Cinética de crescimento microbiano aula 2

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Objetivos 
Medir as taxas de 
transformações 
Estudar a influência de 
fatores nestas taxas 
Equações empíricas ou 
modelos matemáticos 
Aplicar o modelo na otimização 
e no controle do processo 
 curvas de ajuste de S, X e P 
 pH, T, etc. 
 Correlacionar por meio de equações 
empíricas as taxas de transformações e 
os fatores que nelas influenciam 
 Visando aumentar 
rendimentos e 
produtividades 
 Objetivos 
 Sobre o aspecto 
populacional, é 
importante conhecer: 
 a cinética de 
crescimento 
 os fatores que 
afetam o tempo 
de geração 
 os fatores 
ambientais que 
afetam o 
crescimento 
atividade microbiana crescimento microbiano 
intrinsecamente 
associada 
Uma das raras exceções: produção de 
metabólitos secundários na fase estacionária 
é a expressão das reações 
químicas que os micro-
organismos catalisam 
através delas conservam a energia 
necessária para o seu crescimento 
em termos gerais, a atividade 
microbiana se encontra 
associada ao crescimento da 
respectiva população 
em 
outras 
palavras 
 Em uma cultura pura (de uma só 
população) descontínua 
 condições de assepsia asseguradas 
 que seja iniciada com a adição de 
células viáveis (inóculo) 
 recipiente esterilizado 
 com um volume de meio de cultura 
que propicie a fonte de energia 
adequada ao sistema enzimático do 
micro-organismo 
o nutrientes essenciais 
o ausência de compostos 
inibidores da atividade 
enzimática do micro-
organismo (antibióticos) 
o condições ambientais 
adequadas (pH, temperatura) 
 é observado o seguinte 
comportamento da 
concentração celular 
(medida através dos métodos 
de quantificação celular) 
𝜇 = 
1
𝑋
𝑑𝑋
𝑑𝑡
= 
𝑑𝑙𝑛𝑋
𝑑𝑡
 
velocidade ou 
taxa específica 
de crescimento 
depende da afinidade 
entre micro-
organismo e meio 
taxa de crescimento instantânea 
[µ] = t-1 
 Normalizando a taxa específica de crescimento 
 Plotando o gráfico de tempo versus Ln X 
 a tangente a cada ponto da curva obtida fornece o valor de  
 obtém-se uma curva de crescimento microbiano com um perfil 
exponencial 
1. Fase lag ou de adaptação 
 X = X0 = constante;  = 0 
2. Fase de aceleração 
 0 <  <  x 
3. Fase logarítmica ou exponencial 
  x = m = constante 
4. Fase de desaceleração 
  x >  > 0 
5. Fase estacionária 
 X = Xm = constante;  = 0 
6. Fase de morte ou declínio 
  < 0 
1. Fase lag ou de adaptação 
 Não há aumento no número de células 
 Ocorre a síntese de enzimas indutivas para a utilização do 
substrato e outros nutrientes 
 A duração da fase lag varia principalmente com: 
o a concentração de inóculo (X0) 
o a idade do micro-organismo (tempo de pré-cultivo) 
o o estado fisiológico do micro-organismo, incluindo a 
adequação às novas condições do meio 
 É importante reduzir o período da fase lag para aumentar a 
produtividade, o que pode ser conseguido pela adoção das seguintes 
estratégias: 
I. Inocular o meio com células na fase exponencial do crescimento 
II. Pré-aclimatar o inóculo no meio de cultivo 
III. Usar altas concentrações de inóculo (5—10% por volume) 
2. Fase de aceleração 
 Fase de transição 
 se observa o início da reprodução microbiana 
propriamente dita 
 ocorre um aumento gradual da taxa de 
reprodução (μx), bem como da taxa específica de 
crescimento (μ) 
3. Fase logarítmica ou exponencial 
 as concentrações de substrato e nutrientes são altas 
 a quantidade de produtos finais do metabolismo ainda é 
pequena 
 o número e a concentração de células aumentam 
exponencialmente a uma taxa constante 
 crescimento balanceado 
o até que as condições do meio comecem a 
deteriorar-se (acúmulo de produtos do 
metabolismo, alterações no pH, etc.) 
 Determinação de μx na fase exponencial do cultivo em batelada 
 Durante o intervalo de tempo (dt), em que as 
condições nutricionais e físico-químicas do 
meio não se afastam das condições iniciais, 
ao ponto de, afetar o crescimento a uma taxa 
constante, o aumento do número de micro-
organismos (dX) é proporcional ao número de 
células (X) presentes no início do intervalo 
considerado, ou seja: 
𝑑𝑋
𝑑𝑡
= μ ∙ 𝑋 
taxa instantânea específica de crescimento 
= 
μmax (taxa máxima específica de crescimento) 
 Determinação de μx na fase exponencial do cultivo em batelada 
𝑑𝑋
𝑑𝑡
= μ ∙ 𝑋 μ =
1
𝑋
𝑑𝑋
𝑑𝑡
=
𝑑𝐿𝑛𝑋
𝑑𝑡
 
 Condições de contorno: 
 t=0 → X=X0 
 t=t → X=X 
 𝑑𝐿𝑛𝑋
𝑋
𝑋0
= 𝜇𝑋𝑑𝑡
𝑡
0
 𝐿𝑛
𝑋
𝑋0
= 𝜇𝑋 ∙ 𝑡 
𝑋 = 𝑋0 ∙ 𝑒
𝜇𝑚á𝑥𝑡 SOMENTE NA FASE EXPONENCIAL!!! 
 Determinação de tg na fase exponencial do cultivo em batelada 
 Geralmente, é na fase exponencial onde 
são realizadas as medidas de tg 
 Sendo tg o tempo de duplicação da massa 
celular: 
𝑋2 = 2 ∙ 𝑋1 𝑡2 − 𝑡1 = 𝑡𝑔 
𝑡𝑔 =
𝐿𝑛2
𝜇𝑋
=
0,693
𝜇𝑚á𝑥
 
 Exemplos: 
 S. cerevisiae → tg = 90 min 
• tg de leveduras → 1,5—2 h 
 E. coli → tg = 20 min 
• tg de bactérias → 20 min 
4. Fase de desaceleração 
 após a fase exponencial, as condições do meio se 
alteram gradualmente 
o crescimento cada vez mais lento até que este 
acabe por parar 
 nesta fase, ocorre o esgotamento de um ou mais 
componentes do meio de cultura 
 acúmulo de metabólitos inibidores 
o produtos ou subprodutos tóxicos ao crescimento 
• o crescimento deixa de ser balanceado e o 
metabolismo muda da “plasticidade” para a 
sobrevivência celular 
 o tempo de geração tende a aumentar 
o nem todos os micro-organismos se reproduzem 
em intervalos de tempo regulares 
5. Fase estacionária 
 X = Xmáx = constante 
o balanço entre taxa específica de crescimento e taxa de 
morte celular 
 não há um crescimento líquido da população 
• número de células que se divide é equivalente ao 
número de células que morrem 
 ocorrem modificações na estrutura bioquímica da célula 
 as células permanecem vivas em função dos nutrientes que 
acumulam (reservas) 
 são sintetizados vários metabólitos secundários 
o antibióticos e algumas enzimas 
 ocorre também a esporulação das bactérias 
Ao contrário de bactérias, as células de levedura permanecem 
viáveis nesta fase por muito tempo se mantidas em geladeira 
6. Fase de morte ou declínio 
 a maioria das células está em processo de morte 
o a contagem total permanece relativamente constante, 
enquanto a de viáveis cai lentamente 
 em alguns casos ocorre a lise celular (autólise) 
 as condições ambientais tendem a promover variações de 
caráter fenotípico (reversível) nas culturas 
 o crescimento pode ser retomado pela transferência das 
células para meio novo 
 Conservação da massa: a massa nunca é criada e nem destruída (Princípio de 
Lavoisier) 
 Consumo: a diminuição da massa de um componente em um sistema devido à uma 
reação química/bioquímica 
 Entrada: massa que é adicionada em um sistema 
 Geração/produção: o surgimento de um componente em um sistema devido à 
uma reação química/bioquímica 
 Saída: massa que deixa o sistema 
 Acúmulo: aumento ou diminuição da massa do sistema (em massa ou moles) 
 Sistema: parte do processo global considerada para a análise 
 Taxa: quantidade de material que atravessa a superfície do sistema por unidade de 
tempo (por exemplo: kg/h; moles/h; L/min, etc.) 
 Volume de controle: região do espaço no qual faremos o balanço de massa 
 Estado estacionário (EE) (regime permanente): operação de um processo no qual 
todas as condições (T, p, concentrações, vazões, etc.) são mantidas constantes com o 
tempo 
 Estado (regime) transiente: operação de um processo no qual uma ou maiscondições (T, p, concentrações, vazões, etc.) variam com o tempo 
sistema sobre o 
qual é efetuado o 
balanço material 
entradas saídas 
ACÚMULO 
de massa 
dentro do 
sistema 
ENTRADA 
de massa nos 
limites do 
sistema 
SAÍDA 
de massa nos 
limites do 
sistema 
GERAÇÃO 
de massa 
dentro do 
sistema 
CONSUMO 
de massa 
dentro do 
sistema 
 O balanço material pode ser aplicado a: 
 sistemas de um ou mais componentes 
 com ou sem reação química 
 em estado permanente ou transiente 
 Simplificações: 
 Estado permanente → o termo de acúmulo é nulo 
 entra – sai + produção – consumo = 0 
 Se não houver reações (bio)químicas: entra – sai = 0 
 Regime transiente → o termo de acúmulo é diferente de zero 
 entra – sai + produção – consumo = acúmulo 
 Se não houver reações (bio)químicas: entra – sai = acúmulo 
 Determinação de μx no cultivo contínuo 
 Considerações para CSTR: 
o Xsaída = Xbiorreator 
o Ssaída = Sbiorreator 
o Psaída = Pbiorreator 
o X0 = 0 
o meio de alimentação estéril 
o F = constante 
o V = constante 
 Determinação de μx no cultivo contínuo 
 Balanço material para células: 
o Acúmulo = entra – sai + gerado 
𝑉
𝑑𝑋
𝑑𝑡
𝑎𝑐
= 𝐹𝑋0 − 𝐹𝑋1 + 𝑉
𝑑𝑋
𝑑𝑡
𝑔
 
 No EE: acúmulo = 0 
𝐹𝑋1 = 𝑉
𝑑𝑋1
𝑑𝑡
𝑔
 
𝐹
𝑉
=
1
𝑋1
𝑑𝑋1
𝑑𝑡
𝑔
 
𝐹
𝑉
= 𝜇 
1
𝜏
= 𝜇 
𝐷 = 𝜇 
taxa de diluição 
tempo de residência 
 Determinação de μx no cultivo contínuo 
 Em um processo contínuo: 
 μ (variável fisiológica) dependerá 
do valor de D , que é uma relação 
entre F (variável física) e V 
(constante) 
 a cada variação de F, varia D 
 consequência: a célula se 
adapta e responde às 
condições que são impostas 
 apresenta um novo valor de μ 
 um novo estado estacionário 
 variáveis físicas controlam a 
variável fisiológica 
𝐹
𝑉
= 𝜇 1
𝜏
= 𝜇 𝐷 = 𝜇 
Quando F é alterada, são necessários 3τ para que o sistema 
atinja novamente o regime permanente (X e S = constantes) 
 Cinética de crescimento segundo a Equação de 
Monod 
 Efeito da concentração de substrato no crescimento 
o A quantidade de biomassa que é produzida pelo 
consumo de determinada quantidade de um 
substrato é, para as mesmas condições, 
característica da respectiva espécie 
• depende principalmente da eficiência desta na 
utilização da energia do substrato 
• em menor grau, depende ainda dos gastos em 
energia de manutenção (m) para reparação 
dos constituintes celulares e manutenção da 
homeostase (osmoregulação) 
 m depende da cinética do processo 
enzimático através do qual se processa a 
metabolização do substrato 
 Cinética de crescimento segundo a Equação de 
Monod 
 Efeito da concentração de substrato no crescimento 
o Um dos fatores que pode limitar a velocidade de 
utilização de um substrato (e, conseqüentemente, o 
valor de ) é a velocidade em que este é transportado 
para o interior da célula, onde têm lugar as reações 
catabólicas 
o Monod adaptou o modelo de cinética de saturação 
desenvolvido por Michaelis-Menten para as reações 
enzimáticas ao caso do crescimento microbiano 
o no modelo de Monod não são as enzimas 
intracelulares a serem saturadas, mas sim os 
transportadores específicos de um determinado 
substrato 
Monod – prêmio Nobel em 
Fisiologia ou Medicina - 1965 
 Cinética de crescimento segundo a Equação de Monod 
 Efeito da concentração de substrato no crescimento 
Representação esquemática da saturação dos transportadores 
específicos de um substrato com aumento da concentração do mesmo 
 Cinética de crescimento segundo a Equação de Monod 
 A equação de Monod procura mostrar como  varia com S: 
𝜇 = 𝜇𝑚á𝑥
𝑆
𝐾𝑆 + 𝑆
 
taxa específica de crescimento celular máxima 
(quando [S] tende a infinito; valor teórico) 
constante de saturação 
(M.L-3) 
 S = KS quando 𝜇 =
𝜇𝑚á𝑥
2
 
afinidade pelo 
substrato 
KS afinidade 
 Cinética de crescimento segundo a Equação de Monod 
 Para a determinação gráfica de máx e KS, podemos linearizar a equação de 
Monod, obtendo o gráfico dos inversos de Lineweaver-Burk 
𝜇 = 𝜇𝑚á𝑥
𝑆
𝐾𝑆 + 𝑆
 
1
𝜇
=
1
𝜇𝑚á𝑥
+
𝐾𝑆
𝜇𝑚á𝑥
1
𝑆
 
linearização 
 Cinética de crescimento segundo a Equação de Monod 
 Taxa específica de crescimento máxima (máx) em diferentes micro-organismos 
Micro-organismo Temperatura Cultivo (C) máx (h
-1) 
Bactéria 37 0,6-1,0 
Levedura (aeróbico) 30 0,3-0,5 
Fungos Filamentosos 28 0,1-0,3 
tg μmáx μmáxbactérias > μmáx leveduras > μmáx fungos filamentosos 
 Cinética de crescimento segundo a Equação de Monod 
 Determinação de máx pela técnica de wash out 
 Para processo contínuo 
 Trabalha-se com D >>> μmáx: 
 Remoção da biomassa microbiana por conta da excessiva alimentação 
o Arraste de células 
 Através das equações do balanço de massa para células, tem-se que: 
𝑉
𝑑𝑋
𝑑𝑡
𝑎𝑐
= 𝐹𝑋0 − 𝐹𝑋 + 𝑉
𝑑𝑋
𝑑𝑡
𝑔
 
𝑑𝑋
𝑑𝑡
𝑎𝑐
= −𝐷𝑤𝑜𝑋 +
𝑑𝑋
𝑑𝑡
𝑔
 
÷ 𝑽 
÷ 𝑿 
1
𝑋
𝑑𝑋
𝑑𝑡
𝑎𝑐
= −𝐷𝑤𝑜 + 𝜇𝑚á𝑥 
𝑑 𝐿𝑛𝑋
𝑑𝑡
= −𝐷𝑤𝑜 + 𝜇𝑚á𝑥 
 Cinética de crescimento segundo a Equação de Monod 
 Determinação de máx pela técnica de wash out 
 Dwo e máx são 2 constantes 
 Após determinar máx , para 
determinar KS usa-se a expressão: 
𝐷 = 𝜇 = 𝜇𝑚á𝑥
𝑆
𝐾𝑆 + 𝑆
 
(Monod!) 
 Efeitos de inibição 
 por falta de predição de fenômenos inibitórios, a equação hiperbólica de 
Monod ficou respeitada e é utilizada até os dias atuais nos estudos cinéticos 
 no entanto, a ausência de inibição é na verdade uma situação pouco 
comum de ocorrer na prática 
 principalmente em cultivos descontínuos, onde ocorre um acúmulo 
de metabólitos que acabam interferindo desfavoravelmente no 
metabolismo e crescimento microbiano 
 a inibição é um fenômeno que não pode ser ignorado, entretanto: 
 valores muito elevados de substrato (ideais para obter elevadas 
concentrações de produto) → também podem gerar limitações 
físicas na célula 
o variam a pressão osmótica 
 leva o micro-organismo a perder água 
• alterando sua capacidade metabólica 
 Efeitos de inibição 
 Aspecto mais real da curva de Monod 
curva sem 
inibição 
curva com 
inibição 
𝜇 =
𝜇𝑚á𝑥
𝐾𝑆
∙ 𝑆 
𝜇 = 𝜇𝑚á𝑥
𝑆
𝐾𝑆 + 𝑆
 
𝜇 =
𝜇𝑚á𝑥 ∙ 𝐾𝑖
𝐾𝑖 + 𝑆
 
 Região a: baixas 
concentrações de 
substrato 
 KS + S = KS 
 Região b: equação 
de Monod é válida 
em sua integridade 
 Região c: expressão 
modificada levando 
em conta a inibição 
pelo substrato 
 Outros modelos de base Monodiana 
𝜇 = 𝜇𝑚á𝑥
𝑆1
𝐾𝑆1 + 𝑆1
𝑆2
𝐾𝑆2 + 𝑆2
 
 Dupla limitação por substrato 
 Sinclair 
𝜇 = 𝜇𝑚á𝑥
𝑆
𝐾𝑆 + 𝑆 +
𝑆
𝐾𝑖
2 
 Inibição pelo substrato 
 Andrews 
 Outros modelos de base Monodiana 
𝜇 = 𝜇𝑚á𝑥
𝑆
𝐾𝑆 + 𝑆
𝐾𝑃
𝐾𝑃 + 𝑃
 𝜇 = 𝜇𝑚á𝑥
𝑆
𝐾𝑆 + 𝑆
𝑒 −𝐾𝑃∙𝑃 
𝜇 = 𝜇𝑚á𝑥
𝑆
𝐾𝑆 + 𝑆
1 − 𝐾𝑃 ∙ 𝑃 
 Inibição pelo produto 
 Aiba  Sinclair 
 Kossen 
𝜇 = 𝜇𝑚á𝑥
𝑆
𝛽𝑋 + 𝑆
 
 Efeito da inibição global 
 Contois 
 Tipos de inibições 
 alterando as condições de 
cultivo (substrato, condições 
ambientais), os perfis de 
inibição podem obter variações 
para um mesmo processo 
(mesmo micro-organismo). 
 dentre as classificações, as 
inibições podem ser: 
 Não competitiva: não 
afetam KS e afetam máx 
 Competitiva: afetam KS e 
não afetam máx 
 
 Variáveis que afetam μ 
 para cada espécie microbiana existem valores ótimos dos parâmetros 
ambientais que lhe proporcionam as taxasmais rápidas de atividade e 
crescimento 
 exemplo: temperatura, pH 
 quando estes valores se encontram acima ou abaixo do ótimo → o 
crescimento é mais lento 
 será nulo se forem ultrapassados os valores críticos 
• máximo ou mínimo 
 espécies que conseguem crescer em condições extremas →facultativas ou 
tolerantes (em relação ao parâmetro considerado) 
 micro-organismos que conseguem apenas multiplicar-se dentro de limites 
estreitos de condições ambientais → estritos ou obrigatórios (quanto ao 
parâmetro em questão) 
 Variáveis que afetam μ 
 Temperatura 
 Por ser um sistema multienzimático, as reações individuais que ocorrem 
dentro da célula são influenciadas pela temperatura, analogamente ao que 
ocorre na cinética da ação enzimática 
 Variáveis que afetam μ 
 pH 
 O pH externo numa 
fermentação usualmente tem 
um efeito menor sobre a 
atividade biológica do que a T 
 A célula é razoavelmente 
capaz de regular sua 
concentração interna de 
H+ em concentrações 
externas adversas 
 A necessidade em 
energia de 
manutenção é 
afetada 
 Variáveis que afetam μ 
 Atividade de água (aw) 
 relacionada à disponibilidade da água para a atividade microbiológica, 
enzimática ou química 
 também conhecida como pressão de vapor relativa 
𝑎𝑊 =
𝑃
𝑃0
 
0 < aw < 1 
pressão de vapor de uma solução 
pressão de vapor da água pura 
ausência de água livre água pura 
 Variáveis que afetam μ 
 Pressão osmótica 
 Relacionada à concentração de solutos dentro da célula e no ambiente em 
que ela se encontra 
 Determinação do coeficiente de manutenção energética 
 Determinação do coeficiente de manutenção energética 
 substrato ligado ao 
crescimento celular, que vai 
ser incorporado à massa 
celular; síntese de novas 
células 
 plasticidade celular 
(biomassa) 
 substrato ligado à manutenção 
da célula num estado viável 
 não irá para constituição de 
material celular ou produto 
 manutenção endógena 
 metabolismo basal 
(motilidade, transporte 
osmótico, etc.) 
−𝑌𝑋
𝑆 
=
∆𝑋
∆𝑆 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙
=
𝑑𝑋
𝑑𝑡 
𝑑𝑆
𝑑𝑡 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙
=
𝑑𝑋
𝑑𝑡 
𝑑𝑆
𝑑𝑡 𝑔
+ 𝑑𝑆 𝑑𝑡 𝑚
 
coeficiente 
de conversão 
de substrato 
em células 
 Determinação do coeficiente de manutenção energética 
𝑑𝑆
𝑑𝑡
𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙
= −
1
𝑌𝑋
𝑆 
𝑑𝑋
𝑑𝑡
= −
1
𝑌𝑋
𝑆 
𝜇𝑋 
𝑑𝑆
𝑑𝑡
𝑔
= −
1
𝑌𝑔
𝑑𝑋
𝑑𝑡
= −
1
𝑌𝑔
𝜇𝑋 
𝑑𝑆
𝑑𝑡
𝑚
= −𝑚𝑋 
𝑑𝑆
𝑑𝑡
𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙
=
𝑑𝑆
𝑑𝑡
𝑔
+
𝑑𝑆
𝑑𝑡
𝑚
 
−
1
𝑌𝑋
𝑆 
𝜇𝑋 = −
1
𝑌𝑔
𝜇𝑋 −𝑚𝑋 
1
𝑌𝑋
𝑆 
=
1
𝑌𝑔
+
𝑚
𝜇
 coeficiente de 
manutenção 
energética 
(gS/gX.h)