10 Marcadores Moleculares

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Marcadores Moleculares 
• São sequências no DNA que revelam polimorfismo; 
• Identificam; 
• Caracterizam indivíduos geneticamente 
relacionados 
• Excluem a relação de parentesco. 
 
Marcadores Moleculares 
• Na prática os marcadores moleculares tem grande 
aplicação: 
 
– Vínculo genético: incluir ou exclui relação de parentesco 
– Melhoramento genético: seleciona características 
desejáveis 
– Diagnóstico e reprodução assistida: identifica doenças 
genéticas e parasitárias, predisposição a doenças, 
sexagem (animal). 
– Biologia da conservação: identifica o pool gênico a fim de 
realizar cruzamentos entre populações com baixo fundo 
genético ou identifica risco de extinção. 
Polimorfismo nas populações 
• Variação maior que 1% em um locus que determina 
uma característica, mas que não conduz a morte. 
Origem dos polimorfismos 
• São gerados por mutações: 
 
– Pontuais ou inserção e 
deleção, 
 
– Macro-rearranjos: 
translocações, inversões, 
deleções. 
• Regiões utilizadas como marcadores 
moleculares. 
 
 
 
 
• Éxons: regiões gênicas (genes)- Doenças/Caract. 
• Íntrons: regiões não-gênicas – Fingerprinting 
Marcadores Moleculares 
Marcadores Moleculares 
• São herdáveis, sejam eles éxons ou íntrons. 
• Reprodutibilidade: capacidade do experimento ser 
replicado. 
• Polimórfico: Apresentar variação entre indivíduos. 
• Codominância: capacidade de diferenciar os 
homozigotos dos heterozigotos. 
• Distribuição uniforme ao longo do genoma: 
Quanto maior a distribuição e detecção ao longo 
do genoma, melhor é a avaliação do polimorfismo. 
• Discriminação: Capacidade de detectar diferenças 
entre indivíduos estreitamente relacionados. 
• Aplicabilidade: O marcador precisa ser capaz de 
detectar de maneira fácil e rápida, um grande 
número de indivíduos. 
 
Características de um bom marcador 
molecular 
RFLP 
 Polimorfismo de tamanho de fragmentos de restrição 
• Detecção de mutações/polimorfismos com uso de 
enzimas de restrição. 
Baseado na presença 
de sítios de restrição 
Clivagem de DNA 
genômico gerando 
fragmentos de DNA 
de tamanhos 
diferentes. 
Analisados por 
eletroforese ou 
Southern blot. 
Detecção por sondas 
radioativas. 
Revela posições diferentes na 
eletroforese (pb) 
RFLP 
 Polimorfismo de tamanho de fragmentos de restrição 
• Rastreamento de doenças genéticas em famílias 
ou indivíduos. 
Anemia Falciforme 
RFLP 
 Polimorfismo de tamanho de fragmentos de restrição 
VNTR 
 Variável Número de Repetições in tandem 
• São regiões de número de nucleotídeos variável 
(10-100 pb) repetidas em tandem detectadas por 
corte com enzimas de restrição (RFLP). 
GCATCGAACG 
Minissatélites 
Quando clivado por 
enzimas de 
restrição gera 
fragmentos de DNA 
de tamanhos 
diferentes 
Enzimas comumente empregadas HaeIII, PstI e HinfI 
• Sequência repetida: CCCTT 
VNTR 
 Variável Número de Repetições in tandem 
No perfil de 
corrida 
eletroforética é 
mostrado 
polimorfismo. 
VNTR 
 Variável Número de Repetições in tandem 
 
Desvantagens no uso de RFLP e VNTR 
• Uso de DNA genômico integro 
• Amostra em grande quantidade (100-500ng) 
• O genoma estudado deve ser conhecido. 
• O RFLP é analisado por Southern blot, assim as 
sondas limitam a quantidade de fragmentos 
analisados. 
 
 
 
• Identifica heterozigotos. 
• Pode ser testado in sílico. 
• O VNTR analise vários locis ao mesmo tempo. 
Vantagens no uso de RFLP e VNTR 
RFLP-PCR 
• RFLP analisada por PCR ao invés de Southern blot. 
 
• Amplifica um marcador e em seguida cliva com enzimas de 
restrição. 
 
• A eletroforese demonstra o polimorfismo, a interpretação é 
dada por presença/ausência de bandas de DNA e tamanho 
(pb). 
 
• Uma grande vantagem é a distinção de heterozigotos. 
• Aplicações: 
– Diagnóstico de doenças genéticas 
– Identificação de espécies de microrganismos 
RFLP-PCR 
• Amplicon: 216 pb 
• Enzima de restrição: BsmFI 
• (CC) - Homozigoto Acometido: 2 bandas com 216pb (CC) – Lactase não-persistente 
• (CT) Heterozigoto : 3 bandas: 2 mutantes 90pb, 126 pb, 1 normal 216pb. Lactase persistente. 
• (TT) Homozigoto normal: duas bandas 90pb e 126pb. Lactase persistente 
 
216 pb 
90 pb 126 pb 
Diagnóstico de 
Intolerância a 
lactose detecta a 
ausência de 
mutação no gene 
MCM6 
O gene MCM6 
desliga o gene 
LTC que 
codifica a 
lactase. 
Quando 
mutado perde 
a função. 
RFLP-PCR 
Identificação de Aspergillus flavus com uso de primers IGS 
(universal) e corte com enzima BglII 
A técnica é baseada no uso de vários primers de sequência 
única e arbitrária (desconhecida) e baixa temperatura de 
anelamento para garantir a estrigência (baixa 
especificidade). 
5’ 
 
 
3’ 
3’ 
 
 
5’ 
A Ladder 
1 2 3 
2 
 
1 
 
3 
 
 
RAPD 
Amplificação aleatória de DNA polimórfico 
 
Como interpretar os resultados? 
Os resultados são 
interpretados de 
acordo com a 
presença ou ausência 
de bandas. 
 
RAPD 
Amplificação aleatória de DNA polimórfico 
 
O tamanho (pb) e o 
número de bandas 
também é utilizado 
para avaliar a 
diversidade. 
• A principal aplicação esta relacionada ao estudo da variabilidade 
genética, geralmente dentro da mesma espécie, ou seja, identifica 
linhagens diferentes. 
 
• Pode ser também aplicada para análise de espécies diferentes, 
mas não é muito comum. Depende do tipo de estudo. 
 
• Comumente utilizada em biologia da conservação afim de 
identificar a variabilidade genética entre populações que vivem 
isoladas. 
 
• Ou no melhoramento genético quando se pretende melhorar o 
vigor. 
 
RAPD 
Amplificação aleatória de DNA polimórfico 
 
UTILIZAÇÃO DA TÉCNICA DE RAPD-PCR PARA ESTUDO DE VARIABILIDADE 
GENÉTICA DE AMOSTRAS DE Leishmania (L.) chagasi ISOLADAS DE CASOS 
HUMANOS E RESERVATÓRIOS CANINOS, EM BELO HORIZONTE-MG. 
 
 
 
 
RAPD 
Amplificação aleatória de DNA polimórfico 
 
 
RAPD 
Amplificação aleatória de DNA polimórfico 
 
• As limitações da técnica estão 
relacionadas a baixa 
reprodutibilidade dos mesmos locis 
polimórficos. 
 
• A Técnica de RAPD não distingue 
locus heterozigotos, ou seja, a 
interpretação na eletroforese gera 
apenas uma banda de DNA de 
mesmo pm. 
 
 
 
RAPD 
Amplificação aleatória de DNA polimórfico 
 
• Fácil manuseio e reduzido número de etapas, é capaz de 
gerar resultados com certa rapidez em um curto período 
de tempo. 
• Baixo custo, comparado a outros marcadores. 
• Não requer o conhecimento prévio do genoma analisado. 
• Emprega poucos nanogramas de DNA na presença de um 
número bem reduzido de reagentes e não exige 
instalações laboratoriais tão sofisticadas. 
• Avaliação de um número elevado de genótipos em um 
curto prazo de tempo, além de sofrerem pouca influência 
ambiental. 
• Limitação esta relacionada a analisar apenas locus 
dominantes. 
 Vantagens e limitações do RAPD 
(Freitas et. Al, 2007) 
• Amplificação seletiva, via PCR, de fragmentos 
de DNA genômico total gerados pela 
clivagem com enzimas de restrição. 
 
• É uma combinação das técnicas de RFLP com 
RAPD. 
 
• Comumente aplicada no fingerpriting e 
mapeamento genético de plantas . 
AFLP 
Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos Amplificados 
AFLP 
Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos Amplificados 
Primers (Eco-A/MseI-T) se anelam aos 
adaptadores 
Primer Adaptador EcoRI: 
CTCGTAGACTGCGTACC/AATTGGTACGCAGTCTAC 
Primer Adaptador MseI: GACGATGAGTCCTGAG/ 
TACTCAGGACTCATEcoRI e MseI 
Primers (Eco-AG/MseI-TA) se anelam aos 
adaptadores 
• Desvantagens: 
– Maior número de etapas 
– É um marcador dominante 
– Maior número de reagentes e equipamentos 
– Requerer DNA de qualidade e com alto nível de 
pureza. 
– A digestão parcial ou má qualidade do DNA pode 
levar a interpretações equivocadas do 
polimorfismo. 
AFLP 
Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos Amplificados 
• Vantagem é análise em multiplex e resultados em PAGE. 
AFLP 
Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos Amplificados 
Microssatélites 
SSR – Sequências Simples Repetidas 
STR - Sequências pequenas repetidas in tandem 
• São sequências curtas (2-6 nucleotídeos) repetidos in tandem 
dispersos ao “longo do genoma” nuclear de mitocôndrias. 
 
 
 
 
 
 
• São acúmulos de mutações conquistados ao longo da evolução. 
 
• São obtidos a partir de um par de primer que anela nas regiões 
que flanqueiam os microssatélites. 
 
• Isto quer dizer que o polimorfismo é dado pelo tamanho dos 
produtos de PCR mostrados na eletroforese. 
Microssatélites 
SSR – Sequências Simples Repetidas 
STR - Sequências pequenas repetidas in tandem 
Os microssatélites tem origem em mutações tipo 
“stepwise” 
Microssatélites 
SSR – Sequências Simples Repetidas 
STR - Sequências pequenas repetidas in tandem 
• Expressam locis codominantes gênicos e não gênicos. 
• Podem ser analisados vários locis simultaneamente por 
conjunto de primers na PCR multiplex ou eletroforese 
capilar. 
Região conservada 
Região conservada Região polimórfica 
 
Microssatélites 
SSR – Sequências Simples Repetidas 
STR - Sequências pequenas repetidas in tandem 
Microssatélites 
SSR – Sequências Simples Repetidas 
STR - Sequências pequenas repetidas in tandem 
Microssatélites 
SSR – Sequências Simples Repetidas 
STR - Sequências pequenas repetidas in tandem 
• Aplicações no DNA-fingerprinting 
• Aplicações no DNA-fingerprinting 
 
Microssatélites 
SSR – Sequências Simples Repetidas 
STR - Sequências pequenas repetidas in tandem 
• Amelogenina 
– Gene localizado nos cromossomos sexuais que codificam o 
esmalte dos dentes. 
 
 
Microssatélites 
SSR – Sequências Simples Repetidas 
STR - Sequências pequenas repetidas in tandem 
• Amelogenina 
 
 
Microssatélites 
SSR – Sequências Simples Repetidas 
STR - Sequências pequenas repetidas in tandem 
• DNA mitocondrial 
– O DNA mitocondrial apresenta marcadores moleculares 
com alta estabilidade e que permite a construção de 
genealogias de origem materna. 
 
Microssatélites 
SSR – Sequências Simples Repetidas 
STR - Sequências pequenas repetidas in tandem 
Microssatélites 
SSR – Sequências Simples Repetidas 
STR - Sequências pequenas repetidas in tandem 
• Como analisar microssatélites em 
eletroforese? 
– Compara-se o tamanho dos fragmentos e a 
quantidade compartilhada entre os indivíduos 
analisados. 
• Estes marcadores diferem entre os indivíduos 
em um único par de nucleotídeo. 
SNP 
Polimorfismo de Nucleotídeo Único 
SNP 
Polimorfismo de Nucleotídeo Único 
• SNPs são as variações genéticas mais comuns (90%) 
originadas de mutações pontuais. 
 
• Ocorrem a cada 300~600 nucleotídeos 
 
• SNPs tem se tornado marcadores de preferência pela 
sua grande abundância e pelo desenvolvimento de 
tecnologias de genotipagem em larga escala. 
 
• São analisados por qPCR, sequenciamento e 
Microarranjos e os resultados são dados por meio da 
“Bioinformática”. 
SNP genotyping by Precision Melt Analysis software using data generated by the CFX96 real-time PCR 
detection system. Discrimination of human factor V coagulation SNP genotypes (C to T substitution) using 
SsoFast EvaGreen supermix. Data from homozygous wild type (AA), mutant (aa), and heterozygote (Aa). 
Samples are shown on a normalized melt curve plot. RFU, relative fluorescence units. 
 
 
SNP 
Polimorfismo de Nucleotídeo Único 
Diagnóstico para o Fator V de Leiden 
Mutação por substituição da 
base G/A resultando na troca 
da Arg (Arginina) pela Gln 
(Glutamina) na posição 506 
da proteína, um dos 
principais sítios de clivagem 
para ativação da proteína C. A 
presença da mutação 
aumenta o risco de doença 
trombótica de três a dez 
vezes para portadores 
heterozigotos e de oitenta 
vezes para portadores 
homozigotos. 
SNP 
Polimorfismo de Nucleotídeo Único 
Se
q
u
en
ci
am
e
n
to
 g
ê
n
ic
o
 
SNP 
Polimorfismo de Nucleotídeo Único 
M
ic
ro
ar
ra
y 
d
e
 D
N
A
 
Fingerprinting 
• Técnica que busca estabelecer (inclusão/exclusão) 
vinculo genético entre indivíduos. 
 
• 1986 - Alec Jeffreys: Descobriu que o DNA apresentava 
regiões altamente repetitivas (polimórficas). 
 
• Essas repetições variavam de indivíduo para indivíduo. 
 
• Impressões digitais de DNA. 
 
Fingerprinting 
• O processo crossing-
over proporciona 
um alto grau de 
variabilidade entre 
os organismos vivos. 
 
• Já a reprodução 
combina estas 
possibilidades. 
 
Fingerprinting 
• As mutações gênicas aumentam esta variabilidade 
(polimorfismo) e são herdáveis geneticamente 
segundo o padrão Mendeliano. 
 
• Garante que cada indivíduo seja único. 
 
• As regiões polimórficas também são herdadas 50% 
do pai e 50% da mãe. 
 
• Exceção!!! Gêmeos Monozigóticos. 
 
Fingerprinting 
• A relação de parentesco é facilmente observável por 
eletroforese em gel ou outras técnicas de análise. 
Fingerprinting 
DNA-Figerprintig: marcadores 
moleculares 
• Regiões altamente polimórficas → regiões 
não- codificantes. 
• Porque a mutação embora herdável não altera 
o fenótipo. 
Combined DNA Index Sustem - CODIS 
Vínculo genético 
• Quando se observa um resultado de 
autoradiografia, eletroforese ou eletroferograma 
é possível incluir ou excluir a paternidade. 
 
• Quando o possível pai não é excluído, calcula-se: 
– Índice de Paternidade (IP) de cada locus analisado. 
– Índice Cumulativo de Paternidade (ICP) de todos os 
locis. 
– Probabilidade Cumulativa de Paternidade (W). 
Inclusão e/ou Exclusão de Paternidade 
• Para excluir vínculo genético deve ocorrer 
discordância em pelo menos três alelos entre o(a) 
filho(a) e o suposto pai ou mãe, conforme normas 
internacionais. 
 
Inclusão e/ou Exclusão de Paternidade 
Inclusão e/ou Exclusão de Paternidade 
Inclusão e/ou Exclusão de Paternidade 
IP – Índice de Paternidade 
• Razão entre a probabilidade que o homem analisado, seja o 
pai biológico da criança, e a probabilidade de que outro 
homem, ao acaso, possa ser o pai verdadeiro. 
 
IP: X/Y ou IP = m.p/m.f , onde 
 
– X: probabilidade de transmissão do alelo obrigatório paterno 
(p); 
– Y: probabilidade de transmissão do alelo obrigatório materno 
(m); 
 
• “p” ou “m” = 1 → quando pai ou mãe é homozigoto 
• “p” ou “m” = 0,5 → quando pai ou mãe é heterozigoto 
• “f”: frequência do locus analisado na população. 
 
• Exemplo 1: 
• Após divórcio uma mulher solicita a paternidade de 
sua criança. Após a análise de exclusão os peritos 
prosseguem na análise do Índice de Paternidade. As 
características da mãe e suposto pai sugerem que os 
mesmo são homozigotos para o locus analisado. 
Sabendo que a frequência deste alelo, nesta 
população, é de 0,125 (f). Calcule o IP. 
 IP = m.p/m.f 
 IP = (1.1)/(1.0,125) 
 IP = 1/0,125 
 IP = 8 
 
ICP - Índice Cumulativo de Paternidade 
• Deve-se calcular o IP para cada locus analisado, sendo que 
a multiplicaçãode um IP pelo outro permite o cálculo do 
Índice Cumulativo de Paternidade (ICP). 
 
• O valor do ICP mede a força ou a importância da evidência 
genética. 
 
• Ele indica se a evidência preenche melhor a hipótese de ser 
o homem testado o verdadeiro pai ou a hipótese de outro 
homem ser o pai. 
 
• Quanto maior o ICP, maior a probabilidade de o investigado 
ser o pai biológico. 
• Exemplo 1: 
• O breve relacionamento entre A.F. com J.R. resultou no 
nascimento de J.R. Jr. A supracitada mãe A.F. , solicita na 
justiça o reconhecimento de J.R.Jr. Por parte do senhor 
J.R., suposto pai. O resultado preliminar do teste é 
apresentado abaixo. Calcule a ICP do senhor J.R. ser o pai 
biológico de J.R.Jr. 
 ICP = 1,04.1.4.2,38...1,85 
ICP = 348,6268 787 
W - Probabilidade Cumulativa de 
Paternidade 
• Possibilita determinar uma probabilidade 
posterior baseada no resultado genético do 
teste entre a mãe, filho e suposto pai. 
 
• Os resultados são classificados, segundo 
CODIS: 
– 90-94,9%: Provável Paternidade 
– 95-99%: Forte Índice de Paternidade 
– ≥ 99%: Paternidade Praticamente certa 
 
Probabilidade Cumulativa de 
Paternidade 
• Antes de calcular a probabilidade de paternidade 
devemos assumir uma probabilidade anterior de que o 
homem testado seja o verdadeiro pai. 
 
• Para isso leva-se em conta a probabilidade “a priori” de 
paternidade (PP), decorrente de outras evidências 
(não-genéticas), anteriores ao estudo pericial. 
 
• Como os peritos desconhecem essas evidências e 
devem permanecer neutros na disputa, utilizam o valor 
médio de 0,5 ou 50% em seus cálculos, para que não 
exista tendência matemática prévia a favor ou contra a 
paternidade. 
 
 
Probabilidade Cumulativa de 
Paternidade 
• A fórmula para calcular a probabilidade 
cumulativa de paternidade (W) é: 
 
 W = (PP) . (ICP) / [(PP) . (ICP) + (1-PP)] 
 
• Exemplo: Assumindo a ICP de 19,0 e a PP de 0,5 
ou 50% 
• Logo: W= (0,5) x (19,0)/ [(0,5) x (19,0) + (1-0,5)] 
 W= 95 ou 95% 
• Exemplo 1: 
• C.A. solicita a paternidade de uma homem falecido a 28 
anos. A pedido da justiça o corpo é exumado para extração 
de DNA. Foram analisados 8 locus do tipo mini-STRs. Os 
resultados parciais são apresentados abaixo. Calcule a 
Probabilidade Cumulativa de Paternidade (W) e indique o 
resultado segundo os parâmetros recomendados pelo 
CODIS. 
 W: 82,97% 
O acusado como 
suposto pai é 
excluído da 
paternidade. 
 
• Exemplo 2: 
• Supracitada mãe solicita a paternidade sobre um de 
seus filhos. Os dados preliminares são apresentados 
 abaixo. Calcule W e 
indique os 
resultados segundo 
o CODIS. 
ICP:1475178.145 
W: 0,999999322 x100 
 
 
Paternidade Praticamente certa 
99,9999 
Referências 
• WATSON, J.D. et al. DNA Recombinante: genes 
e genomas, São Paulo: Artmed, 2009. 
 
• ZAHA, A. et al. Biologia Molecular Básica. São 
Paulo: Artmed, 2012.