Apostila Bioquimica Experimental

Prévia do material em texto

Bioquímica Experimental – 
3º Quadrimestre de 2018 
Centro de Ciência Naturais e Humanas 
 
 
Professores: 
Giselle Cerchiaro (Prática, N) 
Luciano Puzer (Teoria, D e N) 
Vani Xavier de Oliveira Jr (Prática, D) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Prática 1: Crescimento da levedura 
 
 
 
Crescimento prévio da Levedura (Saccharomyces cerevisiae). 
 
Células obtidas de Fermento de pão. 
Meio YPD: 1L: 10 g de extrato de levedura/ 20 g de peptona/ 20 g de glicose – 
autoclavar antes do uso. Este meio deverá ser feito e autoclavado pelos 
técnicos 2 dias antes e estar pronto para o uso. Misturar em ambiente 
estéril (perto do fogo ou em capela de fluxo laminar) o meio de crescimento, a 
levedura, e manter sob agitação a 30C por 24 hr. Apos este período, deixar a 
levedura decantar por 1 hora e colocar na geladeira sem o sobrenadante para o 
uso na próxima aula. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Prática 2: Lise de Células de Levedura 
 
Orientações: 
a) PRÉ-RELATÓRIO: fluxograma completo do procedimento, seguindo as 
regras de elaboração de fluxogramas. 
b) RELATÓRIO responder às seguintes questões: 1) Qual a função do 
PMSF?; 2) Indicar com cálculos a preparação do tampão fosfato 
utilizado neste procedimento. 
 
Objetivo: Lise de células de Leveduras (Saccharomyces cerevisiae). 
 
Reagentes Materiais Instrumentos 
• Água destilada • Banho de gelo 
• Pérolas de vidro 0,5 
mm previamente 
tratadas com ácido 
sulfúrico 
• Pipetadores 
• Pipetas 
• Provetas 
• Suporte para tubos 
• Tubos falcon 15 e 50 
mL 
• Centrífuga 
• Estufa 
• Freezer 
• Vórtice 
• Células de levedura 
obtidas na aula anterior 
• Álcool etílico 
• Fluoreto de -
fenilmetilsulfonila 
(PMSF); 0,1 M em etanol 
+ coktail inibidor de 
proteases para leveduras 
• Hipoclorito de sódio 20 
g/L 
• * Tampão fosfato 100 mM, 
pH 7,0 com EDTA 5 mM 
(tampão lise) 
 
 
Procedimento: Lise celular 
 
1- Adicione aproximadamente 2 g de células de leveduras crescidas até a fase 
logarítmica tardia (peso úmido) em um tubo de centrífuga. 
2- Adicione 4mL de tampão de lise. 
Adicione várias pérolas de vidro à suspensão celular (1 espátula), e feche o tubo. 
 
3- Ressuspenda as células usando vórtice. 
4- Adicione 40 x 10-6 L (40 L) de PMSF 100mM em etanol e 10 L de cocktail 
inibidor de proteases e fosfatases para leveduras (Sigma). 
5- Homogeneíze usando vórtice. 
6- Agite ininterruptamente a suspensão usando o vórtice por um minuto e 
resfrie em gelo por um minuto. Repita este ciclo pelo menos mais 
quatro vezes (processo de lise). 
7- Centrifugue a suspensão de células contendo as pérolas a 850 g por dois 
minutos. 
8- Transfira cuidadosamente o sobrenadante para um tubo falcon limpo e 
identificado, evitando coletar o material sedimentado (precipitado). Esta 
porção é denominada Lisado. Mantenha o Lisado em banho de gelo. 
9- Ressuspenda o precitado juntamente com as pérolas de vidro em 4mL de 
tampão lise. 
10- Repita as etapas de 4 a 9 mais duas vezes. 
11- Reúna todos os lisados em um único frasco, e determine o volume de lisado 
obtido com uma proveta. 
12- Divida o lisado em três alíquotas de volumes idênticos e armazene em tubos 
plásticos falcon devidamente identificados como o nome do grupo. 
13- Armazene os tubos em freezer a -200C. 
 
Lavagem das pérolas de vidro. 
1- Transfira as pérolas de vidro para um erlenmeyer e adicione hipoclorito de 
sódio (água sanitária). As pérolas devem ficar na solução de hipoclorito de 
sódio por 15 minutos. Agite periodicamente. 
2- Em seguida, descarte cuidadosamente a solução de hipoclorito de sódio e 
repita o procedimento 1-2. 
3- Repita o procedimento 1-2 usando água destilada. 
4- Repita o procedimento 1-2 usando álcool etílico. 
5- Leve o erlenmenyer para a estufa e aguarde a secagem das pérolas. 
 
Prática 3: Quantificação de Proteína. 
 
Orientações: 
a) PRÉ-RELATÓRIO: 
1. Fluxograma completo do procedimento, seguindo as regras de 
elaboração de fluxogramas. 
2. Elaboração teórica do método de quantificação de proteínas 
utilizado; 
3. Construção da tabela da curva analítica a ser preenchida durante o 
procedimento. 
b) RELATÓRIO: cálculo da concentração de proteína total no lisado de 
Saccharomyces cerevisiae. 
 
 
Objetivo: Quantificar proteína do Lisado de Saccharomyces cerevisiae 
colorimetricamente. 
 
Reagentes Materiais Instrumentos 
• Água destilada • Banho de gelo • Vórtice 
• Lisado de levedura (F1) • Cubetas para leitura • Espectrofotômetro 
• Albumina Bovina 0,2 g/L 
em água 
• Pipetadores, pipetas, 
ponteiras 
 
• Reagentes de BradFord: 
• Ácido fosfórico 85%, 
• Azul de Coomassie G 
• Metanol 
• Tubos de ensaio e 
suportes 
• Papel de filtro 
 
 
 
Procedimento: 
Parte 1: Curva analítica de proteína. 
1 – Adicione os volumes das soluções de albumina, água, e reagente de Bradford 
destacados na Tabela 1. Homogeneíze em vórtice, e aguarde cinco minutos. 
2 – Use o branco para calibrar o instrumento de espectrofotômetro. 
3 – Determine a absorbância de cada padrão analítico em 595 nm. Para tanto, 
transfira o conteúdo do tubo para uma cubeta previamente lavada e seca, e leve 
para o espectrofotômetro. Registre a absorbância em 595 nm, e use o espaço na 
tabela 1 para anotar os respectivos valores. Lembre-se, a cubeta deve ser 
extensivamente lavada com água destilada e seca entre cada leitura. 
 
Observação 1: Sempre mantenha os tubos contendo o lisado em 
banho de gelo. 
 
Não podemos prever com segurança a quantidade de proteína em cada lisado, e 
consequentemente se a leitura estará dentro da faixa da curva analítica 
construída na parte 1. Assim, primeiramente, dilua a o lisado 100 vezes. Pipete 
0,1mL (100L) dos lisados (F1, F2, e F3) e adicione 9,9 mL de água destilada. 
Importante: Identifique cada tubo. Exemplo (F1-100x diluído) 
 
Tabela 1: Guia para fazer padrões e leitura espectrofotométrica. 
Tubo Albumina 
0,2 g.L-1 (L) 
Água 
(L) 
Bradford 
(mL) 
A 
(595 nm) 
Massa de 
proteína (mg) 
Branco 0 100 1 
1 10 90 1 
2 20 80 1 
3 40 60 1 
4 60 40 1 
5 80 20 1 
 
Parte 2: Quantificação de Proteína nos Lisados de Saccharomyces cerevisiae. 
 
Observação 2: Não podemos prever com segurança a quantidade de proteína 
em cada lisado, e consequentemente se a leitura estará dentro da faixa da curva 
analítica construída na parte 1. Assim, primeiramente, dilua o lisado 100 vezes. 
Pipete 0,1mL (100 L) dos lisados (F1, F2, e F3) e adicione 9,9 mL de água 
destilada. Importante: Identifique cada tubo. Exemplo (F1-100x diluído) 
 
Preparação da amostra. Prepare amostras de cada fração de lisados diluídos 
(F1-100 x diluído, etc) de acordo com a tabela 2 para as três frações de lisados. 
 
Tabela 2: Diluição e leitura das amostras. 
Tubo 100 x dil. 
(L) 
Água 
(L) 
Bradford 
(mL) 
A (595nm) Massa de 
proteína (mg) 
Branco 0 100 1 
1 100 0 1 
2 50 50 1 
3 10 90 1 
 
Se a leitura da absorbância das amostras se encontra dentro dos limites inferior 
e superior das absorbâncias dos padrões, repita o procedimento mais duas 
vezes. Caso contrário, primeiro calcule uma diluição apropriada baseado nos 
dados da tabela 2, e então repita o procedimento mais duas vezes. 
 
Prática 4 – Determinação da atividade 
enzimática de -glicosidase. 
 
Orientações: 
a) PRÉ-RELATÓRIO: 
1. Fluxogramacompleto do procedimento, seguindo as regras de 
elaboração de fluxogramas. 
2. Esquematização de como se calcula a atividade enzimática; 
3. Estrutura do p-nitrofenil-a-glicosídeo e sua função. 
b) RELATÓRIO: 1) gráfico do ensaio da atividade da enzima -glicosidase 
(nmols de produto x tempo) para as diferentes diluições do lisado (pH 
7,0). Utilize a curva padrão de p-nitrofenolato fornecida. 2) cálculo da 
atividade enzimática de -glicosidase (U/mL) e (U/mg) do lisado no pH 
7,0. Uma unidade de atividade (1U) é 1 mol de produto por minuto. 
 
 
Objetivo: Determinar a atividade enzimática de -glicosidase nos lisados de 
Saccharomyces cerevisiae. 
 
Reagentes Materiais Instrumentos 
• Água destilada • Banho de gelo • Vórtice 
• Lisado de levedura (F1) • Cubetas para leitura • espectrofotômetro 
• p-nitrofenil--glicosídeo 
(NPGlc) 4 mM em 
tampão fosfato 100 mM 
pH 7,0. 
• Pipetadores, Pipetas, 
Ponteiras 
• Tubos de ensaio e 
suportes 
• Banho a 30 0C 
• Tampão 
carbonato/bicarbonato 
250 mM, pH 11,0 
 
 
 
Observação 1: Sempre mantenha os tubos contendo o lisado e a 
amostra em banho de gelo. 
 
Procedimento: 
Diluição serial do lisado. Sugestão: 
1 – Transfira 0,2 mL do lisado de Saccharomyces cerevisiae para um tubo e 
adicione 1,8 mL de água destilada gelada. Identifique o tubo. Exemplo: D 10x. 
2 – A partir de D10x faça diluição 5 vezes (D50x), e a partir de D50x faça uma 
diluição de 10 vezes (D 500x). 
 
Determinação da atividade de -glicosidase 
1 - Primeiramente, identifique os vários tubos seguindo a tabela 1. 
2 - Novamente baseado na tabela 1, prepare os brancos (controles) e amostras 
em tubos de ensaio. 
 
Importante: 1) homogeneíze os lisados diluídos manualmente e com 
cuidado antes de aliquotá-lo. 2) sempre adicione o volume de lisado 
por último. 
 
3 - homogeneíze a solução manualmente e com cuidado, e transfira o tubo 
imediatamente para o banho a 30 0C. O tubo deve permanecer no banho pelo 
período de tempo estipulado na tabela 1. 
4 – Após o período de tempo estipulado, remova o tubo do banho e adicione 2 
mL do tampão carbonato-bicarbonato pH 11,0 imediatamente. Este 
procedimento deve interromper a atividade de -glicosidase. 
5 – Transferira o conteúdo do tubo para uma cubeta e faça a leitura 
espectrofotométrica em 420 nm. 
6 – complete a tabela 1 para as diferentes diluições. 
 
 
 
 
 
 
Tabela 1: Guia para preparação de brancos e amostras. 
Tubo Volume de 
Lisado (mL) 
Água 
(mL) 
Volume de 
NPGlc (mL) 
Tempo 
(min) 
A 
(420nm) 
Branco de 
lisado 
0 0,2 0,2 20 
Branco de 
substrato 
0,2 0,2 0 20 
1 0,2 0 0,2 5 
2 0,2 0 0,2 10 
3 0,2 0 0,2 15 
4 0,2 0 0,2 20 
5 0,2 0 0,2 25 
 
este branco deve ser preparado uma única vez, mesmo se o volume de lisado for 
diferente. 
 
Curva padrão de p-nitrofenolato. 
Prática 5: Estudo do pH ótimo para a 
atividade de -glicosidase. 
 
Orientações: 
a) PRÉ-RELATÓRIO: 
1. Fluxograma completo do procedimento, seguindo as regras de 
elaboração de fluxogramas. 
2. Pesquisar previamente qual o valor de pH ótimo para a atividade da 
α-glicosidase. 
b) RELATÓRIO: Com seus dados, calcule e apresente: 1) cálculo da 
atividade enzimática de -glicosidase (U/mL) nos diferentes pHs. 2) 
Construir a curva de pH ótimo da atividade de -glicosidase (U/mL). 
Ou seja, apresentar tabela e gráfico da atividade relativa (%) de -
glicosidase (U/mL) nos diferentes pHs. A atividade relativa em 
percentagem é a percentagem da atividade enzimática nos diferentes 
pHs com relação a maior atividade observada. 3) Determinar o valor 
de pH ótimo para a atividade de -glicosidase (U/mL). 
 
Objetivo: Estudar o efeito do pH na atividade enzimática de -glicosidase. 
 
Reagentes Materiais Instrumentos 
• Água destilada • Banho de gelo • Vórtice 
• Lisado de levedura (F1) • Cubetas para leitura • Espectrofotômetro 
• p-nitrofenil--glicosídeo 
(NPGlc) 8 mM em água 
• Pipetadores, Pipetas, 
Ponteiras 
• Banho a 30 0C 
• Tampão 
carbonato/bicarbonato 
250 mM, pH 11,0 
• Tubos de ensaio e 
suportes 
 
 
• Tampão fosfato 200 mM 
pH 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 
e 9,0 
 
 
Observação 1: Sempre mantenha os tubos contendo o lisado e de 
amostras em banho de gelo. 
 
Procedimento: 
Diluição do lisado de Saccharomyces cerevisiae. 
 
Proceder como descrito na apostila da prática 3. Prepare lisados com 
diluições de 10 vezes e 100 vezes. 
É PRECISO PREPARAR CERCA DE 7 mL DE LISADO DILUÍDO 
POIS SÃO UTILIZADOS 0,8 mL POR ENSAIO EM CADA pH. 
 
Ensaio da atividade enzimática de -glicosidase em diferentes 
concentrações hidrogeniônicas. 
1 – Identifique os vários tubos seguindo a tabela 1. 
2 – Baseado na tabela 1, prepare um conjunto de amostras para cada pH (4, 5, 6, 
7, 8, e 9). Lembre-se adicione o volume de lisado por último. 
 
Importante: 1) homogeneíze os lisados diluídos manualmente e com 
cuidado antes de aliquotá-lo. 2) sempre adicione o volume de lisado 
por último. 
 
3 - homogeneíze a solução manualmente e com cuidado e transfira o tubo 
imediatamente para o banho a 30 0C. O tubo deve permanecer no banho pelo 
período de tempo estipulado na tabela 1. 
4 – Após o período de tempo estipulado, remova o tubo do banho e adicione 
imediatamente 2 mL do tampão carbonato-bicarbonato pH 11. Este 
procedimento deve interromper a atividade de -glicosidase. 
5 – Transferira o conteúdo do tubo para uma cubeta e faça a leitura 
espectrofotométrica em 420 nm. 
6 – complete a tabela 1 para os diferentes pHs. 
 
 
Tabela 1: Guia para preparação de amostras nos diferentes pHs. 
Tubo Volume 
de Lisado 
(mL) 
Tampão Fosfato 
pH _____ 
(mL) 
Volume de 
NPGlc 
(mL) 
Tempo 
(min) 
A 
(420nm) 
1 0,2 0,1 0,1 5 
2 0,2 0,1 0,1 10 
3 0,2 0,1 0,1 15 
4 0,2 0,1 0,1 25 
 
 
Prática 6: Purificação de Proteínas – 
Cromatografia de troca iônica 
 
Orientações: 
a) PRÉ-RELATÓRIO: 
1. Fluxograma completo do procedimento, seguindo as regras de 
elaboração de fluxogramas. 
2. Planejar a pré-prática da aula 7. 
b) RELATÓRIO: 1) Determinar a atividade enzimática de -glicosidase no 
material purificado por cromatografia de troca iônica em U/mL. 2) 
Baseado na determinação em U/mL e no teor de proteína da mesma 
amostra, determinar a atividade enzimática específica de -glicosidase 
(U/mg de proteína). 3) Calcular a recuperação e o enriquecimento da -
glicosidase após a cromatografia de troca iônica. 
 
Objetivo – Purificar -glicosidase do lisado de Saccharomyces cerevisiae 
utilizando resina de troca iônica. 
 
Procedimento: 
Parte 1 – Preparação da resina e coluna de troca iônica. 
1.1 – Hidratação de DEAE-Sephadex 
(Executado por monitores e técnicos). 
1. Pesar 0,5 g de DEAE-Sephadex em um béquer. 
2. Adicionar 100 mL de tampão fosfato 10 mM pH 6,8. 
3. Misturar bem utilizando um bastão de vidro. 
4. Decantar por 24 horas. 
 
1.2 – Montagem da coluna de troca iônica. 
(Executado por monitores e técnicos) 
1. Prenda um barril de uma seringa plástica de 20 mL (suporte para 
como coluna) e acomode uma pequena porção de lã de vidro no seu 
interior. Compacte bem a lã de vidro com um bastão de vidro na base 
da seringa. 
2. Lave extensivamente a coluna com água destilada para remover 
fragmentos de lã de vidro. 
3. Adapte uma mangueira de aproximadamente 5 cm na saída da seringa 
(pipeta) e feche com uma presilha. 
4. Homogeneíze a suspensão contendo a resina (Parte 1)com um bastão 
de vidro e transfira a mesma para a seringa até a marca de 1 mL. 
Deixe decantar. 
5. Repita a operação até que a resina sedimentada ocupe o interior da 
seringa até a marca de 2 mL. 
6. Lave a coluna com 20 mL de tampão fosfato 10 mM (sem NaCl). 
7. Após a lavagem deixe cerca de três mm de tampão acima do topo da 
coluna de resina. 
8. Observe vazamentos na coluna. NUNCA PERMITA QUE A 
COLUNA SEQUE. 
 
Parte 2 – Preparação da amostra. 
1. Descongele o lisado e transfira 1,0 mL para um tubo “eppendorf ”. 
Centrifugue a 10.000 g por 15 segundos. Colete o sobrenadante com uma 
pipeta automática cuidadosamente. É muito importante que apenas 
o sobrenadante seja removido para evitar o entupimento da 
coluna cromatográfica. 
2. Separe 0,4 mL do sobrenadante para esta prática e congele o restante 
para ser utilizado na próxima prática. 
 
Parte 3 – Cromatografia. 
3. Adicione 0,6 mL de tampão fosfato 10 mM sem NaCl na fração de 
lisado. 
4. Abra a presilha cuidadosamente e permita que o tampão percole pela 
coluna até aproximadamente 3 mm acima do topo da resina. Feche a 
presilha. Adicione CUIDADOSAMENTE E LENTAMENTE a amostra 
(etapa 3) com uma pipeta sobre a coluna. É importante que a resina 
não se mova. 
5. Permita que a amostra percole pela coluna até aproximadamente 3mm 
acima do topo da resina. Feche a presilha. 
6. Adicione 2 mL de tampão fosfato 10mM sem NaCl sobre a coluna 
cuidadosamente e lentamente. 
7. Conecte o primeiro “eppendorf ” a saída da coluna. Abra a presilha 
cuidadosamente. Colete 1 mL (~20 gotas) em cada “eppendorf ” sempre 
transferindo o anterior para o banho de gelo e adicionando 1mL de 
tampão fosfato 10mM sem NaCl sobre a resina cuidadosamente e 
lentamente. Assim, deve sempre haver 2,0 mL de tampão acima do 
topo da resina. 
8. Após o OITAVO EPPENDORF colete mais dois tubos sem adicionar 
tampão. 
 
Cuidado. Feche a presilha quando o tampão estiver 
aproximadamente 3mm acima do topo da resina. Não permita que a 
coluna seque. 
 
9. Adicione 2,0 mL de tampão fosfato 10 mM com NaCl 2,0 mL 
(100mM) 
10. Repita o procedimento do item 7 mais dezoito vezes e também o item 8 
uma única vez.
Parte 4 – Identificação das frações que contém a enzima -
glicosidase. 
 
1. Prepare e identifique 20 tubos “eppendorf ”. 
2. Adicione a cada tubo 0,2 mL de NPGlc. Transfira os tubos para o banho 
de gelo. 
3. Adicione 0,2 mL das frações coletadas na parte 3, homogeneíze bem, e 
leve imediatamente todos os tubos para um banho a 300C por 10 
minutos. 
4. Remova cada tubo do banho e adicione 2mL de tampão bicarbonato-
carbonato pH 11,0. Homogeneíze bem, e deixe os tubos a temperatura 
ambiente. 
5. Calibre o espectrofotômetro com água destilada e leia a absorbância da 
solução de cada tubo em 420 nm. Identifique os tubos que contêm -
glicosidase. 
6. Reúna as frações da cromatografia correspondentes aos tubos que 
contêm -glicosidase. 
 
Pré-prática 7. 
 
Preparação das amostras para gel SDS-PAGE. 
 
Serão utilizadas as seguintes amostras: 
a) lisado de Saccharomyces cerevisiae 
b) frações purificadas por cromatografia de troca iônica contendo 
-glicosidase. 
 
Concentração das amostras 
 Siga as instruções do seu professor para concentrar as suas amostras. 
Depois de concentradas adicione 500µL de água e as faça a 
diálise das amostras. 
Diálise das amostras 
 
a. Transfira o volume de amostra indicada acima para um microtubo 
(eppendorf). Identifique cada tubo (grupo e número da amostra). 
b. Se necessário, complete o volume com água destilada para 600 L. 
c. Em água destilada fervente (CUIDADO) adicione o pedaço da 
membrana de diálise a ser utilizado, deixando por 5-10 minutos, 
trocando 1 vez a água. No final do processo, passe a membrana por 
água destilada fria, manipulando-a sempre com luvas. 
d. Usando um anel de borracha, tampe e lacre bem o microtubo com 
um pedaço de membrana de diálise, previamente fervida. 
e. coloque os microtubos selados com membrana em um suporte de 
isopor. 
f. coloque o suporte de isopor em um béquer com 1 L de água. 
Mantenha sob agitação por pelo menos 16 horas. (Venha no dia 
seguinte para retirar suas amostras e levar para concentrar). 
 
Dosagem de proteínas. 
1. Determine o teor de proteínas nas amostras purificadas e selecionadas 
nas etapas anteriores. Para tanto, repita o procedimento da prática 2(#). 
 
Esta atividade será realizada durante o período de 
polimerização do gel de acrilamida. 
 
 
 
 
 
 
 
Prática 7 e 8 – Purificação de proteínas – 
SDS-PAGE 
 
Orientações: 
a) PRÉ-RELATÓRIO: 
1. Fluxograma completo do procedimento, seguindo as regras de 
elaboração de fluxogramas. 
2. Determine qual o volume de amostra será utilizado nesta prática 
para carregar o gel de poliacrilamida, com base na pré-prática 7. 
b) RELATÓRIO: 1) Identificar a banda correspondente a -glicosidase no 
gel. 2) Calcular o provável padrão molecular relativo da enzima -
glicosidase baseado nos padrões utilizados na eletroforese em gel. 
 
Objetivo: Analisar a composição de proteínas do material que contém -
glicosidase separado por cromatografia de troca iônica. 
 
Material e soluções (preparados por técnicos e monitores) 
 
Solução 1: 
Reagentes Massa / Volume 
Acrilamida 29,2 g 
N’N’bis metilenoacrilamida 0,8 g 
Água destilada 100 mL 
 
Solução 2: 
Reagentes Observação 
Tris 1,5 M pH 8,8. Corrigir pH com HCl 
 
Solução 3: 
Reagentes Observação 
Tris 0,5 M pH 6,8. Corrigir pH com HCl 
 
Tampão de Amostra: 
Reagentes Massa / Volume 
Água 3,55 mL 
Solução C 1,25 mL 
Glicerol 2,5 mL 
SDS 100g/L 2,0 mL 
Azul de bromofenol 5 g/L 
-mercaptoetanol 0,05 mL 
 
Tampão de Corrida: 
Reagentes Massa / Volume 
Tris 3,3 g 
Glicina 14,4g 
SDS 1,0 g 
Água 1 L 
 
Solução de Coloração: 
Reagentes Massa / Volume 
Azul de Comassie R 0,1 g 
Metanol 40 mL 
Ácido acético 10 mL 
Água 50 mL 
 
Solução de Descoloração: 
Reagentes Massa / Volume 
Metanol 40 mL 
Ácido acético 10 mL 
Água 50 mL 
 
 
 
 
 
Procedimento. 
Parte 1 – Prática 7 Preparação do gel de SDS-PAGE. (realizado por 
técnicos e monitores) 
Gel de separação 
1. Em um tubo falcon de 15 mL, adicione: 
4,0 mL de água destilada, 
100 L de SDS (100 g/L), 
3,33 mL da solução 1, 
2,5 mL da solução 2, 
5 L TEMED, e 
50 L de persulfato de amônio (descongelar alíquota no dia). 
2. Homogeneíze rapidamente. 
3. Transfira a mistura para as placas de vidro previamente montadas utilizando 
uma pipeta de Pasteur. Aguarde a polimerização por 60 minutos. 
4. Coloque o pente sobre as placas de vidro. 
 
Durante o período de polimerização do gel, realizar a dosagem do 
teor de proteínas nas amostras purificadas e selecionadas nas 
etapas anteriores. Para tanto, repita o procedimento da prática 
2(#). 
 
Gel de empilhamento 
1. Em um tubo falcon de 15 mL, adicione: 
3,5 mL de água destilada, 
50 L de SDS (100 g/L), 
0,65 mL da solução 1, 
1,25 mL da solução3, 
5 L TEMED, e 
25 L de persulfato de amônio (Preparação da solução na hora do uso 
apenas para todos os grupos pelo técnico. No máximo 15 min antes do uso). 
 
2. Transfira a mistura para as placas de vidro (com o pente) contendo o gel de 
separação já polimerizado. Aguarde a polimerização por 40 minutos. 
3. Retire cuidadosamente o pente para não danificar as camadas de gel. 
 
Desnaturação das proteínas nas amostras. 
1. Adicione 100 µg das amostras já dialisadasem ependorfs previamente 
identificados. Em outros outros dois ependorfes distintos adicione as 
amostras de Hemoglobina e BSA (albumina sérica bovina) previamente 
preparados de maneira que a massa final seja de 100 µg. 
2. Adicione o tampão da amostra para cada microtubo de cada amostra, de 
maneira que o volume final seja de 25 µL. 
3. Leve os microtubos para um banho fervente e espere 10 minutos. 
 
PARTE 2 – Pratica 8 
Eletroforese. 
Obs. Retire cuidadosamente o pente para não danificar as camadas de gel, ao 
ser colocado na cuba de corrida com o tampão de corrida. 
1. Com o auxilio de micropipetadores, aplique cada amostra sobre cada 
canaleta do gel. No primeiro poço será aplicado um padrão de peso 
molecular. 
2. Correr a eletroforese com 100 V por aproximadamente 40 minutos. 
3. Desligue o instrumento, retire o gel cuidadosamente e guarde-o de 
acordo com as orientações do professor. 
 
Pratica 8 – Coloração do Gel de Eletroforese 
 
4. Coloque o gel no frasco contendo a solução de coloração e espere cerca de 
30 minutos ou 30 segundos usando forno de microondas (neste caso o 
gel deve ficar totalmente submerso na solução). 
5. Retire o gel do frasco, e coloque no frasco contendo a solução de 
descoloração, por mais 30 segundos no microondas. Quando o gel estiver 
descorado, retire-o. 
6. Observe e compare as bandas das proteínas. Fotos do gel corado em alta 
resolução podem ser retiradas. 
 
 
 
Prática 9 – Cinética da enzima -
glicosidase. Caracterização da enzima por 
parâmetros cinéticos. 
 
Orientações: 
a) PRÉ-RELATÓRIO: 
1. Fluxograma completo do procedimento, seguindo as regras de 
elaboração de fluxogramas. 
b) RELATÓRIO:Construir o gráfico de Michaelis-Menten e Lineweaver-
Burk na ausência do inibidor e determine VMAX e Km. 
 
Objetivos – Determinar parâmetros cinéticos da -glicosidase (Km e VMax). 
Caracterizar -glicosidase por padrões cinéticos. 
 
Reagentes Materiais Instrumentos 
• Água destilada • Banho de gelo • Vórtice 
• Lisado de levedura (F1) • Cubetas para leitura • Espectrofotômetro 
• p-nitrofenil--glicosídeo 
(NPGlc) 1,0 mM, 2,0 mM, e 
8,0 mM em tampão fosfato 
100 mM pH 7,0. 
• Pipetadores, 
Pipetas, Ponteiras 
• Tubos de ensaio e 
suportes 
• Banho a 300C 
• Tampão carbonato/bicarbonato 
250 mM, pH 11,0 
• Tampão fosfato 100 mM pH 7,0 
 
Procedimento. 
Parte 1 – Preparação das amostras dos lisados de Saccharomyces cerevisiae. 
1. Utilize o mesmo procedimento de diluição utilizado na prática 3. 
 
Observação 1: Caso seja impossível utilizar o procedimento de 
diluição da prática 3, siga o procedimento abaixo. Note que o 
volume necessário é de 5,0 mL. 
 
2. Transfira 0,1 mL do lisado de Saccharomyces cerevisiae para um tubo e 
adicione 0,9 mL de água destilada. Homogeneíze suavemente. 
Identifique este tubo como D10X. 
3. Transfira 0,5 mL do tubo D10X, e adicione 4,5 mL de água destilada. 
Homogeneíze suavemente. Identifique este tubo como D100X. 
 
Determinação da atividade de -glicosidase 
1 - Primeiramente, identifique os vários tubos seguindo a tabela 1. 
2 - Novamente baseado na tabela 1, prepare as amostras em tubos de ensaio. 
 
Importante: 1) homogeneíze os lisados diluídos manualmente e com 
cuidado antes de aliquotá-lo. 2) sempre adicione o volume de lisado 
por último. 
 
3 - homogeneíze a solução manualmente e com cuidado, e transfira o tubo 
imediatamente para o banho a 300C. O tubo deve permanecer no banho 
pelo menos o dobro do período de tempo usado na prática 3. (Se 
possível, testar periodicamente para monitorar o andamento da reação). 
4 – remova o tubo do banho e adicione 2 mL do tampão carbonato-bicarbonato 
pH 11,0 imediatamente. Este procedimento deve interromper a atividade de -
glicosidase. 
5 – Transferira o conteúdo do tubo para uma cubeta e faça a leitura 
espectrofotométrica em 420nm. 
 
 
 
 
Tabela 1: Guia para preparação de brancos e amostras. 
 
Tubo 
Tampão fosfato 
100mM pH 7,0 (mL) 
NPGlc (mL) Lisado 
(mL) 
A 
(420nm) 1,0 mM 2,0 mM 8,0 mM 
1 0,28 0,02 - - 0,1 
2 0,26 0,04 - - 0,1 
3 0,22 0,08 - - 0,1 
4 0,18 0,12 - - 0,1 
5 0,14 0,16 - - 0,1 
6 0,10 0,20 - - 0,1 
7 0,14 - 0,16 - 0,1 
8 0,10 - 0,20 - 0,1 
9 0,20 - 0,10 0,1 
10 0,17 - 0,13 0,1 
11 0,15 - 0,15 0,1 
 
 
Prática 10 – Cinética da enzima -
glicosidase. Inibição por maltose. 
Caracterização da enzima por parâmetros 
cinéticos. 
 
Orientações: 
a) PRÉ-RELATÓRIO: 
1) Esquematização de construção dos gráficos cinéticos; 
b) RELATÓRIO: Construir o gráfico de Lineweaver-Burk na presença do 
inibidor maltose e determine VMAX e Km. 
 
Objetivos – Determinar parâmetros cinéticos de inibição de -glicosidase por 
maltose. Caracterizar -glicosidase por padrões cinéticos de inibição por 
maltose. 
 
Reagentes Materiais Instrumentos 
• Água destilada • Banho de gelo • Vórtice 
• Lisado de levedura (F1) 
• Maltose 0,4 M, 1,2 M, e 
1,6 M em tampão fosfato 
100 mM pH 7,0. 
• p-nitrofenil--glicosídeo 
(NPGlc) 1,0 mM, 2,0 
mM, e 8,0 mM em 
tampão fosfato 100 mM 
pH 7,0. 
• Tampão 
carbonato/bicarbonato 
250 mM, pH 11,0 
• Tampão fosfato 100 mM 
pH 7,0 
• Cubetas para leitura 
• Pipetadores, 
Pipetas, Ponteiras 
• Tubos de ensaio e 
suportes 
• Espectrofotômetro 
• Banho a 300C 
 
Procedimento. 
 
Parte 1 – Preparação das amostras dos lisados de Saccharomyces cerevisiae. 
1. Utilize o mesmo procedimento de diluição utilizado na prática 7. 
 
Parte 2 – Cinética da reação de hidrólise do substrato na presença do inibidor 
maltose. 
 
1 - Primeiramente, identifique os vários tubos seguindo a tabela 1. 
2 - Novamente baseado na tabela 1, prepare as amostras em tubos de ensaio. 
 
Importante: 1) homogeneíze os lisados diluídos manualmente e com 
cuidado antes de aliquotá-lo. 2) sempre adicione o volume de lisado 
por último. 
 
3 - homogeneíze a solução manualmente e com cuidado, e transfira o tubo 
imediatamente para o banho a 30 0C. O tubo deve permanecer no banho 
pelo menos o dobro do período de tempo usado na prática 7. (Se 
possível, testar periodicamente para monitorar o andamento da reação). 
4 – remova o tubo do banho e adicione 2 mL do tampão carbonato-bicarbonato 
pH 11,0 imediatamente. Este procedimento deve interromper a atividade de -
glicosidase. 
5 – Transferira o conteúdo do tubo para uma cubeta e faça a leitura 
espectrofotométrica em 420 nm. 
 
 
Tubo 
Tampão fosfato 
100mM pH 7,0 
(mL) 
NPGlc (mL) Maltose (mL) 
Lisado 
(mL) 
A 
(420nm) 
1,0 
mM 
2,0 
mM 
8,0 
mM 
0,4 M 1,2 M 1,6 M 
1 0,12 0,08 - - 0,1 0,1 
2 - 0,2 - - 0,1 0,1 
3 0,04 - 0,16 - 0,1 0,1 
4 - - 0,20 - 0,1 0,1 
5 0,10 - - 0,10 0,1 0,1 
6 0,05 - - 0,15 0,1 0,1 
 
7 0,12 0,08 - - 0,1 0,1 
8 - 0,2 - - 0,1 0,1 
9 0,04 - 0,16 - 0,1 0,1 
10 - - 0,20 - 0,1 0,1 
11 0,10 - - 0,10 0,1 0,1 
12 0,05 - - 0,15 0,1 0,1 
 
13 0,12 0,08 - - 0,1 0,1 
14 - 0,2 - - 0,1 0,1 
15 0,04 - 0,16 - 0,1 0,1 
16 - - 0,20 - 0,1 0,1 
17 0,10 - - 0,10 0,1 0,1 
18 0,05 - - 0,15 0,1 0,1