Sequenciamento do DNA

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BIOMEDICINA
SEQUENCIAMENTO DE DNA
Profº.: Níbia
Adriana Maria
Camila Camini Souza 
Esther Luana Rodrigues Latalisa
Maria Imaculada Elias de Jesus
Mariana Martins Marcilio
Vaneska Karoline
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DNA
1953 – Modelo de Watson e Crick - O DNA é uma hélice dupla em que as bases nitrogenadas interagem por pontes de hidrogênio.
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DNA
1958 – A replicação do DNA é semiconservativa
Fonte: https://djalmasantos.wordpress.com/2010/10/31/duplicacao-do-dna/
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SEQUENCIAMENTO DE DNA, O QUE É?
Em biologia molecular, sequenciamento é o processo de determinação da ordem sequencial das partes constituintes de nucleotídeos de uma molécula de DNA ou RNA, ou de aminoácidos de uma proteína.
Processo de determinação da ordem dos nucleotídeos de um dado fragmento de DNA
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Fonte: http://www.nonprofitlawblog.com/staring-a-nonprofit-what-is-scientific-under-501c3/
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Métodos de sequenciamento de
DNA
Métodos Clássicos e Gilbert - método de degradação química Tratamento com substâncias químicas que cortam a molécula de DNA em nucleotídeos específicos
 
Fonte:https://www.educabras.com/enem/materia/biologia/genetica/aulas/a_biotecnologia_e_a_genetica
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Métodos de sequenciamento de
DNA
Sanger et al. - método enzimático, dideoxi ou de término da cadeia Síntese enzimática de uma fita complementar, cujo crescimento é interrompido pela adição de um dideoxinucleotídeo.
Fonte: https://pt.slideshare.net/zenonzord/projetos-de-sequenciamento-gnomico
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Métodos de sequenciamento de
DNA
Métodos de degradação Química
substâncias químicas, caracterização de oligonucleotídeos ou no sequenciamento de estruturas ricas em GC
fontehttps://pt.slideshare.net/felipes/sequenciamento-de-dna
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Modelos de sequenciamento de
DNA
Métodos de sequenciamento manual
Mais utilizado, sequenciamento de genomas, automação
Fonte:http://www.ebah.com.br/content/ABAAABJQgAI/biologia-molecular
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Métodos de sequenciamento de
DNA
Outros métodos de sequenciamento
Pirosequenciamento 
Sequenciamento por hibridação
Colônias da polimerase 
Sequenciamento por nanoporos 
Espectrometria de massa
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Principais técnicas de sequenciamento
Método químico de degradação de bases desenvolvido por Allan Maxam e Walter Gilbert em 1977 
Método didesoxi ou terminação da cadeia de Fred Sanger e colaboradores em 1978
 
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Principais técnicas de sequenciamento
Ambos os métodos são baseados na produção de um conjunto de fitas simples de DNA que são separadas pelo princípio de eletroforese (Okubo et al., 1992).
Se comparado ao sequenciamento de Maxam e Gilbert, o método de terminação da cadeia de Sanger gera dados que são mais facilmente interpretados
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Método de Sanger
O sequenciamento pelo método de terminadores de cadeia (método de Sanger) envolve a síntese de DNA a partir de primers, pequenos moldes de DNA (oligonucleotídeos) complementares a uma região específica de DNA. 
A partir desta região, uma nova fita de DNA é produzida, pela ação de uma enzima capaz de replicar DNA: a DNA polimerase
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Fonte: http://www.ebah.com.br/content/ABAAABbkEAI/revista-biotecnologia-ed-31?part=12
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Método de Sanger
Esta técnica tem como princípio a terminação sequência-específica da reação de síntese de DNA utilizando nucleotídeos modificados, análogos aos dNTPs normais.
Alto Custo.
Muito trabalhoso
Fonte: http://www.ebah.com.br/content/ABAAAAjOYAI/sequenciamento-metodo-sanger
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Método de Sanger
Usos e limitações
O método Sanger de sequenciamento promove sequências de alta qualidade para trechos relativamente longos (por volta de 900900900 pares de base). 
É tipicamente usado para sequenciar peças individuais de DNA, como plasmídeos bacterianos ou DNA copiado em PCR
o método Sanger de sequenciamento é caro e ineficiente para projetos de larga escala, como o sequenciamento de um genoma inteiro ou metagenoma. 
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Sequenciadores automáticos
Criado em 1986 pela Applied Biosystems.
O princípio é o mesmo do sequenciamento manual feito por Sanger.
ddNTPs são marcados por fluorescência característica, permitindo a distinção das cadeias truncada pela respectiva fluorescência. É feita a eletro injeção onde as moléculas de DNA(-) em suspensão são introduzidas nos capilares
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Sequenciadores automáticos
Cada fragmento, recebe um feixe de laser de argônio, que será detectado por um sistema óptico e uma câmara de CCD.
A ordem em que os diferentes fragmentos passam pelo detector de fluorescência indica a sequência da cadeia de DNA complementar à cadeia usada como molde. 
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Fonte: http://slideplayer.com.br/slide/4112096/
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Sequenciadores automáticos
Sequenciadores automáticos – avanço para a genômica, poucas centenas de pb.
Sequenciadores de capilares - duas vezes mais rápidos, completamente automatizados
Associação de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecção através de fluorescência confocal excitada por laser 
Eliminação da montagem da placa e preparação do gel 
Aplicação das amostras por eletro injeção
Alta velocidade e resolução na separação das amostras
Eliminação do retraqueamento 
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Armazenamento do DNA
O ideal é o congelamento em nitrogênio líquido ou a colocação do tecido em uma solução de preservação de ácidos nucleicos.
A amostra de tecido pode também, ser colocada em banho de gelo e transportada com gelo para melhor preservação dos ácidos nucleicos, especialmente do RNA.
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Armazenamento do DNA
Amostras muito pequenas podem ser embrulhadas em gaze embebida com salina, a fim de evitar que a amostra resseque. 
Mesmo assim, as amostras devem ser colocadas em solução de preservação de ácidos nucleicos o mais rapidamente possível para evitar degradação dos mesmos. (MELO, et, al. 2010)
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Armazenamento do DNA purificado
Após o isolamento do DNA das amostras, recomenda-se que seja armazenado abaixo de 0ºC, para que a atividade de degradação das DNAses seja reduzida.
 deve ser armazenado em tubo de plástico, hidrofóbico e com tampa de vedação eficaz, preferencialmente com uma vedação de borracha para prevenir a evaporação.
O DNA purificado pode ser armazenado em tampão tris-EDTA (TE), pH 7,2, por 26 semanas a temperatura ambiente, por um ano a 2-8ºC (na ausência de DNAses), por até sete anos em freezer a -20ºC e por mais do que isso a -70ºC. (MELO, et, al. 2010)
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Formas de transportar o DNA
Para extração de DNA, o tecido deve ser resfriado imediatamente e transportado ao laboratório em banho de gelo triturado, onde deve ser acondicionado a 2-8ºC e processado em até 24 horas
Amostras que serão analisadas por técnicas moleculares in situ, como hibridização fluorescente in situ (FISH), devem ser colocadas em meio optimal cutting temperature (OCT) e congeladas até seu processamento. 
Em geral, o DNA é estável em tecidos por até 24 horas a 2-8ºC, por, pelo menos, duas semanas a -20ºC e por, pelo menos, dois anos a -70ºC ou inferior. (MELO, et, al. 2010)
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Cuidados Essenciais com o DNA
O laboratório deve ser notificado com antecedência sobre o envio dessas amostras e se preparar para recebê-la e processá-la rapidamente
Para extração de RNA, a amostra deve ser congelada rapidamente em nitrogênio líquido antes de ser congelada a -70ºC (ou inferior), colocada em solução estabilizadora de RNA ou processada para extração de RNA em, no máximo, uma hora da coleta
No caso de contaminação da punção com sangue, é aconselhável que os eritrócitos sejam removidos antes da adição da solução estabilizadora de RNA. Eritrócitos também devem ser removidos caso a amostra resfriada não possa ser processada em até quatro horas e precisar ser congelada (a -70ºC ou inferior)*
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Referência Bibliográfica
MELO, Murilo Rezende; MARTINS, Alvaro Rodrigues; BARBOSA, Ismar Venancio; ROMANO, Patricia; SHCOLNIK, Wilson. Coleta, transporte e armazenamento de amostras para diagnóstico molecular. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial [en linea] 2010, 46 (Octubre-Sin mes) : [Fecha de consulta: 28 de octubre de 2017] Disponible en:<http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=393541956006> ISSN 1676-2444