eletroforese em gel de poliacrilamida

Prévia do material em texto

ELETROFORESE EM GEL DE 
AGAROSE 
ELETROFORESE 
 A eletroforese é uma técnica de separação de 
partículas. 
 
ELETROFORESE 
 As ácidos nucléicos tem polaridade. 
 Para a análise de DNA, a 
técnica fundamenta-se no 
princípio da molécula possuir 
carga negativa em valores de 
pH neutro. 
 
 Quando imerso em uma matriz 
de gel submetida a um campo 
elétrico, o DNA migra em 
direção ao pólo positivo. 
 
 A velocidade de migração é 
dependente do tamanho do 
fragmento de DNA analisado. 
 
Por isso em um dado momento da migração 
eletroforética moléculas de tamanhos diferentes se 
encontram em diferentes pontos da matriz. 
MATRIZ EM GEL 
 O tipo de matriz que é usada depende do 
tamanho dos fragmentos de DNA que se 
pretende separar e visualizar. 
 
 Gel de agarose para a separação de 
fragmentos que variam de 0,2 kb a 50 kb. 
 
 Gel de poliacrilamida para separação de 
pequenos fragmentos de até 1kb. 
 
ETAPAS PARA REALIZAÇÃO DA 
ELETROFORESE 
1. Preparação do gel 
2. Aplicação das amostras 
3. Corrida eletroforética 
4. Registro dos resultados 
1. PREPARAÇÃO DO GEL DE AGAROSE 
A agarose é um polissacarídeo 
extraído de uma alga marinha 
vermelha. 
 
Quando solubilizada e aquecida, 
a agarose forma um gel incolor 
semelhante a uma gelatina. 
 
Esse gel funciona como uma 
malha que “segura” as moléculas 
durante a migração. 
GEL DE AGAROSE 
 Dependendo da concentração de agarose, tem-se 
uma diferença no gradiente de separação. 
 
 
 
 
 
 
GEL DE AGAROSE 
 Quanto maior a concentração do gel, maior 
a capacidade de distinguir fragmentos, ou 
seja, maior a definição. 
 
GEL DE AGAROSE 
 Normalmente o gel de agarose é utilizado para a 
separação de fragmentos que variam de 0,2 kb a 
50 kb (lembrando que 1 kb = 1000 pares de bases). 
 
GEL DE AGAROSE 
O gel de agarose é feito por meio mistura de um 
tampão e agarose, não apresentando toxicidade. 
 
A sua polimerização é rápida e o gel pode ser reciclado 
após o uso, isto é, pode ser reutilizado na elaboração 
de outros géis. 
 
Além disso, a eletroforese em gel de agarose pode ser 
usada como método analítico ou preparativo, isto é, 
quando o fragmento de DNA é recuperado e purificado 
a partir do gel. 
 
Entretanto, dependendo do método utilizado para a 
visualização do DNA, o gel de agarose pode ser 
desvantajoso 
PREPARAÇÃO DO GEL 
 Dissolve-se uma quantidade em gramas do pó 
de agarose, justando-se a concentração 
apropriada para separar os fragmentos de DNA 
presentes na amostra, em um volume de 
tampão de eletroforese. 
 
 
 
 
 
 
 
PREPARAÇÃO DO GEL DE AGAROSE 
 
 Tampões são TAE (Tris-acetato-EDTA) e o TBE 
(Tris-borato-EDTA) utilizados para diluir o gel e 
durante a corrida eletroforética. 
 
 
PREPARAÇÃO DO GEL DE AGAROSE 
 Aquecer a agarose com o tampão em micro-
ondas, até que a solução fique homogênea e 
transparente. 
 
PREPARO DO GEL DE AGAROSE 
 Aguarda-se a diminuição da temperatura até 
aproximadamente 50ºC. 
 
 Verte-se em uma forma/molde de eletroforese. 
PREPARO DO GEL DE AGAROSE 
 No momento de verter o gel, pensar!!! 
 Géis Finos 
 Solidificam mais rápido 
 Produzem melhores resultados do que espessos. 
 Cora mais rápido e concentra a corrida em uma 
distância mais curta. Isto aumenta o contraste na 
resolução e apresenta o DNA mais brilhante. 
 É mais delicado ao manuseio. 
 Géis Espessos 
 Géis mais espessos demoram para solidificar. 
 Os géis mais espessos tem menos contraste. 
 Distribuem o DNA a longa distância, diminuindo a 
largura da banda. 
 
 
 
FORMAS DE ELETROFORESE 
APLICAÇÃO DO ETBR 
 O método usual para se visualizar o 
DNA em géis de agarose é por coloração 
com brometo de etídeo (EtBr). 
 
 Esse corante se intercala entre as bases 
dos ácidos nucléicos e, na presença de 
luz Ultra Violeta (entre 260 e 360nm), 
brilha em vermelho alaranjado (590nm). 
 
 Com este método pode-se detectar uma 
quantidade igual ou maior que 10 ng de 
DNA e a intensidade de fluorescência 
emitida é proporcional à concentração 
de DNA presente na amostra. 
 
 O brometo de etídeo pode ser utilizado de 3 
diferentes formas: 
 
 Aplicado diretamente no gel (não 
recomendado pois pode interferir na 
corrida e contamina toda a vidraria; 
 
 Aplicado no tampão da amostra; 
 
 Aplicado após a corrida quando o gel é 
submergido em solução de EtBr. 
Gel banhado em EtBr EtBr aplicado no 
gel ou no Loading 
buffer 
CORANTE SAFER 
 Corante não mutagênico revelado em luz LED. 
PREPARO DO GEL 
 Sobre a solução ainda morna coloca-se um 
pente que servirá como molde para 
produzir diversos poços no gel. 
• o pente produz pequenos poços onde o DNA será 
aplicado. 
PREPARO DO GEL 
• Os poços não chegam a atravessar o gel e 
servirão como reservatórios onde as 
amostras de DNA serão aplicadas. 
 
 o Ao esfriar e polimerizar, 
a agarose fica com o 
aspecto turvo e com 
resistência diretamente 
proporcional à 
concentração de agarose 
utilizada. 
A forma contendo o gel é colocada no interior da 
cuba de eletroforese. 
 
PREPARO DA CORRIDA ELETROFORÉTICA 
FONTE 
PENTE 
POÇOS 
GEL 
TAMPÃO 
Na cuba o gel encontra-se entre fios de platina que 
atuam como cátodo e ânodo provocando a 
passagem de corrente elétrica gerada por uma 
fonte de eletricidade. 
PREPARO DA CORRIDA ELETROFORÉTICA 
 Adiciona-se o mesmo tampão (tampão de corrida) 
usado para fundir a agarose em quantidade 
suficiente para que o gel fique totalmente imerso 
tomando-se o cuidado para que o nível de tampão 
fique pelo menos 1 mm acima do gel. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 A seguir retira-se cuidadosamente o pente. 
2. APLICAÇÃO DA AMOSTRA 
 Antes da aplicação, as amostras de DNA deverão 
ser misturadas a um tampão de amostra. 
 A amostra, além de DNA contém: 
Loading Buffer 
-Corantes, azul de 
bromofenol e/ou xileno 
cianol. 
- Facilitam a aplicação da 
amostra no gel. 
- Auxiliam no 
monitoramento da corrida. 
 
Reagentes de alta 
densidade 
- sacarose, glicerol ou 
ficol. 
 
-Asseguram que a 
amostra de DNA entre 
no poço pela força da 
gravidade. 
2. APLICAÇÃO DA AMOSTRA 
Loading buffer: 
2. APLICAÇÃO DA AMOSTRA 
LADDER 
 É um marcador de peso molecular. 
 Para permitir uma estimativa visual do tamanho dos 
fragmentos de DNA de uma dada amostra. 
 O ladder é uma mistura de diversos fragmentos de 
DNA de tamanhos e concentrações conhecidos, 
gerados a partir da digestão de plasmídeos com 
enzimas de restrição. 
 
 Permite comparar, o tamanho dos fragmentos 
presentes na amostra analisada. 
 
 Existem no mercado diversos tipos de ladders, que 
variam no tamanho dos fragmentos de DNA presentes 
na solução. 
Legenda: Eletroforese em gel de 
agarose à 1,2%. 
M: Marcador de peso molecular de 
1kb (Amresco®), 
1-8: DNA genômico extraído a partir 
dos pacientes pesquisados, 
4: Ausência de amostra. 
Figura 1. Gel de eletroforese de amostras de fungos coletados no Parque do 
Ingá. 
Gel de agarose a 1% corado com brometo de etídeo. Canaleta 1: Ladder 1kb, 
2: Amostra 5 sem diluição, 3: Amostra 5 diluição a 1:10, 4: Amostra 5 diluída 
a 1:50, 5: Amostra 5 diluída a 1:100, 6: Ladder, 7: Amostra6 sem diluição, 8: 
Amostra 6 diluída a 1:10, 9: Amostra 6 diluída 1:50, 10: Amostra 6 diluída a 
1:100. 
Gel de agarose a 2,5% corado com brometo de etídeo apresentando a 
padronização e otimização da reação de PCR. Amplicons gerados com os primers 
ITS1-ITS4. Canaletas 1: Ladder de 100 pb; 2: controle positivo com DNA 
Lambda; 3: MgCl2 e sem diluição, 4: MgCl2 e diluição a 1:10; 5: MgCl2 e diluição 
1:50, 6: MgCl2 e diluição a 1:100; 7: sem MgCl2 e sem diluição; 8: sem MgCl2 e 
diluição a 1:10, 9: sem MgCl2 e diluição a 1:50. 10: Ladder de 100 pb. 
Figura 2: Padronização e otimização da reação em cadeia da polimerase. 
• Após a aplicação das amostras, encaixa-se a tampa 
da cuba contendo os cabos que permitirão a conexão 
entre a cuba e a fonte de corrente contínua. 
3. CORRIDA ELETROFORÉTICA 
 Para se determinar a voltagem que será utilizada 
deve-se computar a distância entre os eletrodos e 
não o comprimento do gel. 
 
 Geralmente usa-se uma voltagem de 1 a 5 V/cm. 
 
 Voltagens excessivas ou muito baixas interferem na 
mobilidade do DNA e causam distorções na 
migração. 
 
 Para cubas rotineiramente utilizadas pela maioria 
dos laboratórios de pesquisa, a voltagem varia entre 
50 e 110 V. 
A VOLTAGEM É DETERMINADA NA FONTE 
 É acoplado os fios a fonte e a cuba de corrida. 
Fonte 
Cuba com eletrodos 
A VOLTAGEM É DETERMINADA NA FONTE 
(-) 
(+) 
 Durante a corrida o DNA sairá do 
poço, penetrará no gel, migrando em 
direção ao pólo positivo. 
 
 Com isso os fragmentos serão 
separados de acordo com o tamanho. 
 
 Os fragmentos menores migram mais 
rapidamente que o fragmentos 
maiores, pois eles apresentam maior 
facilidade de atravessar o poros da 
matriz de agarose em direção ao pólo 
positivo. 
 
 Enquanto que fragmentos de mesmo 
tamanho migram praticamente 
juntos. 
 
4. REGISTRO DOS RESULTADOS 
 
 Após a visualização os resultados geralmente são 
foto documentados. 
 
 No caso de géis corados com brometo de etídeo, as 
fotos devem ser adquiridas sob luz ultravioleta. 
 
 É utilizado filme Polaroid (branco e preto) ou um 
software capaz de transformar em imagem a 
intensidade relativa de fluorescência emitida pelas 
bandas de DNA captadas por uma câmera 
fotográfica digital. 
 
 Pode-se ainda utilizar uma câmara e a luz UV. 
 
 Uma câmera acoplada registra a foto do gel. 
Transiluminador 
4. REGISTRO DOS RESULTADOS 
4. REGISTRO DOS RESULTADOS 
REFERÊNCIAS 
 WATSON, J. D. DNA recombinante : genes e 
genomas, Porto Alegre: Artmed, 2009. 
 
 BROWN, T. A.; FERREIRA, H. B.; PASSAGLIA, 
L. Clonagem gênica e análise de DNA : uma 
introdução - 4. ed. / 2003Porto Alegre: Artmed, 
2003. 
 
 https://www.youtube.com/watch?v=5ppWF0Y16r
4 
 
 https://www.youtube.com/watch?v=qLHsEkiGJO
w