Reação em cadeia da polimerase

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Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Consiste em fazer copiar de DNA in vitro. 
É uma reação de síntese de regiões especificas do DNA em ciclos repetitivos. É necessário saber qual região do DNA que se quer amplificar e desenhar o primer para está região e a partir disso se podem obter várias cópias do fragmento do DNA. Essa amplificação pode ser utilizada para identificação de DNA. Diferente da clonagem genica, na PCR é necessário que saiba a sequencia de nucleotídeo para poder desenhar o primer e consequentemente conseguir fazer a reação de amplificação.
Teoricamente, basta ter apenas um DNA integro para conseguir fazer uma amplificação através da PCR.
As reações da PCR se dividem em três etapas distintas: uma etapa de desnaturação, uma de anelamento e uma de extensão. Essas três etapas compreendem um ciclo, por isso que se diz que a reação da PCR é uma reação de amplificação em ciclos repetitivos. E cada ciclo compreende essas três etapas. 
Etapa de desnaturação: há a necessidade dessa dupla fita de DNA ser desnaturada, ou seja, romper as pontes de hidrogênio que pareiam as duas fitas simples. Essa separação ocorre à temperatura de 95 graus Celsius. E consequentemente na etapa posterior, o primer que foi produzido para fazer as cópias das regiões especifica será introduzido (anelar). 
Etapa de anelamento: ocorre após a desnaturação. Os dois primers (um para cada fita simples) vão parear. Para que haja esse pareamento é necessário que tenha uma temperatura ideal, que é calculada pela formula (Tm - 5ºC). Essa temperatura muda, pois é necessário saber qual região será amplificada, qual primer será utilizado, dependendo do tamanho e da constituição de nucleotídeos desse primer é que vai determinar qual será a temperatura de anelamento.
A temperatura de desnaturação é constante e a temperatura de anelamento vai ser variável. 
Apos do pareamento do primer, uma polimerase pegará os nucleotídeos no meio reacional e vai fazer a copia a partir da fita molde, isso representa a etapa de extensão. A melhor temperatura para etapa de extensão é de 72ºC, por ser uma ação enzimática. Ao terminar de formar o alongamento da cadeia, há o termino do primeiro ciclo e o inicio de um segundo ciclo, igual ao primeiro.
Possuem-se células que podem sofrer lise através de meios de extração de DNA, com isso se obtém o DNA inteiro (se o DNA não tiver inteiro pode haver uma quebra em um ponto qualquer causando um prejuízo na amplificação). Ocorrerá, então, uma etapa de desnaturação dessa dupla fita e se obtém fitas simples de DNA. 
A região em amarelo representa a região que será amplificada, então se desenha um primer para uma fita e consequentemente um primer para a outra fita. E cada primer irá reconhecer uma sequencia especifica desse DNA. 
Desnaturação → anelamento (em função da sequencia a temperatura de anelamento vai variar) → extensão (a polimerase vai reconhecer esse primer e vai fazer o alongamento da cadeia) 
Pode-se também utilizar a PCR para gerar uma amplificação especifica tomando como inicio uma fita de RNA. Por exemplo, um RNAm com uma sequencia de nucleotídeos que precisam ser amplificados, se utiliza um primer que conhecerá essa sequencia e a transcriptase reversa irá fazer o alongamento formando uma fita simples de DNA que será chamado de DNA de sentido complementar ou cDNA. A partir desse cDNA pode se utilizar outro primer que irá formar uma fita simples de DNA complementar, feito por uma polimerase. E no final do processo terá uma dupla fita de c-DNA tomando como base um RNAm.
A polimerase sabe onde inicia o alongamento, mas não onde para. Então o que determina onde para é o tempo reacional. 
Uma reação de PCR termina quando acabam os primers do meio reacional. 
A extremidade 3' do primer é a mais importante para o reconhecimento da polimerase, pois é a partir daquele ponto que há o inicio do alongamento. 
Amplicon: regiões restritas entre os primers. 
A diferença básica entre a clonagem gênica e a reação de PCR é que a clonagem gênica não é necessário saber a sequencia de nucleotídeos, enquanto na PCR é preciso saber. 
Para que a reação de PCR ocorra é preciso ser colocado em meio reacional o DNA molde em uma concentração que varia de um a dois microgramas, por isso que há a necessidade de quantificar o DNA após uma extração para que se possa fazer um calculo estequiométrico e por fim realizar a reação de PCR ou hibridização. Se tiver muito DNA molde há a probabilidade de ocorrer falsos anelamentos, que significa que o primer pode anelar em outras regiões do DNA e não naquela que deverá ser amplificada. 
Além da presença de DNA molde, precisa apresentar polimerases no meio reacional, e pelo meio reacional apresentar uma alta temperatura a polimerase que deverá ser utilizada é a taq polimerase. Essa enzima adiciona nucleotídeo na extremidade 3'. A atividade enzimática da polimerase é proporcional à concentração de Mg2+ livre (atua como cofator).
A taq polimerase não faz leitura de revisão, isso só ocorre dentro da célula. 
Para cada nucleotídeo, um magnésio fica complexado. Para o magnésio ser utilizado ele precisa estar na forma livre. Para colocar esse no meio reacional é preciso saber a quantidade de nucleotídeo, pois será necessário por uma quantidade para ser complexado e um excesso que atuará como cofator. Quanto menor a concentração de magnésio, menor será o reconhecimento da polimerase, ocasionando em pouco ou nenhum produto amplificado. Se colocar muito magnésio a enzima ficará hiperativa e aumentará a taxa de erros. 
↑ dNTP ↓magnésio = todo magnésio será complexado e nenhum atuará como cofator para taq polimerase
↓ dNTP ↑magnésio = aumento da taxa de erro
Os primers são colocados por ultimo no meio reacional. A quantidade de guanina e citosina deverá estar entre 35 e 65%, precisa dar mais energia para que o sistema funcione. 
↑ [Guanina e citosina] = ↑ temperatura de anelamento 
↑ temperatura de anelamento = pouco produto formado
↓ temperatura de anelamento = inespecificidade 
Esses primers não podem ser complementares, e quanto maior o primer, maior é a chance de isso ocorrer. Além de existir a possibilidade dos primers se anelarem, ainda há chances do primer se anelar com ele mesmo. 
Como se calcula a de anelamento: coloca no termociclador (equipamento que aquece a temperatura que se determina em um determinado tempo em minutos)
Tm: temperatura a qual 50% da sequencia do primer se encontra associada ao DNA molde. Calculadas pela formulas: 
Primers menores que 25 mer: 2(A+T) + 4(G+C)
Maior que 25 mer: 81,5 + 16,6 [log 10 (Na+)] + 0,41(G+C) - 600
 Se o primer for muito grande deve levar em consideração G-C e a concentração de sódio. Primer muito grandes quando estão em alta concentração de sódio há uma interferência na ligação das pontes de hidrogênio. 
É necessário calcular a tm dos dois primers e chegar a um meio termo, pois no termociclador só é possível colocar uma temperatura.
Os ciclos térmicos variam, normalmente, de 25 a 35 ciclos, isso depende da quantidade de DNA que se tem. existem várias qualidade de taq polimerases e quanto maior for a quantidade de ciclos a ser utilizado na reação na PCR vai significar que será preciso usar uma taq de maior qualidade, pois ela é termoestável porem não 100%, haverá uma perda de eficiência.
A taq pode ser inibida por grupamentos heme, bile, sais provenientes de fluidos biológicos, proteinase, EDTA, fenol e bilirrubina.
Quando se tem uma amostra clinica e vai utilizar uma reação de PCR é preciso diluir a amostra, pois quando ha diluição da amostra há consequentemente a diminuição dos inibidores. 
PCR Multiplex: existem vários tipos de reação de PCR. Na PCR multiplex existem várias regiões do DNA sendo amplificadas ao mesmo tempo. Depois de fazer as amplificações os DNAS precisaram passar por uma eletroforese, então o peso dos amplicons deve ser diferente.
Nested PCR: o DNA molde é proveniente de uma amplificação anterior. Com o nested PCR se consegue uma maior especificidade, pois esse amplicon serámenor do que o amplicon que foi utilizado como DNA molde.