Sebenta Microbiologia alimentar com exames

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ESAPP

Giovanna Calvão

18/11/2018

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Sebenta Microbiologia Alimentar
2017/2018
(Prof. Fernando Tavares e Prof. João Cabral)

Giovanna Calvão
Microbiologia alimentar – FCUP | 2017/2018

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Índice programático
Cap. 1: Introdução à microbiologia alimentar;
Cap. 2: Ubiquidade e diversidade dos microrganismos. Microrganismos produtores
de alimentos, de alteração e patogénicos. Plasticidade genómica e rápida
multiplicação dos microrganismos.
Cap. 3: Macronutrientes, micronutrientes e fatores de crescimento. Categorias
nutricionais de microrganismos. Fatores que condicionam o crescimento de
microrganismos.
Cap. 4: Curva de crescimento. Contagens diretas de células.
Cap. 5: Cultura em sistema contínuo ou aberto. Metabolitos primários e secundários.
Cap. 6: Fatores intrínsecos e extrínsecos. Potencial redox.
Cap. 7: Bactérias patogénicas em alimentos. A presença de Listeria monocytogenes,
Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens e C. botulinum, Bacillus cereus,
Brucella, Campylobacter e Yersinia enterocolitica. Reservatório da bactéria no
ambiente, toxinas, contaminação e crescimento nos alimentos, dados clínicos e
saúde pública.
Cap. 8: pH e qualidade de alguns alimentos. Conceitos ecológicos em microbiologia
de alimentos.
Cap. 9: As bactérias do ácido láctico. As bifidobactérias. A importância da
composição da flora intestinal para a saúde do homem. Probióticos. Prebióticos.
Simbióticos. Metabióticos. Microbiologia do iogurte. Microbiologia do quefir.
Microbiologia do queijo. Microbiologia do pão, do vinho e da cerveja.
Microrganismos indicadores (indicator) e substitutos (surrogate). Microbiologia
dos produtos embalados.
Cap. 10: Aditivos alimentares. Conservantes. Elementos antimicrobianos de origem
animal. Elementos antimicrobianos de origem vegetal e microbiana. Técnicas de
preservação de alimentos.
Cap. 11: Avaliação da qualidade microbiológica dos produtos vegetais.
Microrganismos indicadores, sinalizadores e sentinelas. FOODNET CANADA - O
sistema nacional Canadiano integrado de vigilância microbiológica alimentar.

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Objetivos do estudo da microbiologia alimentar
1. Análise da diversidade microbiana nos alimentos;
2. Compreensão do motivo da presença de microrganismos nos alimentos
tendo em conta a composição nutricional dos alimentos;
3. Caracterização do tipo de relação entre alimentos e microrganismos, seja
toxicidade, transformação ou deterioração;
4. Avaliação dos impactos económicos, de saúde pública e na produção
industrial de alimentos.

Introdução
Problemas relacionados com a segurança alimentar são um problema de
saúde pública importante. Muitos patogénicos de origem animal ou vegetal
preocupam seriamente a comunidade agrícola devido ao elevado nível de contágio
que representam, resultando numa taxa de mortalidade elevada. Exposição a estes
agentes patogénicos resultam em aproximadamente 76 milhões de doenças, 325000
hospitalizações e 5000 mortes só nos EUA. Em adição ao problema de saúde pública
há também a perda de lucro associada a estes surtos, alguns destes microrganismos
são a E. Coli, Salmonella typhimurium, Stapylococcus aureus, Listeria monocytogenes
e Enterococcus faecalis.
As doenças de origem alimentar (foodborne illness) dividem-se em três
tipos:
Intoxicações alimentares – provocadas pela ingestão de substâncias
tóxicas, as toxinas, que são sintetizadas no alimento pela ação da proliferação e
metabolismo microbianos; Ex – Staphylococcus aureus, Clostridium Botulinum e
biotoxinas.
Infeções alimentares – provocada pela presença de microrganismos
patogénicos, o qual coloniza o hospedeiro, sem produção de toxinas; Ex – Salmonella
spp., Listeria monocytogenes, E. Coli, Shigella spp., Yersinia enterolitica, virus...
Toxinfeções alimentares – provocada pela presença de microrganismos
patogénicos com produção de toxinas; Ex – bacillus cereus, clostridium perfringens,
vibrio cholerae...
Food producers
• Microrganismos
com certas
propriadades, p.e.
relacionados com a
fermentação do pão,
entre outros;
Food spoilers
• Microrganismos que
deterioram
alimentos;
Food poisoners
• Microrganismos
que, após serem
ingeridos através de
alimentos, provocam
mal-estar;
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História
3180 AC – 1ª Dinastia do Egipto, Imperador Shemsu, afetada por uma grande
epidemia (peste);
1000 AC – Secagem, fumeiro, salga e especiarias utilizadas na China para
conservação de alimentos.
79 – Epidemia, provavelmente de antrax, em Itália. Surge após a erupção do Vesúvio
e provoca mortalidade em gado. Simultaneamente uma peste de origem
desconhecida causa grande mortalidade na população humana (Bacillus anthracis).
857 – Referências a uma intoxicação alimentar que causa vómitos, sensação de
calor ou frio intenso, dores musculares e alucinações: ergotismo ou Fogo de S.
António. Intoxicação provocada pelo esporão-do-centeio (Claviceps
purpurea), que produz alcalóides que contaminam o pão.
900 – Primeira referência ao botulismo (Clostridium botulinum). Imperador
Leo VI do império Bizantino proíbe o consumo de sangue em alimentos.
1070 – Um pedaço de queijo fresco esquecido por um pastor numa cave na região
de Roquefort fica contaminado por um bolor esverdeado que mais tarde foi
classificado como Penicillium roqueforti. Surgia assim o Queijo Roquefort.
1800 – É usada a lixívia para a sanitização da água de consumo.
1826 – Pandemia de cólera (Vibrio choleare) surge no sudeste da Ásia e alarga-
se à Europa, Inglaterra em 1831 e Paris em 1832. Estende-se ao Canadá no verão
de 1832 transmitida por emigrantes Irlandeses e no mesmo ano aos USA.
1846– Grande fome na Irlanda provocada pelo míldio da batata (Phytophthora
infestans, oomiceto). Um milhão de mortes e um milhão de emigrados.
1846 – John Snow apresenta os seus trabalhos sobre a transmissão da cólera
pela água. Localiza efluentes da contaminação.
1856 – William Budd sugere a transmissão da febre tifoide através de águas
contaminadas com as fezes de pessoas infetadas. Sugere a sanitização química da
água.
1861 – Pasteur apresenta as experiências com os frascos de pescoço-de-cisne.
O esclarecimento final da controvérsia surge com as experiências de Ferdinand
Cohn (1875 e 1876) que revela a resistência de esporos bacterianos ao calor.
1890 – Descoberta por Knut Helge Faber a exotoxina do tétano.
1892 – Richard Friedrich Johannes Pfeiffer introduz o termo endotoxina
relativo a bactérias cujos filtrados de cultura não provocam doença. Entre as
doenças provocadas por endotoxinas contam-se a febre tifoide, cólera e pneumonia.
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Crescimento bacteriano
As bactérias geralmente reproduzem-se assexuadamente por fissão binária,
nesse processo ocorre a replicação do cromossoma e uma célula divide-se em duas,
de seguida ocorre a divisão do cromossoma replicado e o desenvolvimento de uma
parede celular transversal. Pode também ocorrer gemulação, esporulação ou
fissão múltipla.

O crescimento por fissão binária pode ser representado como o logaritmo de
células viáveis em função do tempo de incubação resultando numa curva que
apresenta 4 fases distintas:

Fase lag – também chamada de fase de espera, não há um aumento do nº de
células, no entanto, o metabolismo das células é elevado pois encontram-se a
sintetizar novos componentes. Esta fase é necessária pois podem ser células velhas
que não possuam enzimas/ATP
necessários para o crescimento, podem estar
danificadas e a precisar de tempo para recuperar, etc. Varia com a condição de
microrganismos e com a natureza do meio;
Fase exponencial (log) – há o crescimento rápido dos microrganismos,
dividem-se e duplicam o seu nc em intervalos regulares, é uma reta cuja inclinação
depende da velocidade da divisão das bactérias. A população é mais uniforme em
termos de propriedades químicas e físicas durante estas fase e, assim, culturas nesta
fase são normalmente usadas em estudos bioquímicos e fisiológicos;
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Fase estacionária – o nº de mortas iguala-se ao nº de células produzidas,
resultando num equilíbrio na população, podendo ocorrer por várias razões, por
exemplo, quando começa a haver carência de nutrientes, quando o O2 esgota,
quando começa a haver acumulação de produtos tóxicos. As células podem adquirir
resistência ao facto de haver falta de nutrientes produzindo proteínas starvation
que a tornam mais resistente ao dano causado – logo, tornam-se mais difíceis de
matar e mais virulentas;
Fase de declínio/morte – as bactérias passam a morrer mais rapidamente
do que a população de novas células, sendo normalmente logarítmica, ou seja, uma
proporção constante de células morre todas as horas.

 Matemática do crescimento microbiano
Durante a fase exponencial cada microrganismo se divide em intervalos
constantes, assim, a população duplicará em numero durante um período específico
designado tempo de geração (doubling time).
Suponhamos que um tubo de cultura é
incubado com uma célula que se divide a cada 20
minutos: a população será de 2 células após 20
minutos, 4 células após 40 minutos e por aí
adiante.
Assim o aumento de população é sempre
→ 2n (n é o nº de gerações)
Podemos descrever estas observações
como equações para o tempo de geração (g),
sendo: N0=nº inicial da população; Nt=população
no momento t; n=nº de gerações no momento t.

A taxa de crescimento durante a fase exponencial em cultura fechada pode
ser expressa em termos da constante da taxa de crescimento médio (k), que
consiste no número de gerações por unidade de tempo, normalmente expressa
como gerações por hora:

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O tempo que é necessário para uma população duplicar em tamanho, isto é,
o tempo médio de geração (g), pode ser calculado por:
O tempo médio de geração (g) é o
inverso da constante da taxa média
de crescimento (k)
Os tempos de gerações variam bastante com as espécies de microrganismos
e com as condições ambientais, podendo variar entre menos de 10 minutos até
vários dias – no entanto, é preciso ter em conta que os tempos de geração na
natureza são normalmente maiores que em cultura.

Cultura em sistema fechado – microrganismos passam pelas fases
mencionadas acima – lag, exponencial, estacionária e morte/declínio.
Cultura em sistema contínuo ou aberto – consiste num sistema que
mantém as culturas sempre em fase exponencial através do fornecimento constante
de nutrientes (meio de cultura fresco, p.e) e pela remoção contínua de resíduos;
↳ Quimiostato: neste tipo de sistema o fluxo de
entrada e saída de nutrientes mantém-se a um
determinado valor de tal maneira que a velocidade de
crescimento de cultura é ajustada à velocidade do fluxo
– o meio de cultura possui um nutriente essencial em
quantidades limitantes. Permite, assim, estudar o
crescimento microbiano e tem aplicações em várias
indústrias;

↳ Turbidostato: inclui um dispositivo que lê a turvação do meio e ajusta a
entrada e saída de nutrientes de acordo com essa leitura, mantendo assim o nível
populacional da cultura e a densidade celular.

 Quantificação do crescimento microbiano
Existem dois modos de quantificar o crescimento microbiano para
determinar as taxas de geração e tempos de geração – pelo aumento do nº de células
ou pelo aumento da massa total da população. Assim, para se determinar o nº de
UFC (células viáveis):
1. Método de diluição em placa
Quando a concentração é grande, preparam-se várias diluições seriadas
numa sequência de 1:10 para se semear cada uma dessas diluições num
meio nutritivo, usando alíquotas, onde as bactérias se poderão reproduzir
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e formar colónias. No final, escolhe-se a placa que tiver entre 15-150
colónias e conta-se o nº de colónias, multiplicando-se pelo fator de
diluição.
2. Método de sementeira por espalhamento (spread plate)
A amostra diluída deve ser pipetada sobre a superfície do meio sólido e
espalhado com uma vareta de vidro (semeador de vidro) dobrada em L
de forma homogénea, vão-se, então, formar colónias isoladas à superfície.
Para haver sucesso no isolamento de colónias é necessário que o nº de
bactérias viáveis presentes não seja muito elevado. Obs: as placas vão a
incubar em posição invertida, pelo que é necessário que o meio esteja
sólido.

3. Método por incorporação
Pipeta-se primeiro a amostra diluída para a placa estéril e só depois é
adicionado o meio de cultura apropriado, no estado liquefeito,
misturando-se depois com cuidado. Neste método as colónias crescem
tanto à superfície como no interior do meio usado, ou seja, é um ponto
positivo para os microaerófilos (crescem em meios com quantidades
baixas de O2 – anaerobiose).

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Nutrição microbiana
Macronutrientes necessários (grandes quantidades) – carbono, oxigénio,
hidrogénio, nitrogénio, enxofre, fosfato, etc; encontram-se em moléculas orgânicas
como proteínas, lípidos, carboidratos e ácidos nucleicos.
Micronutrientes necessários (pequenas quantidades) –manganês, zinco,
cobalto, níquel, cobre, etc; estes são ubíquos e provavelmente não limitam o
crescimento.

 Produção de metabolitos
Os metabolitos são produtos intermediários das reações metabólicas
catalisadas pelas várias enzimas existentes nas moléculas. Existem 2 tipos:
1. Metabolitos primários – são produzidos no decurso de reações
anabólicas (requerem ATP), como a síntese de moléculas complexas a
partir de moléculas mais simples, e catabólicas (produzem ATP), como
reações de degradação/decomposição, que contribuem para o
crescimento das células – fase exponencial, maioritariamente;
Ex: etanol na fermentação alcoólica (produzido em grande escala pela
indústria);
2. Metabolitos secundários – são produzidos por vias anabólicas
especializadas quando não há crescimento (fase estacionária), não
estando diretamente envolvidos no processo de crescimento,
desenvolvimento ou reprodução de microrganismos;
Ex: vários antibióticos;

 Categorias nutricionais de microrganismos
Quanto à fonte de C – microrganismos autotróficos (CO2) ou heterotróficos
(compostos orgânicos);
Quanto à fonte de energia – luz, orgânica ou inorgânica.

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Categorias nutricionais
Fonte de
carbono
Fonte de
energia
Exemplos
Fotoautotrófico CO2 Luz
algas, bactérias
fotossintéticas
Fotoheterotrófico
Composto
orgânico
Luz bactérias fotossintéticas
Quimiolitoautotrófico CO2 Inorgânica
eurobactérias nitrificantes e
oxidantes de enxofre
Quimiolitoheterotrófico
Composto
orgânico
Inorgânica
algumas arqueobactérias
metanogénicas
Quimiorganoautotrófico CO2 Orgânica
eurobactérias
metilotróficas autotróficas
Quimiorganoheterotrófico
Composto
orgânico
Orgânica
fungos, protozoários
e a
maioria das eurobactérias

Os microrganismos quimiorganoheterotróficos (quimioheterotróficos)
representam a maioria dos patogénicos, ou seja, estes obtêm a energia através de
compostos orgânicos, usam substâncias orgânicas para obtenção de energia e
obtenção de carbono.
Apesar de uma espécie em particular normalmente pertencer a apenas um
dos tipos nutricionais, alguns mostram uma grande flexibilidade metabólica e
alteram os seus padrões metabólicos em resposta a padrões ambientais.
 Fatores de crescimento
Os microrganismos normalmente crescem e reproduzem-se quando
minerais e outras fontes de energia, carbono, etc são fornecidas pois possuem
enzimas e vias necessárias para sintetizar todos os componentes celulares
necessários para o seu crescimento. Porém, existem alguns que não apresentam
certas enzimas essenciais e não são capazes de produzir constituintes
indispensáveis, logo, terão de os obter a partir do ambiente em que se encontram.
Assim, os fatores de crescimento são esses compostos que a célula precisa
para crescer mas que não consegue sintetizar: aminoácidos são necessários para a
síntese de proteínas, purinas e pirimidinas são necessárias para a síntese de ácidos
nucleicos e vitaminas que sustêm o crescimento microbiano.

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 Metabolismo microbiano
O metabolismo pode ser dividido em duas partes principais:
1. Catabolismo - moléculas maiores e complexas são quebradas em
moléculas mais pequenas e simples com a libertação de ATP. Alguma
desta energia é armazenada e tornada disponível na forma de calor, o
resto é libertado como calor;
2. Anabolismo – gasta a ATP armazenada no catabolismo na síntese de
moléculas complexas a partir de outras mais simples. Usa energia de
modo a aumentar a ordem do sistema;

Os microrganismos usam, normalmente, uma das três fontes de energia: os
fotolitotróficos capturam a energia solar, os quimiorganotróficos oxidam
moléculas orgânicas para libertar energia e os quimiolitotróficos usam nutrientes
inorgânicos como fontes de energia.
Porém, podem ser flexíveis quanto a este aspeto e também quanto a nível de
aceitadores de eletrões que são usados pelos quimiotróficos, distinguindo-se em:
1. Fermentação – o substrato é oxidado e degradado sem a participação de
um aceitador de eletrões externo ou derivado; normalmente a via
catabólica produz um intermediário como o piruvato que desempenha
esse papel; a fermentação ocorre, normalmente, sob condições aeróbias,
porém, pode ocorrer por vezes quando o O2 está presente;
Em microbiologia – processo fornecedor de energia no qual as
moléculas orgânicas funcionam tanto como aceitadores de eletrões e
dadores;
2. Respiração – usa aceitadores de eletrões ou derivados e subdivide-se em
2 tipos:
a. Respiração aeróbica – o aceitador de eletrões final é o O2;
b. Respiração anaeróbica – o aceitador é usualmente inorgânico
(p.e, NO3-, SO42-, CO2, Fe3+, SeO42-, e outros), mas aceitadores
orgânicos como fumarato podem ser usados.
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Em microbiologia – processo fornecedor de energia no qual o aceitador
é uma molécula inorgânica, tanto oxigénio ou outro aceitador inorgânico.
A maior parte da respiração envolve a atividade de uma cadeia
transportadora de eletrões e a quantidade de energia disponível é diferente na
fermentação e na respiração:
↳ O aceitador de eletrões na fermentação encontra-se no mesmo estado de
oxidação do nutriente original, não existindo oxidação vinda do nutriente. Assim,
apenas uma quantidade limitada de energia se torna disponível;
↳ O aceitador de eletrões na respiração apresenta um potencial de redução
muito mais positivo do que o substrato e, assim, muito mais energia será libertada
durante a respiração.

Podemos definir três etapas do metabolismo aeróbico:
Etapa 1 – moléculas de nutrientes complexas (proteínas, polissacarídeos e
lípidos) são hidrolisadas ou quebradas nas suas partes constituintes e as reações
químicas que ocorrem durante esta etapa não libertam muita energia;
Etapa 2 – a.a, monossacarídeos, ácidos gordos, glicerol e outros produtos da
primeira etapa são degradados a moléculas mais simples nesta etapa. Normalmente,
metabolitos como acetil coenzima A, piruvato e intermediários do Ciclo de Krebs são
formados. Os processos desta etapa são capazes de operar tanto aerobicamente
como anaerobicamente e muitas vezes produzem ATP, NADH e/ou FADH2;
Etapa 3 – nutrientes carbonados são introduzidos no ciclo de Krebs e são
oxidados completamente a CO2 com a produção de ATP, NADH e FADH2 pela cadeia
transportadora de eletrões. O oxigénio, ou por vezes outra molécula inorgânica, é o
aceitador de eletrões final.
Assim, as moléculas de nutrientes vão sendo afuniladas para alguns
intermediários metabólicos (metabolitos) até serem introduzidas no ciclo de krebs.
Uma via comum degrada várias moléculas semelhantes sendo que a existência de
algumas vias catabólicas comuns aumenta bastante a eficácia metabólica,
diminuindo a necessidade de uma flexibilidade metabólica.

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Fatores que afetam o crescimento de microrganismos em
alimentos

1. Temperatura
Para todos os microrganismos existem 3 temperaturas importantes:
temperatura mínima (abaixo da qual não há crescimento), temperatura ótima (onde
o crescimento é máximo) e temperatura máxima (acima da qual não há crescimento
pois as enzimas foram danificadas pelo calor).
De acordo com a temperatura de crescimento é possível distinguir, pelo
menos 3 grupos fisiológicos de bactérias:
a. Psicrófilos: crescem entre a 0 ᵒC e 20 ᵒC (ex: bacillus psyrophilus,
chlamydomonas nivalis);
b. Psicrotrófico: são capazes de crescer entre 0-7 ᵒC e apresentam um
crescimento ótimo entre 20-30 ᵒC e um máximo a 35 ᵒC (ex: Listeria
monocytogenes, pseudomonas fluorescens);
c. Mesófilo: desenvolvem-se entre 20-45 ᵒC (ex: E.coli);
d. Termófilo: capazes de crescer a 40-70 ᵒC (ex: Bacillus
stearothermophilus);
e. Hipertermófilo: apresentam um crescimento ótimo entre 80-113 ᵒC
(ex: sulfolobus);

Fatores extrínsecos
(características do ambiente):
Temperatura, humidade relativa,
presença e concentração de gases
(CO2 e O2).
Fatores intrínsecos
(características do substrato):
Nutrientes disponíveis, pH,
capacidade tamponante, potencial
oxidação-redução, atividade de
água (aw), barreiras
antimicrobianas e estruturas
biológicas.
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O fator mais importante da influência da temperatura no crescimento é a
sensibilidade de reações catalisadas por enzimas: a temperaturas baixas, um
aumento da temperatura aumenta a taxa de crescimento pois a velocidade de uma
reação enzimática duplica a cada aumento de 10 ᵒC, logo, o metabolismo é mais
ativo a maiores temperaturas até a uma certa temperatura em que se começam a
danificar estruturas como as enzimas.
Em alimentos são poucos os
psicrófilos que causam problemas,
porém, a Listeria monocytogenes e o
Clostridium botulinum conseguem
desenvolver-se a temperaturas
baixas de -0,4 ᵒC e 3,3 ᵒC,
respetivamente, até 5 ᵒC, ou seja,
conseguem desenvolver-se mesmo
dentro do congelador ou frigorífico.
A temperatura de
crescimento é conhecida por
regular a expressão de genes
virulentos em certos patogénicos,
por exemplo, a expressão de
proteínas governada pelo
plasmídeo virulento
da Yersinia
enterocolitica é alta a 37 ᵒC, baixa a
22 ᵒC e não detetável a 4 ᵒC. Neste
caso, o importante não é o
crescimento microbiano mas sim a
produção de toxinas que são a causa
das doenças.
Tem também impacto na Listeria monocytogenes (organismos
termosensível), quando inoculado partir de salsichas enlatadas a 48 ᵒC, o seu valor
de D aumenta até 64 ᵒC.
Subtemperaturas letais levam a bactéria a adquirir resistência à
temperatura imposta, passando esta característica a gerações futuras.
↳ Problema: a temperaturas elevadas os alimentos vêm-se livres da maioria dos
microrganismos, porém, as suas características organolépticas são alteradas.

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2. Oxigénio
O efeito do crescimento na quantidade disponível de O2 faz-se sentir no
crescimento microbiano em microrganismos aeróbios e facultativos. Quanto à
respiração, as bactérias podem ser:
Categorias
nutricionais
Ambiente aeróbio
Ambiente
anaeróbio
Efeito do O2
Aeróbios
obrigatórios
Crescem Não crescem
Necessário
(respiração aeróbia)
Microaerofílicos
Crescem (se
houver pouco O2)
Não crescem
Necessário em baixas
quantidades
Anaeróbios
obrigatórios
Não crescem
Crescem e
produzem toxinas
-
Anaeróbios
facultativos
Crescem Crescem
Não necessário +
usado
Aerotolerantes Crescem Crescem
Não necessário + não
usado

Resumindo: os aeróbios obrigatórios necessitam de O2 para crescer,
anaeróbios obrigatórios só crescem na ausência de O2, microaerofílicos precisam
de O2 mas em pressão inferior à atmosférica e aeróbios facultativos (ex:
salmonella) só quando não há O2 é que realizam a fermentação, quando têm acesso
a O2 realizam a respiração aeróbia porque há mais rendimento energético e os
aerotolerantes crescem na presença ou ausência de O2.

(a) Aeróbios obrigatórios;
(b) Anaeróbios obrigatórios;
(c) Anaeróbios facultativos;
(d) Microaerófilos;
(e) Anaeróbios aerotolerantes.

O metabolismo aeróbio é muito mais eficiente,
favorecendo o rápido crescimento da cultura em questão – via
aeróbia tem como produtos finais de metabolismo o CO2 e H2O; já o
metabolismo anaeróbio (fermentativo) tem como produtos finais
compostos orgânicos que variam de acordo com o microrganismo
e que, na maioria das vezes, impedem o crescimento microbiano.
Uma agitação dos tubos
leva a: melhor aeração do
meio, homogenização dos
nutrientes do meio e uma
dispersão de metabolitos.
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3. pH
O ph é a medida de atividade do ião hidrogénio numa solução e é definido
como o logaritmo negativo da concentração desse ião (pH=−log[H+]). Os habitats nos
quais os microrganismos crescem são vários, sendo que cada espécie apresenta uma
gama de pH de crescimento definido e um pH ótimo para o crescimento, podendo
ser distinguidas 2 classes:
a. Acidófilos: o seu crescimento ótimo varia entre 0 e 5,5; é o caso da
maioria dos fungos e de bactérias encontradas em fluídos gástricos,
vinagre, sumo de frutos, alimentos fermentados, etc;
b. Neutrófilos: o seu crescimento ótimo varia entre 5,5 e 8,0; é o caso da
maior parte das bactérias e protozoários;
c. Alcalófilos: o seu crescimento ótimo varia entre 8,5 e 11,5 (alcalófilos
extremos crescem a um pH igual ou superior a 10,0); é o caso de
bactérias encontradas em lagos e solos alcalinos;

Usualmente as bactérias mantêm o pH interno perto do pH neutro para
prevenir mudanças conformacionais nas suas estruturas como enzimas, ácidos
nucleicos, fosfolípidos e proteínas. Variações drásticas no pH citoplasmático podem
danificar a membrana plasmática e inibir a atividade de enzimas e proteínas de
transporte membranar, se houverem alterações no pH externo há alterações a nível
da ionização de moléculas e nutrientes, reduzindo, assim, a disponibilidade destas
moléculas para o organismo.
Os microrganismos possuem vários mecanismos que lhes permitem
sobreviverem a alterações de pH e manterem a sua neutralidade tais como a
presença de tampões internos, o facto da membrana plasmática ser relativamente
impermeável a protões, etc. Por exemplo, se o pH externo descer a 5-6 a Salmonella
Notas: em alimentos enlatadas
sem acesso a O2, microrganismos
como o Clostridium Botulinum
desenvolvem-se ativamente.

Notas: Pseudomonas aeruginosa é
aeróbio obrigatório, a E.coli é
anaeróbio facultativo e o
Clostridium Botulinum é um
anaeróbio obrigatório.

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typhimurium e E. coli
sintetizam uma gama de
novas proteínas como parte
da sua resposta de tolerância
à acidez.
A acidez é o principal
fator que garante a
conservação dos alimentos
fermentados, podendo este
fator ser combinado com
outros que também
promovem a sua
conservação tal como o calor,
adição de conservantes, etc.
Como os alimentos de origem animal têm um pH mais alto que os de origem
vegetal, aproximando-se da neutralidade (ex: carne logo após o abate, leite, peixe,
ovos...), estão mais suscetíveis ao crescimento de microrganismos pois esse é o pH
ótimo de crescimento para os mesmos. Existem exceções como os iogurtes e queijos
que possuem um pH ligeiramente mais baixo tal como os vegetais e frutas devido
aos processos fermentativos que sofreram.

Resumindo: para alimentos com um pH > 4,5 há uma predominância de
crescimento microbiano (patogénicos, esporângicas ou não, aeróbios ou anaeróbios,
mesófilos ou termófilos), para alimentos com um pH entre 4,5 e 4,0 há uma
predominância de leveduras oxidativas ou fermentativas e de bolores (em
aerobiose) e de algumas bactérias formadoras de esporos ou não, já para alimentos
com pH < 4,0 ficam restritos a quase que exclusivamente leveduras e bolores.

ALIMENTOS pH
Neutros
Carne logo após o abate, leite, peixe...
7,0-6,5
Pouco ácidos
Carne fresca, toucinho fumado, vegetais enlatados
6,5-5,3
Acidez média
Vegetais fermentados, queijos
5,3-4,5
Ácidos
Frutos, sumos de fruta, tomate, iogurte...
4,3-3,7
Muito ácidos
Picles, citrinos
<3,7
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4. Atividade da água (aw)
A disponibilidade de água não depende apenas da quantidade absoluta de
água, sendo também um fator de concentração de solutos como sais, açúcares e
outras substâncias solúveis em água.
A atividade da água (aw) é, então, uma medida da quantidade de água
disponível que existe num alimento e que pode ser comparada ao valor da humidade
relativa, p.e, no estado sólido esta percentagem é muito baixa. Quanto maior for a
atividade da água de um alimento, maiores serão as possibilidades para o
crescimento de microrganismos. Assim, alimentos com elevada atividade da água
(p.e, leite e carne) serão facilmente sujeitos a degradação por ação dos agentes
microbianos enquanto que alimentos com menor atividade da água (p.e, cereais)
têm um período de conservação maior.
A atividade da água de uma solução é 1/100 da humidade relativa da solução,
ou seja, é expressa em percentagem. É inversamente proporcional à pressão
osmótica, pelo que se essa for elevada, então aw é também elevada.
aw =
Psolução
Págua

De um modo geral, o balanço da água é positivo, na medida em que o
citoplasma é, tipicamente, mais concentrado, o que permite que a água entre na
célula por osmose. No entanto, se a célula se encontrar num meio hipertónico, cuja
concentração
exceda a do citoplasma, a água vai sair da célula e essa irá ter que fazer
um esforço extra para contrariar essa tendência, já que uma célula desidratada não
apresenta crescimento.
Os microrganismos conseguem viver com valores de aw de 0,7 até 1, porém,
são poucos os que conseguem multiplicar-se com valores abaixo de 0,98
(aproximado do valor da água do mar). Isto explica o porquê de alimentos secos
ou com a adição de grandes quantidades de sal ou açúcar conseguem ter uma
vida útil muito maior.

O conceito de baixar a aw para se prevenir o crescimento de microrganismos é a
base da preservação de alimentos por secagem (ao sol ou por evaporação) ou
através da adição de elevadas % de sal ou açúcar.

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Podemos ter duas classes de microrganismos no que toca à sobrevivência
quando há valores baixos de aw:
a. Halófilos: microrganismos que requerem a presença de NaCl para
conseguirem crescer
a. Halófilos fracos: organismos que necessitam da presença
moderada de sal, como é o caso das espécies marinhas cujo
crescimento ótimo requer 1-6% de NaCl;
b. Halófilos moderados: organismos que conseguem suportar
ligeiras reduções de aw mas cujo crescimento ótimo se verifica
na ausência do soluto em questão (6-15% NaCl);
c. Halófilos extremos: organismos que habitam ambientes
muito salgados, requerendo 15-30% de NaCl, dependendo da
espécie;
b. Osmotolerantes: são capazes de manter uma concentração de
solutos elevada de modo a reter água, crescendo em várias gamas de
aw ou concentração osmótica. P.e, alguns fungos são osmotolerantes
estando envolvidos na deterioração de alimentos secos e salgados;
a. Osmófilos: organismos capazes de viver em meios com altas
concentrações de açúcar;
b. Xerófilos: organismos capazes de viver em ambientes muito
secos.
Apesar de microrganismos halófilos serem osmófilos, este último termo é
mais usado para organismos que conseguem viver em ambientes com elevada % de
açúcar.
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Notas: Alimentos sem água são completamente seguros à temperatura
ambiente, especialmente se estes forem liofilizados (quer dizer que não possuem
água); no pão, a côdea tem um valor de aw menor que o do miolo, ou seja, serve de
barreira antimicrobiana.
5. Barreiras antimicrobianas e estruturas biológicas
Aditivos alimentares podem ser classificados de acordo com 6 funções
primárias: preservação, melhoramento no valor nutricional, adição ou substituição
de cor (sulfitos, nitritos), adição ou substituição de sabor (nitritos e alguns ácidos
orgânicos), melhoramento na textura e auxiliares tecnológicos. Atualmente os
consumidores estão a inclinar-se mais para alimentos que tenham características de
alimentos frescos, ou seja, o uso de tratamentos extremos e/ou aditivos já não os
satisfazem.
a. Barreiras antimicrobianas – proteínas com ação enzimática (lisozima,
atua sobre os peptidoglicanos, destruindo assim a parede celular (Gram -
)), as lactoperoxidases têm uma atividade tóxica sobre os microrganismos
e as ferritinas são quelantes de ferro, atuando sobre os seus iões;
b. Estruturas biológicas – epicarpo de um fruto, pele de um animal, côdea
de um pão;
As barreiras
antimicrobianas são
compostos químicos que
são adicionados ou
presentes nos alimentos
que retardam o
crescimento microbiano
ou que causam a sua
morte. Podem ser naturais
(ocorrem livremente na
natureza, como mostra a
tabela abaixo), produzidas
pelos microrganismos ou
adicionadas ao alimentos.
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Por exemplo, algumas especiarias possuem atividade inibidora muito
elevada, como é o caso da canela e do cravo (eugenol), moderada na pimenta
também e o alho (alicina – atividade mais eficiente que alguns antibióticos,
antigamente as pessoas usavam-no mastigando pois alivia dores de dentes). Os
microrganismos podem também têm atividade antimicrobiana, chamados de
bactericidas, p.e, o ácido lático produzido pelas bactérias láticas pode ser usado em
leite não UHT.
Em moléculas antimicrobianas de origem animal temos as de origem
proteíca como lactoferrinas, lisozimas, lactoperoxidases e lactoglobulinas
presentes em leite de vaca, ovotransferrina, ovoglobulina, imunoglobulina Y
presentes em ovos – todos estes compostos são polipéptidos e possuem um
mecanismo comum de ação. Quanto a peroxidases temos a lactoperoxidase (LP) e
hemoproteína presentes no leite, saliva e lágrimas, sendo a enzima mais abundante
no leite de vaca – tem uma ação inibidora de bactérias, fungos, parasitas e vírus. As
glicoproteínas (sequestradoras de Fe) como as lactoferrinas, lactotransferrina ou
lactosideroforina, são moléculas que contribuem para o controlo de ferro em fluídos
biológicos, tendo também atividade microbiana.
Já os elementos antimicrobianos de origem vegetal englobam compostos
fenólicos (antioxidantes – atacam especialmente bactérias Gram +), terpénicos,
álcoois aliafáticos, aldeídos, cetonas, ácidos e bioflavonóides.
A alicina é um composto presente em alhos e cebolas, é um óleo sem cor,
extremamente pungente (picante/doloroso) que dá o sabor e odor característico
aos mesmos. Tem uma atividade antimicrobiana de bactérias gram – e gram +, bem
como de fungos, p.e a S. Aureus. A inibição é causada pela alicina, sendo apenas
obtida após a injúria das células do mesmo, nomeadamente no vacúolo, ou seja só
quando o alho é cortado é que há inibição.
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Tipo de ação das moléculas antimicrobianas

a. Bacteriostática (fungistático,
algistático): têm como função
impedir a proliferação dos
microrganismos, apenas impede a
multiplicação das bactérias, não as
matando. Usualmente são inibidores
de síntese proteica e atuam por
ligação reversível nos ribossomas –
exemplos: álcool etílico;
b. Bactericida: são substâncias que
matam de forma direta os
microrganismos, inibindo enzimas
que desempenham um papel
fundamental na sobrevivência dos
mesmos;
c. Bacteriolítica: são substâncias que,
para além de matar as bactérias e
impedindo a sua proliferação,
destroem a parede celular através
da lise celular, o que faz com que
estes percam todo o material
interno – exemplos: penicilina,
antibiótico natural produzido pelo
fungo Penicillium chrysogenum.

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Microbiologia preditiva
Os fatores mais importantes a ter em conta no que toca à preservação e
otimização de alimentos são o pH, a temperatura e aw. Porém, é muito difícil
relacionar os três fatores pois os valores discretos de pH, temperatura e aw variam
uns com os outros, logo, a relação entre os três não é imediata – a solução passa pela
microbiologia preditiva que partindo de certos valores conseguimos obter uma
função quadrática, permitindo-nos correlacionar os fatores.

A microbiologia preditiva descreve, de forma quantitativa, os efeitos dos
fatores intrínsecos e dos fatores extrínsecos no crescimento ou inativação dos
microrganismos nos alimentos. Para isso são construídos modelos matemáticos
derivados de estudos quantitativos sob dadas condições experimentais, obtendo no
final uma curva que descreve o crescimento, viabilidade ou a morte dos
microrganismos.
Assim conseguimos compreender como as diferentes propriedades de um
alimento, a sua origem o seu acondicionamento, podem influenciar a microflora,
é
um primeiro passo para fazer deduções assertivas sobre o tempo de prateleira, a
deterioração e segurança microbiológica dos alimentos.

Nomenclatura em modelos preditivos:
 Fator: o fator é uma variável independente, como a temperatura ou o pH
que tomam mais do que um valor;
 Tratamento: conjunto de vários fatores (p.e: pH a 6,5 e temperatura a 25
ᵒC);
 Resposta: variável dependente, é aquilo que estamos a medir e a modelar
(p.e: taxa de crescimento);
 Parâmetro: algoritmo que é aplicado ao tratamento e permite obter uma
resposta concreta, relacionando o tratamento com a resposta.

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Tipos de modelos
A maneira mais simples de categorizar os modelos é considerando os
diferentes tipos em termos do uso ou para avaliar os perigos recorrentes que
poderão acontecer (modelos de crescimento ou a redução dos mesmos (modelos de
inativação ou sobrevivência).
Há dois grandes grupos de modelos: os descritivos/empíricos
(observacionais, empíricos) e os mecanicistas (teóricos, dedutivos), sendo que os
primeiros são orientados por “data”, incluindo funções polinomiais e “redes neurais
artificiais” e o último é composto por modelos analíticos e numéricos. Estes modelos
não permitem fazer extrapolações para além do limite permitido pelos dados
experimentais.
Os modelos mecanicistas têm como objetivo relacionar os dados recolhidos
com com princípios científicos fundamentais; muitos modelos têm parâmetros que
são relacionados com fenómenos observados e, assim sendo, caem nesta classe –
modelos analíticos.
Previsibilidade versus aleatoriedade
A maioria dos modelos falados são modelos deterministas, isto é, com o
conhecimento das condições iniciais e depois de funções matemáticas podemos
descrever o comportamento do sistema ao longo do tempo e é suficiente para
prevermos o estado do mesmo em qualquer ponto do tempo. Porém, as bactérias
não são assim tão cooperativas e as condições iniciais são menos claras.
Os modelos que reconhecem e tomam ou variabilidade em sistemas
experimentais são chamados de modelos estocásticos/probabilísticos, têm sido
usados para prever a probabilidade de germinação de bactérias esporulantes
patogénicas.

Amostragem
Amostragem de uma coleção de boa qualidade de curvas de crescimento é
usada para construir os modelos, não existe um nº mínimo de curvas necessárias
para a construção de um modelo mas normalmente são necessárias 70-100 curvas.
Fatores
Nunca conseguimos considerar todos os fatores na composição do alimento,
por isso temos de escolher aqueles que são mais importantes no controlo do
crescimento microbiano. Os mais importantes, como já foi referido, são o pH, a
temperatura e aw.

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Planeamento e design
Podemos ter design fatorial completo que é quando todas as diferentes
combinações de fatores são investigadas, ou seja, é um tanto exaustivo no que toca
ao nº de experiências. Por exemplo, se considerarmos um estudo experimental que
usa uma resposta mensurável binariamente e que use 3 classes de variáveis (p.e:
sidra de 3 tipos de plantas, um tratamento de congelamento-descongelamento e
agentes preservantes como o sorbato de potássio) e 4 variáveis contínuas (p.e: pH
da sidra, temperatura de armazenamento e concentração de preservação) resulta
em 1596 tratamentos para os 3 tipos de sidra e como um tipo de sidra foi testado
em duplicado e os outros em triplicado, o nº total de experiências é de 12768, o que
é muito.
Ou podemos ter um design fatorial fracionado que tem com objetivo
reduzir o nº de experiências necessárias, porém, são mais difíceis de construir e por
isso há vários tipos que se podem aplicar, sendo que o mais usado é o Box-Behnken
design.

Objetos de estudos
Há várias abordagens aquando da escolha da estirpe para ser usado em
modelos de microbiologia preditiva, podemos usar uma só estirpe ou uma mistura
de diferentes estirpes (um cocktail). Para conseguirmos escolher é importante
clarificar qual o objetivo do uso do modelo: o modelo vai ser usado para prever o
possível crescimento de uma espécie de patogénicos em específico ou vai ser usado
como modelo da flora de deterioração de um produto alimentar específico?
Uma estratégia usado é escolher a estirpe que cresce mais rápido nas
condições ambientais investigadas, pois é esse que vai estragar o produto primeiro,
já que cresce mais rápido – ou seja, vai simular o pior cenário possível (dá-nos uma
garantia de segurança). As estirpes usadas para desenvolvimento de um modelo
podem, também, ser isoladas a partir a comida que está em investigação, sendo que
é de grande importância que se use mais do que uma estirpe da espécie para aferir
a sua influência.
Quanto à patogenicidade, as estirpes escolhidas devem ser patogénicas
quando há condições para isso, como é algo que não é fácil podem-se usar estirpes
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não patogénicas e conseguimos obter os dados através de uma sobre estimativa. O
ideal é, também, serem usados cocktails (mistura de estirpes) – variabilidade
intra específica, pois (1) é muito mais representativa da situação encontrada nos
alimentos – heterogeneidade, onde uma flora de estirpes é muito mais provável do
que só 1 estirpe e (2) não é necessariamente a mesma estirpe que demonstra um
crescimento rápido em todos os fatores considerados – p.e, uma estirpe com mais
tolerância a concentrações elevadas de NaCl pode ser a mais rápida nestas
condições e com um pH alto mas não necessariamente quando a concentração de
NaCl e de pH são baixas.

Fases importantes da microbiologia preditiva
1. Planeamento: definição clara do problema em mãos.
a. Definir a principal prioridade: deterioração do alimento ou
segurança? Qual o microrganismo de maior preocupação?
b. Determinar a resposta ou variável dependente, p.e: taxa de
crescimento, produção de toxinas, tempo de deterioração?
c. Determinar a causa ou variáveis independentes, p.e temperatura,
pH ou aw?
2. Recolha de dados: a variável dependente é determinada por diferentes
valores das variáveis independentes que devem cobrir toda a amplitude
da escala em que estamos interessados.
3. Adequabilidade do modelo: diferentes modelos que relacionam a
resposta (variável dependente) às variáveis independentes são testados
para se determinar o mais ajustado aos dados experimentais.
4. Validação do modelo: o modelo é avaliado através de dados
experimentais não utilizados na sua construção

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Modelos primários
Um modelo primário de crescimento microbiano descreve a cinética do
mesmo tendo em conta tão poucos parâmetros quanto possível, sendo mesmo assim
possível definir com precisão os diferentes estágios de crescimento como na figura
abaixo– normalmente usa-se para descrever o crescimento na densidade da
população um log base 10. Estes modelos têm como base equações, logo são
modelos mecanicistas.

Os chamados modelos de viabilidade visam garantir a máxima segurança
alimentar, logo, é importante o seu entendimento, p.e, antigamente eram usados
destes modelos para assegurar a destruição dos esporos de C. Botulinum em comidas
enlatadas de pH ácido.

Estes modelos falados acima são lineares mas existem também modelos de
viabilidade não-lineares – aquelas que apresentam uma fase lag antes da
inativação e aquelas que exibem uma “cauda”, isto porque teoricamente
aceitou-se
que todas as bactérias possuíam comportamento logarítmico já que eram
populações homogéneas no que toca a tolerância térmica. Porém isso foi
questionado e levantou questões no que toca à validade das extrapolações feitas em
curvas de inativação lineares.

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Modelos de inativação de esporos
bacterianos apresentam um problema, p.e
bactérias como Bacillus e Clostridium spp.
podem existir em fase dormente (esporos), a
qual é termicamente resistente, sendo que a
germinação desses esporos pode ser
conseguida por tratamento com calor subletal.
Conclui-se, então, que há diferenças aquando do
uso deste tratamento se estivermos na presença
de esporos dormentes ou esporos ativos.

Foi introduzido, então, o termo ‘D’ (tempo de redução decimal) que define o
tempo necessário para que, a uma dada temperatura, haja uma redução de uma
unidade logarítmica da carga microbiana (é linear, ou seja, vai de 1000 para 100
para 10 e para 1) e o termo ‘Z’ está relacionado com os modelos secundários e
descreve o declive da curva de inativação térmica com o valor do declive igual à
mudança de temperatura necessária para efetuar uma alteração de 1 unidade
logarítmica no tempo.
Por exemplo: se d=14 minutos e
z=10 ᵒC a 65 ᵒC, quer dizer que se
tivermos 1000 CFU num certo momento a
essa temperatura, em 14 minutos
teremos 100 CFU pois houve uma
redução decimal.

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Modelos secundários
As mudanças microbianas recorrentes em alimentos estão relacionadas com
fatores ambientais – tanto extrínsecos como intrínsecos. Sendo assim, modelos
secundários são aqueles que descrevem a influência de x fatores ambientais sob o
crescimento microbiano, como físicas, químicas ou características bióticas.
Ou seja, o primeiro passo passa pelo desenvolvimento de um modelo de
crescimento/morte num ambiente constante (modelo primário) e só depois
determinar como os parâmetros desse são afetados por fatores ambientais
(modelo secundário).

Falibilidade dos modelos preditivos
Na maioria dos casos dos modelos teóricos, os alimentos são considerados
homogéneos, o que realmente não se traduz na vida real pois possuem uma
estrutura complexa (matrizes alimentares). Sendo assim, categorizaram-se 4
categorias para os alimentos:
1. Líquidos: fase aquosa, onde os microrganismos crescem platonicamente,
isto é, crescem livremente;
Exemplos – sopas e sumos (com material suspenso);
Uso em laboratório para imitar – meio de cultura de caldo;
2. Gelificados: regiões dos alimentos em que os microrganismos estão
imobilizados e crescem forçadamente em colónias;
Exemplos: patés, gelatinas, alguns queijos;
Uso em laboratório para imitar – células imobilizadas em agar ou
gelatina;
3. Superfícies: tanto de vegetais ou tecidos de carne, que resulta também em
formação de colónias;
Exemplos – tecidos vegetais e animais;
Uso em laboratório para imitar – agar ou gelatina;

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4. Emulsões: o crescimento dos microrganismos é maioritariamente
forçado pela disponibilidade da água;
Exemplos – aqui podemos distinguir de “oil-in-water” que são alimentos
como creme de leite, leite, molhos de saladas, maionese; “water-in-oil”
que engloba manteigas e margarinas e emulsões gelificadas do qual faz
parte queijo de leite integral;
Uso em laboratório para imitar – alkane, emulsões de cultura médias e
outras em que a fase aquosa é um gele com agarose;
Os microrganismos ocupam a parte aquosa dos alimentos e características
estruturais desta fase, sendo que os efeitos destas características estruturais no
crescimento microbiano incluem restrições na distribuição mecânica da água, a
redistribuição dos ácidos orgânicos pois pode haver redução da mobilidade
microbiana. Ou seja, conforme as características microestruturais de cada alimento,
também os microrganismos mudam de comportamento consoante isso. Isto tudo
contribui para o erro global que está relacionado com os modelos preditivos:
 Heterogeneidade dos alimentos como matriz;
 Modelar os alimentos;
 Competição microbiana;
 Adaptação e aquisição de tolerância;

Fase aquosa
Como já foi referido, a fase
aquosa é composta por água e por
lípidos mas os microrganismos só
crescem na água e não nos lípidos,
tendo um crescimento planctónico
com uma mobilidade que lhes
permite andar livremente;
normalmente há a um equilíbrio do
ambiente até que começa a haver
acumulação de biomassa e de
metabolitos que mudam o pH ou a
composição química.

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Superfícies
É a forma mais simples de
estrutura alimentar é a superfície, sendo
que nos modelos preditivos são usados
meios líquidos como comparação, como
sabemos que o crescimento microbiano
é muito mais rápido em elementos
líquidos, concluímos que se usa uma
sobre estimativa para se calcular
exatamente o valor do sólido.
Tipicamente o crescimento em
superfícies é colonial, o que resulta em
valores de crescimento menores. Isto
sugere que o ritmo de crescimento em
superfícies pode não estar bem previsto
pelos modelos que derivam de sistemas que usam culturas de caldo.
Fase gelificada
Em regiões gelificadas, os microrganismos estão imobilizados, tanto seja
uma só célula ou, quando estas se multiplicam, são forçadas a crescer em colónias.
As bactérias imobilizadas também diferem das culturas planctónicas na sua
suscetibilidade e compostos antimicrobianos, no seu metabolismo energético e nos
produtos finais do metabolismo. Os usos de modelos preditivos baseados em dados
com experiências com culturas levam a uma sobre estimativa neste caso.
Emulsões – crescimento planctónico ou colonial
“Oil-in-water” significa lípidos em água, aqui a estrutura é afetada pela
concentração e a forma da fase dos lípidos. Em sistemas de modelos experimentais,
a relação existente entre a concentração dos lípidos e a forma de crescimento dos
microrganismos indica que quando essa concentração é baixa (30% v/v), o
crescimento é planctónico/livre, só mudando quando a concentração era elevada
até 83% (v/v), onde ficaram imobilizadas entre as gotículas de lípidos compatadas,
resultando num crescimento em colónias discretas.
“Water-in-oil” significa água em lípidos, consiste numa fase aquosa dispersa
como gotículas discretas e irregulares de água numa fase lipídica/oleosa. As
gotículas podem ser contaminadas com microrganismos no ponto de fabricação da
emulsão. Assim, os modelos confirmaram que o crescimento bacteriano é restrito
quando a estrutura alimentar permanece intacta (isto é, quando as gotas não
formam um agregado).

Partes a negro: zonas lipídicas
Partes esbranquiçadas: zonas aquosas
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Modelação de alimentos
De maneira se prever o crescimento de microrganismos em alimentos de
uma maneira fiável é necessário o uso de condições químicas iniciais corretas; a
heterogeneidade estrutural dos alimentos resulta numa heterogeneidade química
que é complicada pela dinâmica dentro dos alimentos que modificam esse ambiente
químico – como os microrganismos ocupam a fase aquosa dos alimentos, é
importante que esta seja precisa.
Muitos alimentos contam com a concentração de ácidos orgânicos (ácido
lático, acético, benzoico, etc) para a sua preservação,
bem como com a adição de sal
ou açúcar. Logo, não é surpresa que muitos dos modelos usem como parâmetros
combinações de pH, aw e temperatura.
Quanto à competição microbiana ainda não foi incorporada em modelos
existentes pois pode não ser um problema em alguns alimentos, já que interações
entre estas só seriam possíveis quando os UFC atingissem um perigo potencial ou
mesmo deterioração. Em alimentos sólidos é determinada pela proximidade das
colónias na matriz alimentar, sendo que os gradientes gerados pelos seus
metabolitos podem influenciar os seus vizinhos.
Um conceito relacionado é a “capacidade máxima de transporte” (fase
estacionária) de cada produto alimentar, no qual a inibição de patogénicos por
outros microrganismos ocorre quando a flora competitiva atinge números nos quais
o ambiente não pode suportar nenhum crescimento adicional, isto está relacionado
com o esgotamento de nutrientes.
Adaptação e aquisição de tolerância
É importante não esquecer situações de stress no que toca ao crescimento de
microrganismos pois estes conseguem adaptar-se como resposta e adquirir
resistência, p.e, adaptação a métodos de conservação leva a uma taxa de
crescimento/sobrevivência maior do que aquela prevista pelos modelos, o que pode
levar à deterioração de alimentos e aumento do perigo associado.
Podem adquirir, p.e, tolerância ácida, já visto em Listeria monocytogenes,
associado a “acid shock proteins” quando expostas a uma diminuição do pH
extracelular. Não só isso mas esta tolerância está também associada a um aumento
da resistência térmica, osmótica e a stress a baixas temperaturas.
Os efeitos da estrutura do alimento são também significativos pois como
resultado da imobilização dos microrganismos aparecem colónia, o que irá
alterar as condições dos substratos, nomeadamente, irá haver uma acumulação de
metabolitos finais ácidos e, portanto, uma acidificação em torno das colónias. É
concebível que, então, as células de agentes patogénicos em colónias nas matrizes
alimentares possam sofrer de uma tolerância ácida induzida estimulada pelo pH
localizado que desceu devido aos processos metabólicos da própria colónia.
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No centro da colónia há acumulação da produtos tóxicos e ácidos que
diminuem o pH do meio, o que vai induzir um mecanismo de proteção que vai fazer
com que as células fisiologicamente “mais velhas” adquiram resistência aos diversos
fatores, ao contrário das células da periferia mais jovens.
Validação dos modelos
Um dos aspetos mais importantes em microbiologia preditiva é
assegurar que as predições demonstradas pelo modelo são aplicáveis a
situações reais, ou seja, passar por um processo de validação, o qual deve incluir
comparações com medidas observadas que devem ser diferentes dos dados usados
para construir o modelo original, porém normalmente há problemas financeiros e
então a validação costuma ser feita com comparações com outros modelos já feitos.
Um modelo validado deve ser consistentemente “à prova de falhas”, ou seja,
as previsões devem falhar do lado da segurança, isto porque os modelos são feitos
por sobrecestimativa (a taxa de crescimento prevista e o tempo de latência devem
ser mais rápidos e mais curtos, respetivamente, do que os valores experimentais).
Apesar disto, é raro encontrar um modelo desenvolvido em cultura que prevê
precisamente o comportamento dos alimentos, sendo que o uso de estirpes que
crescem mais rápido para garantir uma margem de segurança maior. A alternativa
é desenvolver modelos diretamente de produtos alimentares – o problema é que são
precisas instalações apropriadas para incorporação de patogénicos no processo.
Aplicações informáticas em microbiologia preditiva
Há já algumas plataformas que servem para modelar respostas de
microrganismos a diversos fatores ambientais:
 ComBase – base de dados de livre acesso de respostas microbianas
quantificadas em diversos ambientes alimentares; baseados apenas em
resultados observados em experiências laboratoriais sob condições
estritamente controladas.
 Pathogen Modelling Program (PMP) – pacote de modelos que pode ser
usado para prever o crescimento/inativação de bactérias transmitidas por
alimentos, principalmente patogénicas, sob várias condições ambientais.
pH 7 (fora da colónia)
pH 4 (centro da colónia)
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Preservação de alimentos
A preservação de alimentos engloba todas as medidas tomadas para manter
os alimentos com as propriedades desejadas ou a própria natureza inerente ao
alimento tanto quanto possível; técnicas milenares de preservação foram a
secagem, fumeiro, refrigeração e aquecimento. O trabalho de Pasteur no séc.
dezanove foi um marco importante pois deu-nos um melhor entendimento sobre o
funcionamento das técnicas já usadas como aquecimento, congelamento, etc.
Nos dias que correm, os consumidores estão mais interessados em alimentos
com pouco processamento e menos uso de químicos como aditivos; processos como
o fumeiro têm sido alvo de estudos que suspeitam que seja cancerígeno (há 400
químicos voláteis que não se conseguem controlar e que têm um efeito acumulativo
no nosso sistema), outros como a irradiação já foram demonstrados como seguros
e positivos no que toca à eliminação de alguns microrganismos, porém, a maioria
dos consumidores suspeita destas técnicas.

Métodos de preservação começam
com uma análise completa da cadeia
onde se encontra o alimento, desde a sua
plantação, colheita, embalamento e
distribuição; é importante saber quais as
características ou propriedades que sã
necessárias manter para que o produto
seja viável, sendo que não são lineares
para todos, uma propriedade pode ser
positiva para um produto e negativa para
outro. Por exemplo, o consumidor espera
que o sumo de maça seja claro, enquanto
que o de laranja seja turvo.

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34
Depois de algum tempo em armazenamento, as características
organolépticas dos alimentos vão mudando, consoante o seu tempo de vida útil
(“consumir de preferência antes de” está relacionado com a qualidade alimentar
(pode ser consumido depois da data mas poderá não estar nas suas melhores
condições) vs. “consumir até” está relacionado com a segurança alimentar). Os
fatores de risco são também diferentes consoante o tipo de consumidor que o
produto visa atrair, p.e, crianças, mulheres grávidas e idosos são mais vulneráveis e
podem sofrer consequências graves e fatais.
Em todos os casos, o fator mais importante é a segurança e só depois a qualidade.

Causas de deterioração
Os alimentos sofrem deterioração mecânica, física, química e microbiológica,
podendo começar logo desde o ponto inicial como com o manuseio inadequado
durante a colheita, o processamento e a distribuição, o que leva a uma possível
redução do tempo de vida útil. Antes da colheita, p.e, frutas e vegetais têm
mecanismos antimicrobianos que evitam esse tipo de contaminação, porém, após a
separação da planta podem facilmente sucumbir a uma proliferação microbiana;
frutas depois de cortadas tendem a ficar castanhas à temperatura ambiente devido
à reação da enzima fenolase com o oxigénio.
Técnicas de preservação alimentar
Baseados no modo de ação, as técnicas de preservação podem ser
categorizadas em:
1. Inibição ou redução do crescimento de contaminantes e de agentes
químicos – métodos que se encontram relacionados com fatores
ambientais, p.e controlo da temperatura,
e fatores intrínsecos como
controlo através do ajuste da aw ou do valor de pH; como a zona de
perigo para o crescimento microbiano é entre 5 °C e 60 °C, o método
mais popular é o resfriamento e congelação.
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2. Inativação direta das bactérias, leveduras, fungos e enzimas – pode ser
feito através do calor, porém existem problemas com esta técnica, já que
as características organolépticas dos alimentos mudam e pode haver
depleção nutricional; pode também ser usado eletrecidade, altas
pressões, radiação e campos magnéticos.
3. Redução da contaminação antes e depois do processamento – medidas
como introdução de embalagens previnem a recontaminação, tendo 3
funções: controlam as condições ambientais, logo, melhoram o tempo de
vida útil do produto, parecem mais atraentes aos consumidores por
estarem mais seguros e não há possibilidade de ser contaminado durante
o “caminho” até casa;
Os métodos de preservação variam conforme a origem dos produtos, se
forem de origem vegetal inclui tratamentos de controlo de atmosfera, como a
humidade, concentração de certos gases e temperatura logo após a colheita, depois
tratamentos físicos como pré-resfriamento, limpeza e enceramento, entre outros; já
nos de origem animal como a carne, a qualidade é condicionada pelas condições de
abate e stress antes da morte.

A temperatura máxima para o
crescimento microbiano é mais 60 ᵒC, a zona
de perigo extende-se desde os 5 ᵒC até aos
60 ᵒC, na qual as condições são favoráveis
para o desenvolvimento microbiano, entre os
5 ᵒ C e os 0 ᵒ C crescem a um ritmo muito lento,
abaixo disso não conseguem crescer e ficam
dormentes.

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Esterilização
Consiste na completa destruição e eliminação de todos os
microrganismos tanto na forma vegetativa como na forma esporulada (p.e: Bacillus
e Clostridium Botulinum) e permite a distribuição dos produtos que passam por isto
a temperaturas ambientes, ou seja, há uma extensão do tempo útil de vida do
produto. Envolve procedimentos como o uso de calor, radiação ou químicos ou
remoção física das células – 4 fases:
1. Produto é aquecido a temperaturas de 110 ᵒC-125 ᵒC para
assegurar a esterilização;
2. Alguns minutos para o produto se equilibrar já que a superfície vai
estar mais quente que a parte central (reduz o gradiente de
temperatura);
3. O produto tem de ser mantido a essa temperatura por um certo
período de tempo pra assegurar uma esterilazação pré-
determinada F0;
4. O produto tem de ser arrefecido principalmente para interromper
o tratamento térmico e evitar o cozimento excessivo.
Ou seja, acontecem mudanças nas características organolépticas do alimento
como perda de aminoácidos importantes e alterações a nível de vitaminas que ficam
inativas devido ao calor, o que são pontos negativos, porém há uma inibição da
atividade enzimática. É praticamente haver uma esterilização completa pois irá
sempre levar a uma deterioração da qualidade e dos nutrientes do produto.
Os principais tipos de bactérias preocupantes na conservação de alimentos
são os organismos de importância para a saúde pública e bactérias causadoras de
deterioração. P.e em comidas com pH maior que 4.6 o Clostridium Botulinum é de
grande importância, não sendo possível eliminar a ameaça a 100%.
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Quanto às vitaminas, as C e B (hidrossolúveis) são severamente afetadas
pelo calor excessivo pois, como já foi referido, o calor faz com que haja inativação
enzimática e de agentes aglutinantes – a vitamina C é a mais suscetível a ser perdida,
tanto pelo calor como pelo simples armazenamento de produtos, confeção da
comida, lavagem, etc; a tiamina (B1) é a mais sensível ao calor, especialmente em
condições alcalinas.

Pasteurização
Consiste num processo térmico mais suave que melhora a qualidade de
“manutenção” do produto, funcionando pela inativação enzimática e destruição
da maioria dos organismos patogénicos, não fazendo grandes alterações a nível
das propriedades do alimento em si, ou seja, é usada para aumentar o tempo útil de
vida do produto, porém não vai para além de alguns dias ou semanas a mais. A
severidade do tratamento depende do pH do produto, acima de 4.5 é para destruir
bactérias patogénicas e abaixo disso é para destruir microrganismos deteriorantes
ou inativação de enzimas.
Em sumos, normalmente com um pH baixo (pH > 4.5), existem enzimas como
catalases, peroxidases, polifenol oxidase, etc, bem como organismos deteriorantes e
se não forem desativadas estas enzimas irão causar mudanças indesejáveis,
especialmente a peroxidase que possui uma resistência maior que os
microrganismos deteriorantes.

No leite há uma perda de 5% do
“protein serum” e pequenas mudanças
quanto ao conteúdo vitamínico.

A maioria dos produtos pasteurizados têm um pH natural baixo ou porque já
é naturalmente assim ou porque o produto foi fermentado de modo a produzir uma
ambiente ácido, assim, como a maioria dos nutrientes termolábeis (têm pouca
resistência ao calor) são relativamente estáveis em condições ácidas, perdas nestes
alimentos são poucas. Apesar das perdas térmicas em produtos aquando da
pasteurização serem poucas, as perdas oxidativas podem ser altas (negativo
para frutas e assim).

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Congelação
O congelamento de alimentos retarda mas não pára as reações físico-
químicas e bioquímicas que regem a deterioração dos mesmos; aquando do
armazenamento há mudanças lentas na qualidade organoléptica do produto. A
qualidade de um produto congelado depende muito da temperatura, do tempo que
fica lá e do processo de descongelamento (após -18 ᵒC todos os microrganismos
param de crescer e mudanças enzimáticas e não enzimáticas continuam a um ritmo
muito menor). Faz também com que 10% a 60% da população microbiana viável
morra, uma percentagem que vai aumentando durante o tempo de armazenamento.
Durante o congelamento a matriz do alimento sofre mudanças, apesar de
lentas, as células sofrem danos osmóticos, danos causados pelo soluto e danos
estruturais. O que acontece é que se houver tempo suficiente a água presente nas
células migra para fora devido à pressão osmótica causada pelo gelo, o que causa um
encolhimento das mesmas e alguns danos a nível da membrana; essa água não volta
às células quando são descongelados devido ao dano membranar, o que resulta em
perdas de água.
Em geral, as bactérias gram negativo são menos resistentes à morte por
congelamento que as bactérias gram positivo; bactérias esporulantes como o
Clostridium e o Bacillus não são afetadas por este processo; a Listeria monocytogenes
também sobrevive bem a baixas temperaturas.

Atividade de água (Aw)
A atividade de água pode ser
reduzida ou controlada por várias
métodos como separação da água ou
adição de solutos como sal a carnes e
peixes ou açúcar a frutas, pode ser por
secagem, “concentration” e
desidratação por centrifiguração.
No caso de soluções hipertónicas, as células encolhem, enquanto que em
soluções hipotónicas elas expandem, assim, uma diminuição de aw no ambiente
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aumenta o stress osmótico das células microbianas pois o objetivo da célula é
sempre manter uma osmolalidade interna ligeiramente menor, o que causa um
influxo de água na célula, sendo que é o rompimento desse processo por solutos que
levam ao dano
celular e à morte.
Reações catalisadas por enzimas conseguem prosseguir em alimentos com
uma aw relativamente baixa, sendo que a taxa de hidrólise aumenta com o aumento
da aw, com a reação sendo extremamente lenta em aw muito baixa e, para cada valor
de aw, parece haver um grau máximo de hidrólise que também aumenta com o teor
de água.

Notas: na aula foi referido a fitase que é uma enzima
que degrada fitatos (sais de ácido fítico) que têm a
habilidade de formar quelantes com iões divalentes
(p.e, cálcio e magnésio), formando complexos
solúveis resistentes à ação no trato intestinal –
diminuem a biodisponibilidade desses minerais.
A desfoforilação do ácido fítico é um pré-requisito
para a melhoria nutricional já que aumenta a
biodisponibilidade dos nutrientes, isto faze-se
através de processos como a demolha e germinação.
A fitase está presente naturalmente em plantas e
microrganismos.

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Redução de água (fumeiro)
O fumeiro, ou seja, o uso do fumo de madeiras, é uma das técnicas de
preservação mais antigas, apesar de não ter sido usado primeiramente para reduzir
a humidade nos alimentos, o calor associada à geração de fumo causa um efeito de
secagem. O principal objetivo do fumeiro são os sabores e cores desejáveis, sendo
que alguns componentes formados durante isso têm um efeito conservante
(bactericida e antioxidante), sendo que foi descoberto que é eficaz na prevenção
de oxidação lipídica em carnes e peixes.
Porém possui várias desvantagens como o facto de ser um processo lento e
não é fácil de controlar, sendo que mais de 400 compostos voláteis foram já
identificados como óxidos de azoto, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos,
compostos fenólicos, compostos de alcatrã, etc, sendo que têm efeitos nefastos na
saúde humano e são acumulativos, especialmente em condições não controladas,
logo, é importante controlar as condições de processamento e padronizá-las.

pH (fermentação)
A fermentação consiste no processo em que microrganismos mudam as
propriedades funcionais e sensoriais de alimentos e prolongam o seu tempo de vida
útil, juntamente com a salga, cozimento e secagem (inclui fumeiro), esta é uma das
práticas mais antigas. Como é um método que envolve procedimentos simples e que
pede equipamentos básicos, tem atualmente mais importância em países em
desenvolvimento e comunidades rurais.
É uma mistura de 3 princípios:
1. Minimizar os níveis de
contaminação microbiana
na comida, especialmente
em fontes de alto risco;
2. Inibir o crescimento da
microflora contaminante;
3. Matar os microrganismos
contaminantes.

O princípio básico da fermentação assenta na manipulação dos fatores
extrínsecos de modo a selecionar o tipo de microrganismos que fornecerão
certos sabores, odores, textura ou aparência aos alimentos.
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O uso das ácido lático na indústria alimentar é principalmente como
conservante, acidulante ou condicionador de massa, a maioria das bactérias do
ácido lático (LAB), tirando alguns streptococcus, são inofensivas para os humanos,
ou seja, tornaram-se nos agentes ideias de conservação. Estas bactérias vão ser
referidas mais à frente em pormenor.
Bacteriocinas são péptideos bactericidas ou proteínas, geralmente são
inibidoras para espécies intimamente relacionadas ao produtor – nisina, tactococina
e pediocina são alguns exemplos de bacteriocinas produzidas pelas LAB. A nisina é
usada contra bactérias gram-positivas, incluindo o Clostridium botulinum (diminui
o crescimento dos esporos), especialmente em alimentos processados por calor; não
faz nada a gram negativas, leveduras ou fungos.

Filtração
A filtração é usada na indústria alimentar maioritariamente para a
clarificação de sumos e concentração de sumos e de produtos lácteos; os sumos
clarificados podem ter maior qualidade e estabilidade, enquanto que bebidas
concentradas são desejáveis para transporte e armazenamento. As operações
unitárias usadas vão desde peneiramento até osmose reversa.
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A escolha da membrana usada na clarificação do sumo depende do tipo de
sumo e das propriedades desejadas do sumo clarificado, os fatores incluem a sua
configuração, o material e corte do peso molecular. Já a escolha do material da
membrana está relacionada com a resistência à pressão do sumo, resistância à
temperatura, resistência ao pH e compatibilidade química; são também importantes
a durabilidade e custo, p.e, membranas poliméricas duram pelo menos 1 ano,
enquanto que membranas cerâmicas duram pelo menos 5 a 7 anos com uso
contínuo.

Radições ionizantes e não-ionizantes
A radiação UV é conhecida pelas suas propriedas antibacterianas (incluindo
luz solar), devido à sua baixa profundidade de penetração é usado principalmente
para esterilizar ar e filmes finos de líquido, sendo que na indústria é usado em
superfícies; quando usado em quantidades elevadas tem uma tendência em
deteriorar o aroma e o sabor dos alimentos antes que a esterilização seja atingida.
Este tipo de energia tem a vantagem de ser segura, amiga do ambiente e mais
rentável economicamente. As principais aplicações são a desinfeção, a extensão
da vida útil do produto e a melhoria da qualidade do produto.
Há uma desconfiança grande por parte dos consumidores, a maior parte por
não estarem informados sobre o que realmente, logo, é difícil entrar no mercado
Notas: o desenvolvimento da membrana Polisulfona Fresenius®
baseou-se no funcionamento do rim biológico, providenciando um
vasto leque de desempenhos para todas as terapias de hemodiálise.”

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com produtos em que tenham sido usados estes tipos de meios. O
símbolo universal para produtos que tenham tido algum contacto
com radiação é este ao lado e é obrigatório estar presente nesses
produtos.
A ionização interage com o
material e ioniza as suas moléculas
criando iões negativos e positivos
transferindo energia nos eletrões,
tendo efeito direto e indireto. A
radiação usada pode ser Cobalt-60
(elevado poder de penetração – não
há um interruptor, tem de ser usada
com cuidado), feixes de eletrões
(usados em refrigeração) e raios-x
(baixa eficiência).

As vantagens deste processo
de conservação são:
 Minimização de perdas alimentares – pode reduzir a perda em
produtos frescos, sendo que as perdas pós-colheita devido à
infestação de insetos pode ser controlada e minimizada pela
irradiação de alimentos como grãos, leguminosas, tubérculos e frutas;
 Melhoramento da saúde pública – muitos alimentos estão
contaminados por patogénicos e parasitas e a descontaminação
dessas por irradiação poderá ser uma mais valia para a saúde pública;
 Aumentar o comércio internacional – muitos produtos são
descartados no comércio internacional por motivos como infestação
de insetos, microrganismos ou pelo seu tempo de vida útil;
 Alternativa para a fumegação de alimentos – vários químicos são
usados para fumegar alimentos para desinfeção, porém estão em
declínio devido à sua natureza tóxica e o impacto ambiental;
 Diminuição do consumo de energia – quando comparado ao gasto
de energia que é gasto em conservas, refrigeração ou congelados, a
irradiação gasta muito menos, p.e, a energia gasta para refrigerar um
frango é de 17,760 kJ/kg,