Aula 03. Transcrição e tradução gênica

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Transcrição
O dogma central da biologia molecular
A informação decodificada (Dogma Central) 
Gene procarionte
Propriedades do RNA
Conceito
É o processo celular de síntese de RNA 
a partir de um molde de DNA. 
Tipos de RNA (produtos da transcrição)
RNA Função
RNA mensageiro (RNAm) Codifica todas as proteínas celulares
RNA ribossomal (RNAr)
Guiam a montagem das proteínas no 
citoplasma
RNA transportador (RNAt)
Carreiam aminoácidos para a síntese
proteíca
RNA nucleares pequenos
(RNAsn)
Participam do processo de splicing
RNAtm, RNAsno, RNAsca, RNAg, RNAsi, RNApi, RNAmi 
Propriedades:
1) Ligações fosfodiéster na direção 5’3’
2) Uso de ribonucleotídeos trifosfatados como substrato
3) Sequência feita por complementaridade de bases com
uma fita de DNA molde
4) RNA polimerases não precisam de iniciadores
5) Reconhecimento de sítios promotores na sequência
de DNA
Transcrição
Transcrição (etapas)
RNA polimerase
 Enzima responsável pela síntese de RNA. É um dos
maiores complexos enzimáticos conhecidos.
 Na maioria dos procariontes uma única RNA polimerase
transcreve todos os tipos de RNA.
 Cerne da enzimas (4 subunidades) + fator sigma =
holoenzima
Promotores
 Sequências variadas na fita (filamento) de DNA molde
antes da região codificante do gene.
 Espaçamento entre os sítios varia de 15-17 nucleotídeos.
 A região promotora -10 é o sítio de desenrolamento do DNA,
enquanto a região -35 é a região de reconhecimento da holoenzima.
 A holoenzima muda de conformação de modo a amenizar a tensão
estrutural sofrida pela dissociação da dupla-fita de DNA.
Iniciação (procariontes)
Gene Fator Uso
rpoD σ70 Geral
rpoS σS Estresse
rpoH σ32 Choque Térmico
rpoE σE Choque Térmico
rpoN σ54 Nitrogênio
fliA σ28 (σF) Flagelar
• Existem vários tipos de fatores sigmas, cuja
função é direcionar a RNApol a regiões
promotoras de interesse, importância adaptativa.
Em procariotos...
Iniciação (procariontes)
Elongamento
 Síntese dos primeiros
10 nucleotídeos dentro
da bolha de transcrição.
A dissociação do fator
sigma é necessário para a
síntese eficiente de RNA.
 Síntese sempre no
sentido 5’3’ utilizando a
energia da quebra do
trifosfato de NTPs.
 A bolha de transcrição
é unidirecional, ao
contrário da forquilha de
replicação.
Enzima com frequência de 
erro de ~ 1x105
Elongamento
Fita molde
Fita codificante
O RNA transcrito terá a sua sequência idêntica à fita de 
DNA codificante.
A vida como ela é…
Terminação (procariontes)
 Implica na dissociação DNA-RNA e a liberação do cerne
proteíco da fita molde de DNA.
 Dois mecanismos conhecidos:
1) Intrínseco (sem gasto de energia)
2) Rho dependente
 Sequência de término
contém cerca de 40 bp,
terminando em um trecho
rico em GC, seguido de
seis ou mais uracilas.
Terminação (intrínseco)
 Grampo desacelera ou freia a RNA polimerase,
enquanto a região rica em uracila dissocia o complexo
proteína-RNA-DNA.
Terminação (rho dependente)
 Complexo enzimático rho
reconhece um sítio específico
na sequência de RNA.
 Rho se desloca ao longo da fita
de RNA.
 Rho alcança a RNA polimerase
quando esta faz uma pausa na
síntese e por ser uma helicase
promove a separação do
hídribo DNA-RNA via gasto de
ATP.
A localização dos genes 
Transcrição (eucariontes)
 A transcrição em eucariontes é similar, mas apresenta algumas
diferenças importantes:
Procariontes Eucariontes
Uma única RNA polimerase para
sintetizar todos os RNAs
Três : I (RNAr), II (RNAm), III 
(RNAt e RNAsn)
Fator sigma Fatores gerais de transcrição
Transcrição envolve mais de um 
gene (operon)
Transcrição envolve apenas um 
gene
RNA sintetizado no citoplasma
(tradução simultânea a 
transcrição)
RNA sintetizado no núcleo
(necessidade de transporte)
4 subunidades 8-14 subunidades
Promotor -10 e -35
Promotor TATA box (-30), CAAT 
box (-75), GC box (-90) 
Fatores de transcrição eucarióticos
O gene eucarionte
Processamento do RNAm eucariótico
 Nos eucariontes, a transcrição é apenas o primeiro passo de
diferentes etapas necessárias para a produção de um RNA
mensageiro maduro.
1) Capeamento da extremidade 5’ do RNA
2) Splicing
3) Adição da cauda poli-A na extremidade 3’ do RNA
Em eucariontes, a transcrição e o 
processamento do RNAm ocorrem
simultaneamente! 
Capeamento da extremidade 5’
 O capeamento da extremidade
5’ é feito por uma
guaniltransferase assim que os
primeiros 25 nucleotídeos do
RNAm saem da bolha de
transcrição.
 O capeamento da extremidade
5’ está relacionado com a
exportação nuclear do RNAm
maduro para o citoplasma.
 Também protege o RNAm da
ação de nucleases.
Íntrons / Éxons
• O Splicing é um processo que
remove os íntrons e junta
os éxons depois
da transcrição do RNA.
• A estrutura fundamental
para clivar essas ligações
entre os nucleotídeos é
o spliceossomo.
• Ele consiste na retirada
dos íntrons de um mRNA
precursor, sendo um dos
processos necessários para
formar um RNAm maduro
funcional.
 25.000 genes codificam 100.000 proteínas. Como isso pode
acontecer?
Splicing alternativo
Splicing alternativo
Gene DSCAM de drosófila pode ser editado 
em 38.000 vias alternativas
Curiosidades sobre splicing
Genes típicos de eucariotos possuem 7-8 éxons, estendem-se por
~16kb; éxons são pequenos (100 a 200 pb) e íntrons são maiores
(1kb).
Apenas cerca de 235 (4%) dos 6.000 genes de levedura contêm
íntrons. Enquanto a maioria dos genes humanos (27.000) contém
regiões intrônicas.
 O tamanho médio de um íntron é de 2.000 nucleotídeos,
enquanto os éxons possuem cerca de 100-200 nucleotídeos, assim
uma porcentagem maior do DNA codifica íntrons, não éxons.
 Um exemplo extremista é o gene da distrofia muscular. O gene
possui 2,5 milhões de pares de base. Os 78 éxons reunidos
produzem um RNAm de 14.000 nucleotídeos, o restante são íntros.
Adição da cauda poli-A
 A cauda poli-A não é
sintetizada durante a
transcrição do RNAm. Ela é
adicionada ao RNAm, ainda no
núcleo, pela enzima poli(A)-
polimerase.
 São adicionados, um a um,
cerca de 200 nucleotídeos de
adenina sem a necessidade de
molde.
 Sua função é aumentar a
vida útil do RNAm no
citiplasma. Em procariontes, a
meia vida dura minutos, em
eucariontes dura horas.
Processamento (resumo)
Tradução
Proteínas
 As proteínas são as macromoléculas mais complexas de um
organismo, podendo desempenhar diferentes funções
celulares:
 Estrutural (colágeno, actina, queratina);
 Sinalização celular (insulina);
 Transporte de moléculas (canais iônicos);
 Enzimas (polimerases, catalases, nucleases);
 Defesa do organismo (anticorpos).
 As proteínas podem ser compostas por até 20 aminoácidos
diferentes e a composição média de uma proteína varia, em
média, entre 50 a 5.000 aminoácidos. A maior proteína
conhecida possui 33.000 aminoácidos. Estima-se que existam
100.000 proteínas humanas diferentes.
Código Genético
 4 tipos de nucleotídeos
sintetizando 20 diferentes
aminoácidos.
 Códon: Sequência de 3
nucleotídeos necessário
para codificar um
aminoácido.
O código genético
Matriz de leitura (ORF)
 Uma sequência de nucleotídeos pode ser lida em
qualquer uma de suas 3 janelas de leitura.
 a maioria das sequências de RNAm codifica um
produto proteico em apenas uma janela de leitura.
 O RNAm é sempre lido no sentido 5’  3’.
5' atgcccaagctgaatagcgtagaggggttttcatcatttgaggacgatgtataa 3’ 
1 atg ccc aag ctg aat agc gta gag ggg ttt tca tca ttt gag gac gat gta taa
M P K L N S V E G F S S F E D D V *
2 tgc cca agc tga ata gcg tag agg ggt ttt cat cat ttg aggacg atg tat
C P S * I A * R G F H H L R T M Y
3 gcc caa gct gaa tag cgt aga ggg gtt ttc atc att tga gga cga tgt ata 
A Q A E * R R G V F I I * G R C I
Estrutura do RNAt
 Embora as moléculas de RNAt tenham muitas similaridades
estruturais, cada um tem uma forma tridimensional única, que
permite o seu reconhecimento pela aminoacil sintetase correta.
 É formada uma ligação éster entre o aminoácido e a adenina
presente na ponta 3’ OH-livre do RNAt via gasto de ATP.
Estrutura do RNAt
Tradução (Conceito)
Processo de leitura da sequência de RNAm e sua 
conversão em uma sequência de aminoácidos.
RNA mensageiro maduro (eucarionte)
Maquinaria de tradução
 Principais componentes:
1) RNA mensageiro (RNAm) – especifica a sequência correta de
aminoácidos na proteína .
2) Ribossomos (RNAr + proteínas) – maquinaria enzimática de
produção de proteínas.
3) RNA transportador (RNAt) – carreia os aminoácidos para o
complexo ribossómico (aminoacil RNAt).
4) Fatores de tradução – proteínas com funções regulatórias
dentro do processo de tradução.
5) Outros componentes – ATP, aminoácidos e íons.
Ribossomos
Ribossomos
 Os ribossomos possuem sítios específicos que os
possibilita se ligar a RNAm, aos RNAt e aos fatores
específicos de tradução.
 Quando não estão traduzindo proteínas, os
ribossomos estão normalmente dissociados em suas
duas subunidades na célula. Durante a síntese as
subunidades se juntam e ao final da tradução se
dissociam novamente.
Ribossomos (Sítios)
Sítio A (aceptor): sítio de entrada de um aminoacil-tRNA
Sítio P (peptidil): Sítio onde se encontra o RNAt ligado a cadeia de
polipeptídeos
Sítio E ? (saída): onde o tRNA é liberado
Tradução (etapas)
• Iniciação
– ligação do ribossomo ao RNAm e ligação do primeiro
RNAt.
• Elongamento
– translocação do ribossomo e formação de todas as
ligações peptídicas.
• Término
– liberação da cadeia peptídica, dissociação do
ribossomo ao RNAm.
Estágios da Síntese Proteica
TRADUÇÃOTradução (Iniciação)
 Primeira etapa da iniciação
consiste na associação do
RNAm com a subunidade
menor do ribossomo via IF3.
 O fator de iniciação IF2 liga-se a
uma molécula de GTP e ao RNAt
de iniciação denominado fMet-
RNAt, carreando este conjunto
ao sítio P.
 Uma proteína ribossomal
hidrolisa GTP, gerando a energia
necessária para a montagem do
complexo ribossômico.
Sítios Shine-Dalgarno
• Como o códon correto de iniciação é reconhecido pela
subunidade menor do ribossomo?
• Os códons de iniciação são precedidos de sequências
que se paream bem com a ponta 3’ do rRNA 16S
(sequência de Shine-Dalgarno) rica em purina.
Sítios Shine-Dalgarno
Sequências vistas apenas em organismos 
procariontes e permite que um mesmo RNAm 
possa produzir diferentes proteínas
Iniciação - eucariontes
 Em eucariontes, o processo é similar, mas não possuem sequência
Shine-Dalgarno.
 A subunidade menor do ribossomo reconhece o capeamento da
extremidade 5’ do RNAm, com auxílio de eIF, e desliza sobre o
RNAm o achar o primeiro AUG (auxiliado por outros eIFs).
 Quando a subunidade menor do ribossomo encontra o primeiro
AUG, ocorre a dissociação dos eIFs, permitindo o acoplamento dos
ribossomos.
Alongamento (síntese proteíca)
 3 fatores proteícos em procariontes e eucariontes: 
EF-Tu, EF-Ts e EF-G.
Alongamento
 EF-Tu
 medeia a entrada do aminoacil-RNAt no sítio A
 Liga-se a GTP e ao aminoacil-RNAt
 A quebra de GTP ativa a ligação do aminoacil-RNAt no sítio A e 
EF-Tu é liberado
 Na translocação
 cadeia polipeptídica do tRNA do sítio P é transferida para o tRNA no
sítio A (peptidil-transferase).
 Etapa mediada por EF-G
 A quebra de GTP libera a energia necessária para a movimentação do
ribossomo um códon adiante.
 Esse processo permite a liberação do RNAt descarregado do sítio P.
Término
 3 códons de término: UAG, UAA e UGA
 Não são reconhecidas por um RNAt, mas por fatores
proteicos denominados fatores de liberação.
 Procariotos: fatores de liberação RF1 e RF2
 Eucariotos: um único fator de liberação (eRF)
 Reconhece todos os 3 códons de término.
Término
 Os fatores de liberação mimetizam a forma
tridimensional e a carga de um RNAt.
 Liberação do RNAm e dissociação das
subunidades dos ribossomos.
Polirribossomos
A ligação de vários ribossomos em uma molécula de 
RNAm gera polirribossomos.
Complexos de tradução
• Em organismos procariontes a transcrição do RNA e a sua
subsequente tradução ocorrem simultaneamente, permitindo
uma grande produção de proteínas utilizando um RNAm de
meia-vida curta.