Cinética de crescimento microbiano aula 1

Prévia do material em texto

A realização de um bioprocesso está intimamente ligada à interação entre: 
 Micro-organismo  Meio Ambiente 
 Desta forma, conhecer a morfologia e a 
fisiologia microbiana, bem como seu 
tipo de reprodução, são extremamente 
úteis para entender de que forma estes 
micro-organismos crescem. 
Crescimento Celular 
 relaciona-se ao 
aumento de todos 
os constituintes 
celulares 
 aumento da massa 
celular 
 É importante ressaltar que crescimento e multiplicação microbianos são conceitos 
que, embora sejam sinônimos, têm diferentes significados: 
Multiplicação 
celular 
 relaciona-se ao 
aumento do 
número de 
indivíduos da 
população 
celular 
Crescimento de uma população microbiana 
 aumento do número de células e de massa de todo o material celular. 
 Bactérias 
 procariotos 
 possuem constituição 
celular mais simples, 
sendo capazes de 
metabolizar os 
nutrientes muito mais 
rapidamente 
o tempo de 
geração é muito 
menor 
 Fissão binária 
 Leveduras 
 eucariotos 
 apresentam 
constituição 
celular mais 
complexa 
o tempo de 
geração é 
maior 
 Gemulação 
Levedura em processo de brotamento 
(microscópio eletrônico de varredura - MEV) 
 Leveduras 
 Gemulação 
Estrutura interna de uma 
levedura formando broto 
Cicatrizes deixadas 
pelas divisões 
 A cada gemulação 
surgem cicatrizes 
na célula mãe que 
podem ser 
identificadas por 
microscopia 
eletrônica 
(fluorescência), 
podendo 
determinar 
quantas vezes a 
célula gerou uma 
célula filha. 
 Actinomicetos e Fungos Filamentosos 
Microscopia ótica de actinomiceto em lente de 100X 
Microscopia de varredura eletrônica de 
micélio fúngico de Penicillium sp. 
(aumento de 1560 x) 
 Crescimento micelial 
 crescem 
formando 
emaranhados 
que 
apresentam 
problemas 
difusionais e 
de 
transferência 
de massa 
(produtos e 
nutrientes) 
 Tempo de geração ou tempo de duplicação celular 
 Como resultado do crescimento celular, cada vez que duplica o número 
de células de uma população dá-se uma geração 
 Assim, o tempo que uma determinada população leva para 
duplicar o seu número é designado por tempo de geração ou 
tempo de duplicação 
 A duração do tempo de duplicação ou tempo de geração celular 
aumenta a medida que aumenta a complexidade celular 
tg bactérias < tg leveduras < tg fungos filamentosos 
 Conceitos de microbiologia são extremamente válidos para 
escolher o método adequado para quantificar células de um 
cultivo 
A seleção do método adequado vai depender: 
da forma e da condição em que a célula se encontra 
da forma do cultivo 
superfície 
processo submerso 
 Requisitos para a escolha do método 
 Acurácia/sensibilidade 
 Baixo custo 
 Operacionalidade (simplicidade) 
 Aplicabilidade ao processo 
é a medição ou contagem do número ou massa de 
células ([X]) em um dado momento (tempo t) 
 Métodos diretos 
 envolvem a avaliação do 
próprio crescimento 
celular através da medida 
direta da biomassa gerada 
Métodos indiretos 
 envolvem a medida de um 
componente que tenha estreita 
relação com o crescimento 
celular 
 devem envolver medidas de 
componentes que não variem 
com a variação de  (taxa 
específica de crescimento) 
 Métodos diretos 
 Determinação do número de 
células 
o Contagem ao microscópio 
o Contagem de colônias 
formadas (plaqueamento) 
o Número mais provável 
o Contagem eletrônica (Contador 
Coulter; Citometria de fluxo) 
 Determinação da biomassa 
microbiana 
o Peso Seco 
o Absorvância ou Turbidimetria 
o Volume de Centrifugado 
o Viscosidade 
Métodos indiretos 
 Constituintes celulares 
o Concentração total de N 
o Conteúdo proteico 
o ATP 
o DNA 
o RNA 
 Dosagem de elementos do meio 
de cultura 
o Substrato 
o Produção de CO2 
 Uma suspensão contendo as células são dispostas 
em uma lâmina reticulada de dimensões 
conhecidas e levadas a uma câmara de contagem 
(câmara de Neubauer) 
 É um método simples e rápido 
 Só permite distinguir células vivas e mortas se 
forem utilizados corantes vitais (ex.: azul de 
metileno) 
 Desvantagens 
 
 por ser um método de contagem, pode ser 
pouco preciso 
 não é adequado para suspensões celulares de 
baixas densidades 
 células móveis devem ser imobilizadas 
 Métodos diretos 
 Determinação do número de células 
o Contagem ao microscópio 
Recomendado: 50—60 células por campo 
 Métodos diretos 
 Determinação do número de células 
o Contagem ao microscópio 
 Métodos diretos 
 Determinação do número de células 
o Contagem de colônias formadas (plaqueamento) 
 Método útil aplicado ao isolamento de micro-
organismos que se encontram na natureza 
 É baseado no princípio de que cada célula viva é uma 
unidade formadora de uma colônia (UFC) de células 
 Permite a contagem de células vivas ou isolamento de 
micro-organismos da natureza 
 Desvantagens 
 
 É um método demorado, pois é necessário realizar 
o plaqueamento e esperar de 24 a 48 horas até a 
formação das colônias 
 Pode ser necessário o uso de diluições das 
suspensões celulares para que se tenham 
números contáveis 
 Não permite distinguir células vivas de mortas, já 
que somente células vivas formam colônias 
 Métodos diretos 
 Determinação do número de células 
o Contagem de colônias formadas (plaqueamento) 
 Diluições 
seriadas e 
contagem em 
placas 
Recomendado: 30—300 UFC por placa 
 Métodos diretos 
 Determinação do 
número de células 
o Contagem de 
colônias 
formadas 
(plaqueamento) 
 Pour plate 
 Espalhamento em placa 
 Métodos diretos 
 Determinação do número de células 
o Número mais provável (NMP) 
 Método que permite estimar a densidade de 
micro-organismos viáveis presentes em uma 
amostra 
 Pela proporção de tubos positivos (turvos) 
em cada uma das diluições, determina-se o 
NMP de micro-organismos por quantidade 
de amostra 
 O cálculo é obtido a partir dos resultados 
obtidos na prática recorrendo-se a tabelas 
adequadas (ex.: Hoskins) 
 Métodos diretos 
 Determinação do número de células 
o Número mais provável (NMP) 
Algumas tabelas ainda informam as quantidades 
inferiores e superiores possíveis e a confiabilidade (%) 
 Métodos diretos 
 Determinação do número de células 
o Contagem eletrônica 
 Contador Coulter 
 Composto por 2 câmaras, um sistema de detecção 
de partículas e um analisador 
 As células devem ser suspensas em um fluido 
condutor que passa de uma câmara para outra 
através de uma abertura minúscula por onde 
também passa corrente elétrica 
 Cada vez que uma célula passa pelo orifício, 
instantaneamente muda a resistência do 
sistema 
 Essa mudança é detectada e medida por 
eletrodos contidos nas duas câmaras 
 A grandeza da alteração da tensão elétrica 
é proporcional ao volume da célula 
 Permite contar rapidamente um grande número de 
células diminuindo o erro de contagem 
 Métodos diretos 
 Determinação do número de células 
o Contagem eletrônica 
 Contador 
Coulter 
 Métodos diretos 
 Determinação do número de células 
o Contagem eletrônica 
 Citometria de fluxo 
 Técnica utilizada para contagem e 
análise de partículas 
microscópicas suspensas em 
meio líquido em fluxo 
 Monitoração em tempo real do 
estado fisiológico de cada célula 
durante o bioprocesso 
Laser 
Câmara de fluxo 
Coleção de lentes 
Filtros ópticos 
combinados 
com 
detectores de 
luz 
Sistema 
eletrônico 
 Citometria de fluxo 
 Um citômetro é um sistema que consiste de 5 elementos: 
 Métodos diretos 
 Determinação do número de células 
o Contagem eletrônicaMétodos diretos 
 Determinação do número de células 
o Contagem eletrônica 
 Citometria de fluxo 
 Métodos diretos 
 Determinação da biomassa microbiana 
o Peso Seco  determinação da biomassa após 
filtração 
 membranas milipore 
 0,45 m → leveduras 
 0,22 m → bactérias 
 secagem em luz infravermelho ou em 
estufa até obtenção de massa constante 
 não distingue células vivas e células 
mortas 
 não pode ser usado quando há sólidos 
em suspensão 
 pode ser aplicado para qualquer grupo 
de micro-organismos 
 normalmente é usado associado a 
métodos de medida da absorvância 
(turbidez) da solução 
 Métodos diretos 
 Determinação da biomassa microbiana 
o Absorvância ou Turbidimetria 
 é um método físico-químico de medida da turvação de uma cultura com base na 
intensidade da luz transmitida através da cultura e medida da absorvância em 
espectrofotômetro 
 pode ser aplicado a micro-organismos unicelulares de forma regular 
 não é indicado para fungos filamentosos ou quando há sólidos em suspensão 
 Métodos diretos 
 Determinação da biomassa microbiana 
o Absorvância ou Turbidimetria 
 Obedece à Lei de Lambert-Beer: 
𝐴 = log
1
𝑇
= log
𝐼0
𝐼𝑡
= ξ × 𝐶 × 𝐿 absorvância 
transmitância intensidade de 
luz transmitida 
intensidade de 
luz incidente 
coeficiente molar 
de absorção 
espessura da 
solução 
concentração 
da solução 
 Métodos diretos 
 Determinação da biomassa microbiana 
o Absorvância ou Turbidimetria 
 É normalmente utilizado associado à determinação da biomassa por peso seco 
 curva padrão de relação entre concentração de células versus absorvância 
para dada suspensão 
y = 0.7063x 
R² = 0.9672 
0
0.2
0.4
0.6
0.8
0 0.5 1
ab
s 
[células] (g/L) 
 Métodos diretos 
 Determinação da biomassa microbiana 
o Volume de centrifugado 
 medida volumétrica onde um volume 
da suspensão celular é colocado em 
uma cubeta de centrifugação 
graduada e o volume de massa 
celular obtido após a centrifugação é 
observado 
 não é um método preciso ou 
quantitativo 
 é rápido 
 fornece apenas a estimativa do 
crescimento celular 
centrifugação 
condições padronizadas 
Avaliação qualitativa 
𝑑𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚é𝑡𝑟𝑖𝑐𝑎 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 =
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑚𝑎𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎𝑙 𝑠𝑒𝑑𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑑𝑜
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑢𝑠𝑎𝑑𝑜
 
 Métodos diretos 
 Determinação da biomassa microbiana 
o Viscosidade 
 Similar à curva padrão 
 Medições da 
viscosidade de 
diversas suspensões 
 curva de relação 
entre concentração 
de células versus 
viscosidade 
 
 Métodos indiretos 
 Cn(H2O)n + O2 + NH3 + P, S, K, Na, Mg, Ca, Fe 
 Substrato Sais Minerais 
 (CHNO)n+ CO2 + H2O + ∆H 
Biomassa Calor 
 de 
 reação 
multiplicação celular 
e/ou 
biossíntese 
 Estão presentes no 
meio fermentativo: 
Composto 
% em peso seco 
Bactérias Leveduras Fungos 
Proteínas 50-60 35-45 25-40 
Glicídios 6-15 30-45 40-55 
Lipídios 5-10 5-10 5-10 
Ac. Nucléicos 15-25 5-15 2-10 
Cinzas 4-10 4-10 4-10 
Composição química de micro-organismos 
 Métodos indiretos 
 Constituintes celulares 
o Concentração total de N 
 A dosagem de qualquer um dos 
principais componentes celulares 
pode fornecer uma avaliação da 
massa microbiana 
 Método para dosagem de N 
celular: 
 Kjedahl 
o N contido na matéria 
orgânica é convertido a 
(NH4)2SO4 por digestão 
com H2SO4, na presença 
de catalisador 
Composto 
% em peso seco 
Bactérias Leveduras Fungos 
C 46-52 46-52 45-55 
H 10 10 10 
O 20 20 20 
N 10-14 6-8,5 4-7 
S 0,2-1 0,01-0,03 0,1-0,5 
P 2-3 0,8-2,6 0,4-4,5 
Mg 0,1-0,5 0,1-0,5 0,1-0,3 
K, Ca 0,1-0,5 0,1-0,5 0,1-0,5 
Na, Fe 0,01-0,1 0,01-0,1 0,01-0,1 
Outros traços traços traços 
Composição elementar 
 Métodos indiretos 
 Constituintes celulares 
o Conteúdo proteico 
 Os métodos mais comuns de determinação proteica são: 
 biureto 
o útil pois mede ligações peptídicas com 
praticamente nenhuma interferência de outros 
compostos nitrogenados 
o muito utilizada para fungos 
 Lowry (colorimétrico) 
 análise de aminoácidos totais 
biureto 
Lowry 
 Métodos indiretos 
 Constituintes celulares 
o ATP 
 ATP é um intermediário de energia química 
para o crescimento e a biossíntese dos 
organismos vivos 
 A presença deste composto restringe-se às 
células 
 Sua concentração por unidade de massa celular 
é praticamente constante para determinado 
micro-organismo 
 Pode ser utilizada para medida 
quantitativa da massa celular presente 
 Como a quantidade de ATP muda em função do 
ambiente e da atividade metabólica, é 
necessário que as amostras sejam mergulhadas 
em ácido fosfórico (H3PO4) para preservar o 
conteúdo de ATP 
 Métodos indiretos 
 Constituintes celulares 
o ATP 
luciferina + O2 
(ambos em excesso) luciferase + Mg2+ 
oxiluciferina + CO2 + luz 
ATP AMP 
 Método: medida da bioluminescência (determinação espectrofotométrica) 
 Métodos indiretos 
 Constituintes celulares 
o DNA 
 O DNA provavelmente é o componente 
celular mais constante, além de não ser 
usualmente encontrado em materiais não 
celulares (tais como nutrientes) 
 Massa celular é proporcional ao DNA 
 Desvantagem: sua análise é laboriosa 
 usada em casos onde a especificidade 
é necessária para medida de massa 
celular (ex.: meios complexos 
heterogêneos) 
 Métodos: 
 difenilamina (reação DISHE) 
 brometo de etídio 
complexo corado azul 
(detecção a λ=600nm) 
aquecimento DNA 
+ 
difenilamina 
 Métodos indiretos 
 Constituintes celulares 
o DNA 
 Agente intercalante do DNA 
 Composto fluorescente à luz UV 
 Métodos indiretos 
 Constituintes celulares 
o RNA 
 A massa celular não é proporcional ao 
RNA, pois o mesmo depende em que 
fase de crescimento se encontra o 
micro-organismo, uma vez que 
encontra-se ligado à síntese de 
proteínas 
 Existem vários tipos de RNA 
 
 Método: espectrofotometria 
 Métodos indiretos 
 Dosagem de elementos do meio de cultura 
o Substrato 
 Estequiometria geral do crescimento: 
a CHxOy + b O2 + c HlOmNn CHαOβNδ + d H2O + e CO2 
açúcares aminoácidos micro-organismo 
 A medida da concentração do substrato pode ser 
relacionada estequiometricamente com a concentração 
celular 
 Ao passo que as células estão em crescimento, a 
massa de material celular seco aumenta, enquanto 
a quantidade de nutrientes disponíveis no meio 
diminui 
 Métodos: variam de acordo com o substrato analisado 
 Exemplo: 
o Açúcares: métodos colorimétricos ou HPLC 
 Métodos indiretos 
 Dosagem de elementos do meio de cultura 
o Produção de CO2 
 Assim como a quantidade de 
substrato, a quantidade de CO2 
produzida no crescimento celular 
também pode ser relacionada 
estequiometricamente com a 
concentração celular 
 Entretanto, existem fermentações 
onde não há produção de CO2 
o Exemplo: fermentação 
láctica 
 Métodos: 
 Analisador a gás no infravermelho 
 Cromatografia gasosa 
 Análise gravimétrica após 
precipitação com Ca(OH)2 
CO2 + Ca (OH)2  CaCO3  + H2O 
 Precipitado branco 
fermentômetro 
 Métodos indiretos 
 Dosagem de elementos do meio de cultura 
o Produção de CO2