7 Técnicas de Hibridizaçao

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Técnicas de transferência e hibridização 
 Nomeadas na forma de trocadilhos 
◦ Southern blot (DNA) 
◦ Northern blot (RNA) 
◦ Western blot (Proteínas) 
 
 São técnicas capazes de identificação da 
sequência-alvo em meio a uma mistura 
complexa. 
 São sequências de DNA ou RNA marcadas, 
geralmente, com isótopos radioativos. 
 
◦ Trítio (H3) 
 
 DNA: timidina 
 
 RNA: uridina 
 As membranas com amostras de DNA ou RNA 
são expostas a uma emulsão fotográfica. 
 
 Como o DNA ou RNA estão marcados com H3, 
serão revelados por raio-X. 
 O Southern blot é uma técnica que permite 
obter informação sobre a massa molecular e 
a quantidade relativa de uma determinada 
sequência de DNA. 
 
 A técnica, desenvolvida por Edwin Southern, é 
uma combinação de eletroforese em gel do 
DNA (após digestão com enzimas de 
restrição), transferência deste para uma 
membrana e hibridização com uma sonda 
marcada (radioativa ou fluorescente). 
 
 https://www.youtube.com/watch?v=3I9wzwj
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Transferência 
Hibridização 
(1) Os fragmentos de DNA separados em um gel e 
desnaturados (NaOH 0,5 M) para formar fitas-
simples. 
(2) As bandas são transferidas para uma membrana de 
nylon ou nitrocelulose por capilaridade, mas 
mantém a posição relativa no gel original. 
 
(3) O gel é colocado sobre um papel de filtro 
Whatman, cujas pontas estão imersas em tampão 
de transferência SSC (NaCl 3M/citrato). 
 Sobre o gel coloca-se a membrana de nylon e 
sobre ela uma pilha de papel absorvente comum. 
Por fim coloca-se uma placa de plástico resistente 
e um peso sobre tudo (overnight). 
 
Procedimento: 
(4) O aparato de hibridização é cuidadosamente 
desmontado e a membrana é colocada sob pré-
hibridização. 
 
 Pode ser empregado soluções prontas ou de Ficoll, 
polivinil pirrolidona e albumina sérica. 
 
 Esta etapa é fundamental pois reduz a ligação 
inespecífica da sonda de DNA ou RNA (background), isto 
porque os sítios restantes de ligação são bloqueados. 
 
 O procedimento pode ocorrer durante 1 hora a 42ºC. 
Procedimento: 
(5) A membrana deve ser seca e o DNA fortemente ligado ao 
nylon, o que é obtido com a exposição do material ao UV. 
 
Em seguida coloca-se a membrana num saco 
para congelamento contendo a solução de 
hibridização e a sonda marcada. 
 
Após várias horas ou dias a membrana, já com 
a sonda aderida às regiões com 
complementaridade, é retirada, lavada e 
colocada em contato com um filme raio X 
 
O filme é retirado, revelado e as bandas 
observadas indicarão as posições no gel 
onde houve reconhecimento de sequências 
pelas sonda. 
 O Northern blot estuda o perfil de expressão de 
RNAm ou determinar se determinada sequência do 
DNA pode ser transcrita em um RNAm. 
 
 Pode determinar onde, quando e quanto de 
determinado RNAm está presente numa dada 
amostra. 
 
 É uma das formas mais simples de determinar em 
que altura certos genes estão a ser expressos em 
sistemas vivos. 
 
 Neste processo, o RNA é separado numa eletroforese 
em gel, desnaturado com formaldeído, transferido 
para uma membrana e detectado de forma similar ao 
DNA no Southern blot. 
 
 O Western blot usa o mesmo princípio do Southern 
blot e do Northern blot mas é aplicado a proteínas. 
 
 Uma mistura de proteínas são separadas usando 
SDS-PAGE. 
 
 As proteínas após a transferência (blot) são 
hibridizadas e especificamente identificadas por 
reação com anticorpos (sondas). 
 
 Para evitar as ligações inespecíficas das sondas a 
membrana é tratada com soro albumina fetal (BSA) e 
Tween 20. 
 
 
 
 
 
Anticorpo primário: após o bloqueio a 
membrana é tratada com uma solução 
anticorpo primário, BSA e salina, sob leve 
agitação. 
Anticorpo secundário: após enxague dos 
1ºAb, a membrana é exposta ao anticorpo 
secundário que é específico ao anterior. 
Este é ligado a uma enzima reveladora. 
Revelação: a enzima reveladora geralmente é a peroxidase 
que pode ser revelada por autoradiografia ou ELISA. 
 
 
 
 
 
 Diagnóstico de doenças genéticas (RFLP) 
 DNA - Fingerprint 
 Detecção por 
Northern e Western 
blot