Eletroforese e Southern Blotting em Biologia Molecular

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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE 
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA GERAL
BIOLOGIA MOLECULAR - SÍDIO WERDES MACHADO
CIÊNCIAS BIOLÓGICAS 2017.1
RELATÓRIO DA PRÁTICA II - SIMULAÇÃO DE ELETROFORESE E SOUTHERN BLOTTING
Alunos:
Alexia Costa
Amanda Hazan
Bianca Duque
Carina Araujo	Comment by Yanã Rizzieri: quem é?
Isabelle Assumpção
Isadora Lopes
Yanã Rizzieri.
NITERÓI, 2017.
INTRODUÇÃO
A eletroforese se trata de uma técnica de separação baseada no deslocamento de moléculas ionizadas, com base nos pesos moleculares e cargas elétricas em campos elétricos. Sendo assim, moléculas que possuem caráter positivo migram para o pólo negativo e as de caráter negativo migram para o de pólo positivo. A fim de manter o pH do meio constante, é confeccionada uma solução tampão que consiste em um tampão do gel e um tampão da cuba eletrolítica. O primeiro será utilizado na confecção do gel, enquanto que o segundo ficará junto aos eletrodos (EMBRAPA TRIGO, 2001).
A eletroforese pode ser executada em diferentes meios suporte. O gel de poliacrilamida e o gel de agarose são exemplos desses meios. A diferença entre os dois fica em relação à porosidade -a primeira apresenta poros mais finos que a segunda, sendo que o tamanho dos poros pode ser regulado com a concentração de agarose administrada-.(Walker & Rapley, 1999, apud EMBRAPA TRIGO, 2001). Além do tamanho dos poros, a temperatura é um outro fator que influencia no processo. Para que ocorra a regulação de uma temperatura adequada, o gel é resfriado antes de ser utilizado -evita, assim, desnaturação de enzimas, por exemplo-. Para que o processo tenha início, é necessária uma fonte de energia capaz de gerar voltagem, corrente e potência constantes (EMBRAPA TRIGO, 2001).
De acordo com a posição do gel, o processo de eletroforese pode ser classificado como vertical ou horizontal -fazendo com que a migração ocorra em uma posição ou outra-. Já quanto à porosidade, a classificação é feita como contínuo -o gel possui porosidade uniforme e o tampão utilizado tanto na confecção do gel quanto na cuba é o mesmo- ou descontínuo -em que o gel é constituído por um gel separador e um gel concentrador, e o tampão utilizado na confecção dos géis e na cuba são diferentes. Há, também, a forma unidirecional, onde os impulsos elétricos são dados em um sentido, e o bidirecional, onde os impulsos são dados em ambos os sentidos (Hames, 1981; Alfenas et al., 1999 apud EMBRAPA TRIGO, 2001).
Após a adição dos extratos (sejam eles DNA, RNA ou proteínas) e das soluções-tampão devidas e da separação molecular no gel (EMBRAPA TRIGO, 2001), o produto desse fracionamento é transferido para uma membrana suporte (BROWN, T. 2001). Com isso dá-se início ao método de blotting. O blotting é utilizado com base nas propriedades de hibridização das moléculas de ácidos nucleicos. Se os fragmentos a serem analisados forem de DNA, o processo é denominado Southern blotting (LIMA, de M. L., 2008).
O Southern blotting, é realizado em fases. Primeiro, o DNA entra em contato com enzimas de restrição e é dissociado do gel de agarose . Em seguida, ocorre a desnaturação e neutralização dos fragmentos de DNA de fita-dupla e a transferência deste para uma membrana -em geral de nylon ou nitrocelulose. Esta transferência é feita na presença de uma solução de alto teor salino que, por capilaridade, auxilia a fixação do DNA na membrana. O último passo é a imobilização do DNA na membrana, através do calor -no caso da nitrocelulose- ou da radiação ultravioleta -no caso do nylon-. Com o auxílio de sondas de DNA ou RNA marcadas radioativamente, o DNA é hibridizado e a sequência desejada pode ser identificada por meio de radiografia. (AUSUBEL et al., 2003; HARWOOD, 1996; WEAVER, 2001, apud LIMA, de M. L., 2008; BROWN, T. 2001).
Além desse modelo existem outros dois: o Western blotting e o Northern blotting. O Northern blotting é semelhante ao método anterior, mas este é realizado para a análise de RNA -identificação de sequências específicas (LIMA, de M. L., 2008). Já o Western blotting, é uma técnica usada para identificar proteínas específicas. Nessa última, são utilizados ligações proteína-anticorpo para a indicação daquela desejada.
O desenvolvimento a seguir irá focar no processo de Eletroforese e na técnica de Southern blotting, utilizando de diferentes corantes que desencadeiam resposta semelhante à fragmentos de DNA.
2. OBJETIVOS
Explicar o princípio da técnica de eletroforese em gel de agarose, assim como a metodologia utilizada no Southern Blotting e analisar o gel resultante da técnica.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
Azul de bromofenol
Anilina roxa
Anilina pink
Anilina vermelha
Hematoxilina
Comassie blue
Xileno cianol
Gel de agarose 
Tampão TAE 50X
O equipamento utilizado para a eletroforese consiste basicamente de dois itens: uma fonte de tensão e uma unidade de eletroforese. Foi utilizado um gel para eletroforese vertical, sendo ele formado entre duas placas de vidro separadas por um espaçador. A agarose foi então solubilizada em água quente e despejada na cubeta com os pentes posicionados. Após o resfriamento do gel, os pentes foram retirados, formando assim as cavidades onde as amostras foram inseridas, e posteriormente acrescentada a solução tampão. O tamanho do poro do gel é controlado pela concentração da agarose; sendo que poros grandes são formados em baixas concentrações e poros menores são formados em altas concentrações, portanto géis de agarose são utilizadas para separação de proteínas e ácidos nucleicos
 Seguidamente, foram colocados, em poços diferentes, tipos diferentes de corantes com a utilização de uma pipeta de 0,5 - 10μl e apenas 1μl por corante - nosso grupo utilizou o corante Xileno Cianol - para que assim fiquem na densidade correta . Quando preenchidos os poços, o gerador foi ligado criando uma corrente elétrica no conjunto. 
Figura 1: Ilustração do momento em que os corantes foi injetado nos poços -nesse caso, o Xileno cianol.
Após 20-30min na base do gel foi colocada uma folha de papel mata borrão, para carrear o líquido, e assim imersos em solução tampão de transferência apropriado, o qual é importante para manter constante o estado de ionização das moléculas que estão sendo separadas. O papel mata borrão foi colocado entre o gel e uma resma de papéis absorventes, que permitiram a transferência do tampão por capilaridade através do gel, pois o mata borrão puxa o tampão para cima, fazendo com que a água seja sugada pelo papel através da pressão. 
Quando uma diferença de potencial foi aplicada, moléculas com diferenças na carga líquida se separaram devido às diferentes mobilidades eletroforéticas, mesmo moléculas com carga similar sofreram separação devido às diferenças no tamanho, e, portanto, diferenças na força friccional experimentada.
Assim, uma vez removido o campo elétrico, quando a primeira molécula atingiu o eletrodo, os componentes da mistura ficaram separados no gel de acordo com a sua mobilidade eletroforética. As moléculas separadas foram então localizadas no gel por meio da diferença de coloração.
4. RESULTADOS
Como esperado, ocorreu a mobilidade eletroforética, dos corantes utilizados, através do gel de agarose e a formação dos extratos protéicos. Todos os corantes, com exceção da hematoxilina, correram para o lado positivo. O corante hematoxilina correu para o lado negativo, formando uma marcação azulada na parte de cima do gel. 
Além disso, apenas dois dos corantes utilizados se dividiram em dois: a anilina roxa, formada pela mistura de dois corantes com pesos diferentes, que dividiu-se em rosa e azul logo no início, e a anilina pink, que dividiu-se mais no final da placa. Dentre todos os corantes a anilina roxa foi o que correu menos e a Hematoxilina a que correu mais pelo gel. 
Figura 3 - Migração das moléculas pelo gel de agarose. 
5. DISCUSSÃO
A mobilidade eletroforética das moléculas através do gel de agarose é influenciadapor diversos fatores. Dentre eles destaca-se o peso molecular onde, através dele, podemos explicar por que a hematoxilina correu mais e a anilina roxa correu menos que os outros corantes. Como uma molécula migra na matriz de agarose de acordo com o seu tamanho e peso molecular, a hematoxilina, que apresenta o menor peso molecular, correu mais e a anilina roxa, que apresenta maior peso molecular, correu menos. 
De acordo com O’CONNELL et al. (2005), moléculas com carga negativa migram para o pólo positivo, enquanto as moléculas com carga positiva migram para o pólo negativo e as que apresentam cargas elétricas equilibradas irão permanecer estáticas. Portanto, infere-se que a migração do corante hematoxilina para o pólo negativo é, devido à sua natureza elétrica, positiva. 
	Na realização do teste foi observada a fragmentação de dois corantes diferentes. Estes corantes eram compostos que resultaram da mistura de outros dois corantes prévios. Na eletroforese, a força que impele a movimentação dos corantes é elétrica. Em contraponto, temos o atrito com o gel para reduzir esse deslocamento. Os corantes misturados tinham tamanhos moleculares diferentes; quando submetidos ao teste, então, foram separados pela força de atrito que foi maior nos corantes de maior tamanho molecular.
	A técnica de Southern Blot conta com três fases, sendo elas a desnaturação, na qual o gel onde foi feita a eletroforese de DNA é tratado com uma solução alcalina (tipicamente contendo hidróxido de sódio) para promover a desnaturação da dupla fita do DNA, separando-a em simples fitas. A desnaturação é necessária porque o DNA nas etapas seguintes irá aderir à membrana e irá parear com a sonda; a transferência do DNA para uma membrana, que consiste em uma membrana de nitrocelulose (ou, alternativamente, nylon) sendo posta sobre o gel. Uma pressão é aplicada uniformemente sobre o gel (tanto usando-se sucção, ou pondo-se sobre a membrana uma pilha de toalhas de papel com um peso em cima). Isso faz com que o DNA passe do gel para a membrana, onde ele se adere. A membrana é então aquecida (no caso da nitrocelulose) ou exposta a radiação ultravioleta (no caso do nylon) para permanentemente ligar o DNA à membrana; Por fim, o tratamento com a sonda que é quando membrana é tratada com uma sonda hibridizadora - que é uma molécula de DNA isolada cuja sequência é conhecida e é idêntica, ou então complementar, àquela sequência a qual se quer determinar a presença ou não na amostra (como as duas fitas da dupla hélice do DNA são complementares uma a outra, tanto faz escolher uma sonda que seja idêntica ou complementar à sequência procurada). A sonda de DNA é marcada de tal forma que permita ser detectada a sua presença, essa marcação é normalmente feita incorporando-se a ela átomos radioativos ou ligando-se a ela corantes fluorescentes ou cromogênicos (substâncias incolores que produzem cor ao interagirem com um determinado meio). Em alguns casos, a sonda hibridizadora pode ser feita de RNA, em vez de DNA. Essa sonda irá parear com qualquer sequência de DNA complementar a ela. Portanto se a sequência procurada não estiver presente na amostra não haverá o pareamento. O excesso de sonda é lavado da membrana e toda a sonda não hibridizada (não pareada) será removida. Depois disso, a presença ou não da sonda na membrana (e as posições onde ela está presente) é revelada por uma auto-radiografia em um filme de raio-x, ou pelo aparecimento de uma cor caso a marcação cromogênica tenha sido usada.
As manchas no Southern Blot mostram onde a sonda se hibridizou com a amostra e, conhecendo-se os pontos onde a amostra de DNA foi clivada, é possível então dizer em quais trechos a sequência procurada está ou não presente.
6. QUESTÕES
1. Qual a função do açúcar ou do glicerol nas amostras com corante?
R: O açúcar ou glicerol ajudam a fixar a solução tampão nos poços, uma vez que sua densidade é maior. 
2. Qual corante possui as menores moléculas? Explique.
R: Hematoxilina. O gel de agarose possui caráter de malha, ou seja, uma porosidade que permite a passagem de substratos. Essa porosidade pode ser controlada com a concentração de agarose. A densidade dos corantes é igual, logo, as bandas mais longes da origem possui um menor tamanho de suas moléculas, que atravessam os poros do gel com mais facilidade, alcançando maiores distâncias mais rapidamente que os maiores.
3. Qual corante se dividiu em duas bandas? Explique o motivo dessa divisão.
R: Dois corantes se dividiram: a anilina roxa e a anilina pink. A razão para essa divisão é o fato delas serem constituídas por uma mistura de dois corantes com pesos moleculares diferentes. 
4. Se fosse colocada uma amostra de DNA no gel de agarose, em qual posição o pente deve ser colocado? Explique.
R: Na região de menor distância do polo negativo. O DNA apresenta caráter negativo quando em pH fisiológico, devido aos grupos fosfatos; utilizamos, então, um tampão para que o pH esteja dentro desta faixa. Quando estabelecida uma corrente, o DNA será empurrado para a outra direção. A posição final das bandas será o resultado do teste.
5. O quadro abaixo representa o seu gel. Preencha-o com o nome de cada corante utilizado e aponte a direção e distância percorrida por cada amostra após a eletroforese.
R: Todos os corantes, com exceção da hematoxilina, irão correr em direção ao polo positivo. Estes direcionamentos dos substratos se dão pela sua afinidade elétrica. A hematoxilina se liga, por exemplo, nas colorações histológicas, aos núcleos celulares, demonstrando, então, um caráter positivo. Esse caráter, quando realizado o teste, aparece no deslocamento da hematoxilina em direção ao pólo negativo. 
7. REFERÊNCIAS 
Biomedicina Padrão, 2017. Disponivel em <http://www.biomedicinapadrao.com.br/2010/06/southern-blot.html>. Acesso 21 de junho de 2017.
Brown, T. 2001. Southern Blotting. Current Protocols in Immunology. 
Lima, de M. L. Conceitos básicos em técnicas de Biologia Molecular. Campina Grande, PB; Setembro de 2008.
Embrapa, 2001. Disppnível em <http://www.cnpt.embrapa.br/biblio/p_do06_2.htm> . Acesso em 20 de junho de 2017.
Mahmood T, Yang P-C. Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting. North American Journal of Medical Sciences. 2012.
O'CONNELL, T.; HORITA, T.; KASRAVI, B. (2005) Understanding and Interpreting Serum Protein Electrophoresis. Americal Family Physician. v.71, p. 105–112.