Replicação do DNA e Mecanismos de Correção

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Semana 6- BMC- Replicação 
Durante a replicação do DNA na célula, cada uma das duas fitas originais atua como um molde para a formação de uma fita inteiramente nova. Como cada uma das duas células-filhas resultantes da divisão celular herda uma nova dupla hélice de DNA formada por uma fita original e uma fita nova, diz-se que replicação é semiconservativa.
Forquilha de replicação: processo que se forma para que ocorra ativamente a replicação. Nessa, um complexo multienzimático que contém DNA-polimerase sintetiza o DNA das duas fitas novas.
As DNA polimerases sintetizam nas forquilhas de replicação na direção 5’-3’.
Fragmentos de Okazaki: segmentos transitórios, os quais só são polimeralizados na cadeia na direção 5’-3’ e são unidos após sua síntese, formando longas cadeias de DNA.
A forquilha, dessa maneira, possui uma estrutura assimétrica. A fita filha de DNA sintetizada continuamente (fita líder) e uma fita retardada ou descontinua (a direção de polimerização dos nucleotídeos é oposta à direção do crescimento da cadeia de DNA).
Mecanismos de reparo: a alta fidelidade da replicação do DNA depende dessa, forma, não apenas do pareamento entre as bases complementares, mas também de vários mecanismos de correção que atuam de forma sequencial para corrigir qualquer pareamento incorreto.
DNA polimerase: essa realiza a primeira etapa de correção e ocorre imediatamente antes da adição covalente de um novo nucleotídeo à cadeia crescente. O nucleotídeo correto tem uma maior afinidade pela polimerase em movimento em comparação ao incorreto, isso porque o pareamento correto é energicamente mais favorável. As DNA polimerases são altamente especificas para os tipos cadeias de DNA: elas necessitam de um pareamento de bases previamente formado, com extremidade 3’-OH, de uma fita iniciadora. Essas moléculas de DNA com um malpareamento de nucleotídeos na extremidade 3’-OH da fita iniciadora não servem como molde eficiente porque a polimerase tem dificuldades em alongar a fita. Elas corrigem essas fitas iniciadoras com pareamentos incorretos por um sitio catalítico separado. Essa exonuclease de correção de erro 3’-5’ remove qualquer nucleotídeo não pareado ou mal pareado na extremidade do iniciador, continuando até que um numero suficiente de nucleotídeos tenha sido removida, dai regenar uma extremidade terminal 3’-OH corretamente pareada capaz de iniciar a síntese de DNA.
Correção exonucleolítica: ocorre imediatamente após os raros casos em que um nucleotídeo incorreto é covalentemente adicionado à cadeia crescente. 
OBS: As propriedades de autocorreção da DNA polimerase dependem da sua exigência em ter um iniciador perfeitamente pareado na extremidade, porque esse tipo de enzima não inicia a síntese de novo, sem um iniciador pré-existente. Porém, as enzimas RNA-polimerases envolvidas na transcrição gênica não necessitam de uma atividade de correção exonucleotidica eficiente- os erros de RNA não são passados para a próxima geração, e as moléculas de RNA com defeitos ocasionais não tem maior relevância e assim as RNA polimerases são capazes de iniciar novas cadeias sem um iniciador.
Enzima de polimerização de nucleotídeos sintetiza pequenas moléculas de iniciadores de RNA: na fita líder, apenas um iniciador é necessário para o inicio da replicação, uma vez que a forquilha de replicação esteja estabelecida, a DNA polimerase é continuamente apresentada à extremidade da cadeia com o pareamento ao qual irá adicionar novos nucleotídeos. No lado descontínuo da forquilha, por outro lado, cada vez que a DNA polimerase completa um fragmento de Okazaki, ele deve novamente iniciar a síntese de um fragmento completamente novo em um sitio mais adianta na fita molde. Esse mecanismo depende de uma enzima chamada DNA-primase, que utiliza ribonucleosideos trifosfato para sintetizar pequenos iniciadores de RNA na fita retardada. Assim como na DNA polimerase, o nucleotídeo pareado corretamente com um grupo 3’-OH em uma extremidade, iniciando o fragmento de okazaki. A seguir, a enzima DNA-ligase liga a extremidade 3’ do novo fragmento de DNA à extremidade 5’ do anterior.
Abertura da dupla hélice: para que a síntese de DNA ocorra, a dupla hélice de DNA deve ser aberta (desnaturada) à frente da forquilha de replicação. Por ter uma estrutura bastante estável, há necessidade de duas proteínas de replicação adicionais- as DNA helicases e as proteínas ligadoras de DNA de fita simples.
As DNA helicases quando encontram uma região de dupla hélice, continuam o deslocamento sobre essa fita, interferindo e separando a hélice. Pode se deslocar no sentido 5’-3’, como no 3’-5’. Age desfosforilando o ATP.
Proteinas ligadoras de fita simples de DNA (SSB): também denominadas proteínas desestabilizadoras de hélices, ligam-se fortemente e de maneira cooperativa para expor as fitas simples de DNA sem encobrir suas bases, que permanecem disponíveis como moldes. Essas proteínas são incapazes de abrir diretamente a longa hélice de DNA, mas auxiliam as helicases, estabilizando a conformação distorcida e de fita simples.
Proteína acessória: ocorre uma rápida dissociação da DNA polimerase, assim isso dificultaria a síntese, pela DNA polimerase, de longas fitas produzidas na forquilha de replicação. Dessa maneira, há uma proteína acessória (PCNA) que atua como uma cinta deslizante. Essa cinta mantém a polimerase firmemente associada ao DNA enquanto está em movimento, mas libera tão logo a polimerase encontre uma região de DNA de fita dupla.
Maquinaria de replicação: é composta por subunidades. Na frente da forquilha de replicação, a DNA helicase abre a dupla hélice de DNA. 2 moleculas de DNA polimerase trabalham na forquilha, uma na fita líder e outra na retardada. Enquanto a molécula de DNA polimerase na fita líder pode operar de modo continuo, a DNA polimerase na fita retardada deve reiniciar em intervalos curtos, utilizando pequenos iniciadores de RNA produzidos pela DNA-primase. 
Sistema de reparo de pareamento incorreto: Nas bactérias: detecta o potencial de distorção na hélice de DNA que resulta da interação incorreta entre as bases não complementares. Esse sistema de reparo é marcada através de grupos metil que são adicionais a todos os resíduos A na sequencia GATC. Como resultado, as únicas sequencias GATC que não foram ainda metilada são as fitas recém sintetizadas atrás da forquilha de replicação. Assim, o reconhecimento permite que as fitas novas sejam temporariamente diferenciadas das sequencias originais, possibilitando a remoção seletiva do erro. O processo, de três etapas, envolve- o reconhecimento de uma fita recém sintetizada, remoção da porção que contem o mal pareamento e a ressintese do segmento removido, usando a fita original como molde.
Nos eucariotos: a fita retardada de DNA recém sintetizada contem quebras temporárias (antes de serem unidas pela DNA ligase) e essas quebras fornecem o sinal que direciona o sistema de correção de mal pareamento à fita correta.
DNA topoisomerases: o deslocamento da forquilha de replicação ao longo da fita de DNA cria o chamado problema de enrolamento. As duas fitas parentais, que estão enroladas uma sobre a outra, devem ser desenroladas e separadas para ocorrer a replicação. O DNA acaba sendo supertorcido e assim, as DNA topoisomerases aliviam essa torção. Ela se liga a um fosfato da cadeia principal do DNA, clivando uma ligação fosfodiester na fita de DNA. Essa reação é reversível e a ligação é regenerada quando a proteína é liberada. 
Topoisomerase I: produz uma clivagem temporária na fita simples. Essa quebra na cadeia permite que as duas porções da hélice de DNA, formada dos dois lados da quebra, girem livremente uma em relação à outra, usando a ligação fosfodiester na fita oposta à quebra como ponto de suporte para a rotação.
Topoisomerase II: forma uma ligação covalente com ambas as fitas da hélice de DNA ao mesmo tempo, formando uma quebra de fita dupla temporária na hélice. Uma vez que a topoisomerase II se liga a um dos sítios de cruzamento, a proteína utiliza a hidrolisedo ATP para executar, um conjunto de reações- clivagem reversível de uma dupla hélice, criando uma abertura no DNA; passagem da segunda dupla hélice, que está próxima, pela abertura; religação da quebra e dissociação do DNA.
Replicação dos eucariotos: Aumento nos níveis de Cdk6 Célula é estimulada a sair de G1 Cdk6 se liga ao ORC Atração de Mcm (enzimas capazes de clivar AT, começando a fase S) Cdk6 é fosforilado e degradado ORC é fosforilado dando continuidade a replicação (não atrai novas Mcm’s para replicar novamente, ela apenas dá continuidade à replicação pré-existente. Se a ORC não estivesse fosforilada, formaria novas bolhas atraindo Mcm’s que replicaria novamente, gerando replicações dentro de uma replicação) Chegada da helicase para abrir a fita (continua rompendo as pontes de hidrogênio) juntamente com seu inibidor, o inibidor se dissocia permitindo a continuidade da replicação por meio da dissociação das fitas Primase coloca o primer e atrai RFC e PCNA DNA polimerase alfa estica o primer com desoxirribonucleotídeos RFC liga-se ao DNA na junção entre o primer e a fita molde PCNA liga-se adjacentemente a RFC DNA polimerase liga-se a PCNA DNA polimerase δ começa a sintetizar. As DNAs polimerases alfa e delta estão associadas, os fragmentos de okasaki também realizam um looping de 180 graus, mas esse giro será ao redor da DNA polimerase, e as fitas terão o mesmo sentido durante a replicação.
	Polimerase em Eucarioto
	Função
	Equivalente em Procarioto
	Α
	Inserção do primer (associada a primase)
	--
	Β
	Reparo do DNA
	Polimerase I
	S (completa o frag de okazaki)
	Replicação do DNA nuclear (assoc. a RFC e PCNA)
	Polimerase III
	ԑ (alonga a fita líder)
	Mecanismo de Reparo
	Polimerase II
	Gama
	Replicação de DNA mitocondrial
	--