R41 Cromatografia em papel AMINOÁCIDOS

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Universidade Federal do Espírito Santo
Curso de Graduação em Farmácia
Bioquímica
Cromatografia em papel
Amostra: Mistura de aminoácidos
Nome: Caroline Capini, Creuza Souza, Paula Caroline dos Santos.
Vitória
2018
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO..................................................................................................... 3
2. OBJETIVO............................................................................................................ 4
3. MATERIAIS E REAGENTES................................................................................ 4
4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL.................................................................... 4
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................. 5
6. CONCLUSÃO........................................................................................................ 7
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................... 7
INTRODUÇÃO 
 O termo cromatografia é de origem grega ( do grego: “chroma” , cor e “grafein”, grafia). A cromatografia é, talvez, a tecnica mais importante usada pelos quimicos para separar os componentes de uma mistura. A tecnica envolve a distribuição de compostos ou ions diferentes da mistura entre duas fases, um estacionária, e outra, móvel, com base em suas diferentes afinidades para serem retidos por um material estacionário. O processo de separação depende das diferenças de adsorção dos componentes da mistura na fase estacinaria e de quão soluvel eles são na fase móvel. Essas diferenças dependem principalmente das polaridades relativas dos componentes da mistura. (Donald L. Pavia, 2009).
 Essa tecnica cromatográfica simples, tem a fase móvel liquida e a fase estacionária constituída sobre um suporte celulósico, o papel cromatográfico. Os componentes da mistura liquida a separar são colocados, em pequenas porções, sobre o papel de cromatografia, a pequena distância de um dos lados. A ponta deste lado é então mergulhada num solvente liquido, que constitui a fase móvel. Esse solvente vai se deslocando de uma extremidade à outra do papel, arrastando os diferentes componentes da mistura a separar com velocidades distinta.
 Devido a simplicidade, versálidade e a grande utilidade da técnica, esta é muito aplicada em diversos campos da ciência, utilizada em laboratórios e em pesquisas. Na área da bioquímica, a cromatografia é usada como método de análise e purificação de proteínas.
 Um parâmetro freqüentemente usado em cromatografia é o "índice de retenção" de um composto (Rf). Na cromatografia de camada fina, o Rf é função do tipo de suporte (fase fixa) empregado e do eluente. Ele é definido como a razão entre a distância percorrida pela mancha do componente e a distância percorrida pelo eluente.
 Portanto: 
Rf = distância percorrida pela substancia ÷ distancia percorrida pelo solvente
 Quando as condições de medida forem completamente especificadas, o valor de Rf é constante para qualquer composto dado e correspondente a uma propriedade física. Este valor deve apenas ser tomado como guia, já que existem vários compostos com o mesmo Rf. 
OBJETIVO:
Separação e qualificação de duas amostras desconhecidas de aminoácidos.
MATERIAIS E REAGENTES
Funil de separação de 100 mL
n-butanol
ácido acético
água destilada
Béquer
Papel de filtro (Whatman n°01)
Micropipeta
Cuba
Placa de Petri
Ninidrina a 0,2% em acetona
Estufa
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 
Preparou-se o sistema solvente em um funil de separação de 100 mL, misturando 40 mL de n-Butanol, 10 mL de ácido acético e 50 mL de água destilada. Após reação e decantação no funil de separação recolheu-se a fase aquosa com o auxílio de um béquer a fim de usá-la na saturação da câmara cromatográfica durante cerca de 1 hora.
 Marcou-se sobre o papel de filtro (Whatman n° 01) 5 pontos de aplicação de amostras a 2,5 cm de uma das extremidades da fita de pepel: amostra 1 (A1), amostra 2 (A2), padrão 1 contendo glicina (P1), padrão 2 contendo fenilanina (P2) e mistura de vários aminoácidos (M). A seguir com o auxílio de uma micropipeta foram feitas as aplicações.
 Após a saturação colocou-se dentro de uma placa de Petri localizada dentro da cuba contendo cromatofolha a fase orgânica do sistema solvente ficando aproximadamente 1 cm abaixo do ponto de aplicação. Para facilitar a saturação da cuba colocou-se uma folha de papel filtro embebida na fase aquosa revestindo seu interior.
 Dessa forma a cromatografia foi desenvolvida a temperatura ambiente, marcando ao final da cromatografia a frente do sistema solvente. Secou-se a cromatofolha em estufa e revelando-a com solução de ninidrina a 0,2% em acetona.
 As manchas reveladas foram marcadas e as distâncias em cm percorridas pelos aminoácidos foram medidas, considerando o centro destas manchas. Por fim, calcularam-se os valores de Rf analisando quais aminoácidos continham nas amostras A1 e A2, segundo os padrões P1, P2 e a mistura M.
Resultados e Discussão
 A cromatografia permitiu a separação dos aminoácidos através da sua interação com o solvente da fase móvel e pela hidrofilicidade do papel. 
 O solvente da fase móvel apresentava característica apolar e era um éster, o acetato de butila.
 Após a aplicação das amostras e do marcador o papel entrou em contato com a fase móvel, que era apolar e o solvente sobe pelo papel por capilaridade. Logo os aminoácidos que eram apolares foram carregados mais facilmente junto com o solvente, conseguindo percorrer mais o papel, já os aminoácidos que possuem característica polar, não consegue interagir tão facilmente ao solvente apolar da fase móvel, logo eles ficam mais próximos do ponto de aplicação. 
 Ao final da corrida cromatográfica e da revelação com o corante ninidrina, que interage com o α-amino livre do aminoácido e o pigmenta em azul escuro ou roxo. Portanto a prolina não apresenta coloração na cromatografia, já que o α-amino não está livre. 
 Como pode ser observado na figura abaixo :
 
P1: Glicina 
P2: Fenilalanina
A1 : amostra 1 
A2 : amostra 2 
M: marcador 
Medidas da Cromatografia em Papel 
Distância percorrida pelo solvente = 7,0 cm.
Distância percorrida pelo padrão P1 = 4,5 cm
Distância percorrida pelo padrão P2 = 1,5 cm
Distância percorrida pelo amostra A1 = 1,3 cm
Distância percorrida pela amostra A2 = 4,3 cm
Banda superior = 7,0 cm
Banda inferior = 2,0
Cálculo do RF
RF = distância (cm) percorrida pelas amostras
 distância (cm) percorrida pelo solvente
RFP1 = 0,64
RFP2 = 0,21
RFA1= 0,18
RFA2 = 0,61
RFA2(superior) = 0,58
RFA2(inferior) = 0,12
 Pelos valores de Rf calculados pode-se identificar que a amostra A1 é de glicina, pois possui o RF próximo ao padrão P1. 
 Já a banda superior possui o mesmo valor de RF que o padrão P2, logo na amostra temos fenilalanina. 
 A Faixa amarelada da cromatografia em aproximadamente 2,5 cm de corida no ponto M (marcador) é o iminoácido prolina que emite essa cor amarelada, devido as propriedades de sua cadeia lateral.
 O índice hidropático dos aminoácidos reflete a tendência que as suas cadeias laterais têm para interagir com o meio aquoso. Um índice de hidropaticidade elevado (+) indica uma região hidrofóbica (apolar) do polipeptídeo. Índice baixo (-) indica o contrário, ou seja, região hidrofílica (polar).
Índice Hidropático da Glicina = -0,4
Índice hidropático da Fenilalanina = 2,8 
 Analisando a banda inferior da amostra A2, sabe-se que o RF é menor que o da glicina. Logo, interpreta-se que a amostra é mais polar que a glicina. Como a diferença de Rf é pequena, propõe-se que o índice hidropático do aminoácido desconhecido, não é muito distante do indice da hidropaticidade da glicina. Como apresentado na literatura, a glicina possuiíndice hidropático -0,4. Analisando a tabela dos valores hidropáticos do aminoácido, e sabendo que o aminoácido desconhecido é mais polar que a glicina e apresenta um índice hidropático menor que o da glicina, pode-se separar um grupo dos possiveis aminoacidos que se enquadram nessa situação, são eles o Triptofano, Serina ou Treonina.
Índice hidropático da Triptofano = -0,9
Índice hidropático da Serina = -0,8
Índice Hidropático da Treonina = 0,7
Para a identificação precisa do aminoácido seria necessário uma nova corrida cromatográfica, utilizando o aminoácido desconhecido, o padrão do Triptofano, Serina e da Treonina. Analisando o RF de cada um, seria possível a identificação.
CONCLUSÃO
 Com o resultado da cromatografia de papel, comprova-se que esse método é eficiente na separação dos aminoácidos, na qual os aminoácidos que possuem maior índice hidropático se deslocam mais sobre a placa, e estes, possuem também um maior valor de Rf. Esta prática também nos dá uma ideia da eficiência de separação com um determinado solvente, o solvente a ser usado vai da característica do composto a que se quer isolar.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
LEHNINGER, Princípios de bioquímica 4 ed. Servier Editora de livros médicos Ltda, 2006.
Pavia, Donald L., Química Orgânica Experimental: técnicas de escala pequena, Porto Alegre, Bookman, 2009.