HIDROLISE DO AMIDO

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CURSO TECNICO EM BIOTECNOLOGIA
DISCIPLINA DE PROCESSOS BIOQUÍMICOS
PROF.ª BIANCA PFAFFENSELLER
Prática VIII:
ATIVIDADE ENZIMÁTICA
(HIDRÓLISE DO AMIDO)
ALUNAS: JESSIKA LARA, PAULA SOARES E THAYANA DA SILVA
NOTA = 8,2
Porto Alegre, 14 de maio de 2014
Introdução
: A reação enzimática simples pode ser representada pela seguinte sequência de reações químicas:
E + S ES EP E + P
E – enzima
S – substrato
P – produto
ES – complexo enzima-substrato
EP – complexo enzima-produto
Para começarmos a entender o funcionamento das reações, é importante dizer que as enzimas são cataliszadores biológicos, ou seja, aumentam a velocidade das reações sem alterar o equilíbrio da mesma. Para se compreender a cinética da reação é preciso conhecer a diferença na energia livre (estado final) e os reagentes (estado inicial) como a quantidade necessária para transformar o reagente em produto (energia de ativação).
	Comment by bpfaffenseller: Sempre que utiliza-se uma figura, é recomendado colocar uma legenda pra ela e explicar nessa legenda os eixos.
Este diagrama descreve as mudanças de energia ocorridas durante uma reação química, onde o eixo das abscissas mostra o progresso de uma dada reação enzimática, o que significa dizer as mudanças químicas que ocorrem para a transformação do substrato em produto. Já o eixo das ordenadas, mostra a energia livre dessa reação. O ponto de início e de término de uma reação é chamado de estado fundamental, no ponto máximo da curva, está o estado de transição que é relacionado com a quantidade de energia necessária para que o substrato seja transformado em produto. A diferença entre os níveis desses dois estados é chamada de energia de ativação. Assim, podemos dizer que cataliszadores reduzem s barreira energética entre o substrato e o produto em um dado sistema, diminuindo a energia de ativação da reação. Existe vários fatores que podem alterar a velocidade da reação enzimática, tais como:
- pH;
- Temperatura;
- Concentração de substrato;
- Concentração da enzima.
O pH interfere na velocidade da reação, uma vez que altera a distribuição de cargas elétricas da enzima influenciando a conformação do sítio ativo, consequentemente a interação com o substrato, assim diminuindo a velocidade de dada reação.	Comment by bpfaffenseller: Qdo isso acontece? Para qquer pH?
Quando se aumenta a temperatura do meio, a velocidade da reação aumenta. dentro de uma faixa que a mantem estável e em atividade integral. A maioria das enzimas humanas tem sua temperatura ótima entre 35° e 40°, faixa normal de temperatura corporal. . Pois a agitação entre as moléculas e os números de colisões entre elas aumentam., e as chances de reação entre elas é maior. Porém se for ultrapassada certa temperatura, as colisões se tornam tão intensas que as ligações que estabilizam a estrutura espacial da enzima se rompe e ela se desnatura. 
Já a concentração de substratos à medida que aumenta, mais rápida será a reação d. Desde que haja enzimas disponíveis para o substrato. Quando não há disponibilidade de enzimas que formem o ES, dizemos que há saturação da enzima, e a velocidade da reação se mantem constante. Assim, podemos afirmar que com o aumento da concentração da enzima, aumenta a velocidade da reação, desde que haja substrato disponível.
A saliva possui uma enzima chamada amilase salivar, que quebra as moléculas de amido em glicose. A amilase salivar é uma enzima que atua provocando a hidrólise do amido, um polissacarídeo muito abundante na alimentação, estando presente, sobretudo, em alimentos de origem vegetal, nos quais constitui a principal substância de armazenamento. A digestão dos alimentos é iniciada na boca, onde se verifica, essencialmente, a mastigação, havendo a quebra das grandes partículas alimentares em outras de menores dimensões que vão em seguida ser deglutidas. Amido é o principal produto de reserva nutritiva vegetal, é geralmente encontrado em órgão de reserva nutritiva, como raízes do tipo tuberoso (mandioca, batata doce), caules do tipo tubérculo (batatinha), frutos e sementes. , Constitui um polímero de glicose com ligação glicosídica. 
O soluto de lugol é um indicador para testar a presença de amido. O corante irá colorir o amido à medida que interage com a estrutura enrolada (forma helicoidal) do polissacarídeo, produzindo uma cor azul escura. Não reage com monossacarídeo (glicose), nem com dissacarídeo (sacarose). No experimento a seguir, observaremos a interação entre a enzima e substrato, assim como sua velocidade de reação.	Comment by bpfaffenseller: O que há deste reagente? Falar do iodo.
Objetivo: observar uma reação enzimática. Verificar a influência da concentração do substrato e da temperatura na atividade de uma enzima.
Materiais:
- 1 estante para tubos de ensaio
- 6 tubos de ensaio de vidro grandes
- 4 mL de saliva (de um colega)
- 1 béquer de 10 mL para saliva
- 11 mL de solução de amido 0,7%
- 24 gotas de Lugol (aproximadamente 2,4 mL)
- Banho-maria + termômetro.
Procedimento:
- A α-amilase será obtida através da saliva que deverá ser previamente preparada em um béquer (4 mL de saliva + 1 mL de água).
1) Preparar e marcar 10 tubos de ensaio. Tubos de 1 a 5 em duplicata.
2) Pipetar segundo a tabela abaixo.
A enzima (0,2 mL ou 200 µL de saliva) deve ser adicionada por último (no fundo do tubo) e logo após, cada tubo deverá ser bem agitado.
	TUBO
	1
	2
	3
	4
	5
	Amido 0,7% (mL)
	0
	0,5
	1
	2
	3
	Água (mL)
	3,8
	3,3
	2,8
	1,8
	0,8
	Solução com enzima (mL)
	0,2
	0,2
	0,2
	0,2
	0,2
3) Em um conjunto de tubos (de 1 – 5), coloque 3 gotas de lugol em cada tubo, agite e anote os resultados na tabela na parte de “Temperatura ambiente (T.A)”.
4) Colocar o outro conjunto de tubos (de 1 – 5) em banho-maria por 10 minutos a 37°C. Esperar o conteúdo dos tubos esfriar um pouco. Após, coloque 3 gotas de lugol em cada tubos e agitar. Anote a cor formada em cada tubo na tabela.
Resultados:
OBS: O amido produz coloração azul quando em contato com o iodo, já a dextrina superior (polissacarídeo) produz coloração violeta, enquanto a maltose não produz nenhuma cor em contato com o iodo. Dextrinas são compostos polissacarídeos formados como produtos intermediários na quebra do amido. Por exemplo, esses produtos incluem uma forma inicial chamada eritrodextrina porque se tornam vermelhos com o iodo.
	TUBO
	1
	2
	3
	4
	5
	Amido 0,7% (mL)
	0
	0,5
	1
	2
	3
	Água (mL)
	3,8
	3,3
	2,8
	1,8
	0,8
	Solução com enzima (mL)
	0,2
	0,2
	0,2
	0,2
	0,2
	Coloração formada (T.A)
	 
	 
	 
	 
	 
	Coloração formada (37°)	Comment by bpfaffenseller: Faltou um título para a tabela.Outra forma de expressar os resultados seria por fotos dos tubos, já q o ensaio é qualitativo e visual.
	 
	 
	 
	 
	 
Discussão: 
No tubo 1, é observado coloração amarela, pois não havia substrato para a enzima reagir, pode se dizer que a coloração é apenas do corante na solução. No tubo 2 já foi possível visualizar uma diferença na coloração pois havia uma quantia de substrato suficiente, uma coloração com um amarelo mais escuro principalmente no tubo que foi aquecido a 37 °C, já que neste tubo foi adaptado para que se dê a temperatura ótima da enzima, consequentemente a velocidade desta reação comparada com a de temperatura ambiente foi mais rápida. No tubo 3 houve um aumento de substrato, o que na temperatura ambiente pode se observar a interação da enzima-substrato pela coloração mais escura. Comparando o tubo 2 e 3, é possível concluir que a medida que se aumenta o substrato, a velocidade da reação também aumenta, e ainda fazendo uma segunda comparação é claramente observado que na temperatura ótima a 37°, a velocidade da reação é mais rápida do que no tubo a temperatura ambiente. No tubo 4 e 5, é observado uma coloração mais escura, pois a medida que se aumenta o substrato, a interação com a enzima aumenta. Nestes tubos também é aplicado que no tuboa temperatura ambiente a reação foi mais lenta, enquanto que no tubo aquecido a 37° foi mais rápido. 	Comment by bpfaffenseller: Rever. O que acontece quando for maior a coloração escura? Ficou confusa a discussão.Faltou discutir os possíveis produtos formados pela ação da enzima, de acordo com a cor formada em cada tubo (se houve hidrólise do amido ou não). Em algum tubo, foi possível a identificação destes açucares intermediários como dextrina,? E maltose?	Comment by bpfaffenseller: E como foram os resultados nos demais grupos?Discutir tb as possíveis aplicações desta técnica no campo da biotecnologia, em laboratórios, clínicas.
Bibliografia:	Comment by bpfaffenseller: Rever formatação das referências!
- Relatório de aula prática “Atividade Enzimática (Hidrólise do Amido)” do dia 29/04/2014.
- http://pt.scribd.com/doc/19194724/Relatorio-Factores-Que-Influenciam-a-Actividade-Enzimatica Acesso em 12/05/2014.
- http://www.sobiologia.com.br/conteudos/quimica_vida/quimica12.php Acesso em 12/05/2014.
- Lehninger, A; L. Bioquímica. 2°. ed. São Paulo: Editora Edgard Blucher, 1976.