas, na 
modulação covalente a enzima é 
modificada covalentemente por duas 
outras enzimas: uma quinase fosforila a 
enzima às custas de ATP, e uma 
fosfatase remove o grupo fosfato da enzima fosforilada. A modulação covalente é 
energéticamente cara, pois necessita duas outras proteínas e ATP para regular a atividade de 
uma enzima. Ao contrário, na alosteria a enzima é controlada pelas concentrações relativas de 
seus efetores e a afinidade da enzima por estes. 
 Ativação de zimogênios: é um caso específico de modulação covalente exclusivo de 
alguns tipos de enzimas proteolíticas. 
 Zimogênios: as proteases são sintetizadas numa forma inativa por estar em uma 
conformação desfavorável, com bloqueio ou desalinhamento dos resíduos do sítio 
catalítico. 
 Conformação desfavorável: resulta de porções adicionais da cadeia poli-peptídica, que 
devem ser retirados para que a proteína assuma a forma ativa. Podem acontecer duas 
situações, combinadas ou não: 
• Zimogênio tem uma extensão N-terminal (pro-segmento) que precisa ser 
retirada. Pro-segmentos podem ter de 2 a 150 resíduos a.a. 
• Zimogênio tem cadeia polipeptídica única, que precisa ser clivada 
(proteólise limitada) para formar duas ou mais subunidades. 
 Conversão do zimogênio à protease ativa pode resultar da ação proteolítica de outra 
protease, ou de alteração do pH ou temperatura do meio, ou ainda, da adsorção do 
zimogênio à uma superfície negativa. Esses eventos determinam mudança 
conformacional e/ou auto-hidrólise pela própria protease. 
 Ativação é irreversível, e por isso, energeticamente cara para o organismo.