QBQ3401 - Biologia Molecular

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Universidade de São Paulo 
 Instituto de Química 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Biologia Molecular – QBQ3401 
Química-Noturno 
2009 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Professora: 
Nadja Cristhina de Souza Pinto 
 
Monitores: 
Carolina Domeniche Romagna 
Débora da Silva Freitas 
 
 
 
 
 
QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 
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QBQ-3401 
Biologia Molecular 
Química-Noturno - 2009 
 
DOCENTE RESPONSÁVEL: 
Prof. Nadja Cristhina de Souza Pinto (sala 1065 − Bloco 10 superior) 
 
MONITORES: 
Carolina D. Romagna (sala 1065 – Bloco 10 superior) 
Débora da Silva Freitas (sala – Bloco 
 
HORÁRIO E SALAS: 
Aulas Expositivas e Exercícios (Discussão): 6as feiras das 19 às 22:40h - Sala 10 - Bloco 6 inferior 
Aulas Práticas: 6as feiras das 19 às 22:40h - Laboratório Didático - Bloco 7 superior 
 
ORGANIZAÇÃO DO CURSO: 
 O Curso envolve aulas expositivas, períodos para resolução e discussão de exercícios e aulas práticas. 
Utilizando as informações das aulas expositivas e a bibliografia recomendada, os alunos deverão resolver os 
exercícios e entregar as resoluções à professora. Os exercícios serão discutidos em sala de aula com 
acompanhamento da professora e das monitoras. 
 
 Nas aulas práticas serão realizadas experiências que envolvem algumas técnicas básicas utilizadas em 
Biologia Molecular. Os alunos serão divididos em grupos e cada grupo deverá apresentar um RELATÓRIO 
contendo os resultados obtidos e a resolução das questões correspondentes. Só serão aceitos relatórios de 
alunos que realizaram as aulas práticas. POR RAZÕES DE SEGURANÇA, O USO DO AVENTAL NAS 
AULAS PRÁTICAS É OBRIGATÓRIO. 
 
AVALIAÇÃO: 
 A avaliação será feita através da média ponderada das notas obtidas nas duas provas (P1, P2), nos 
quatro relatórios (R) e nos exercícios (E), de acordo com a fórmula abaixo: 
 
Nota final= (P1 x 2) + (P2 x 2) + (média dos 4 relatórios)+ (média dos exercícios) 
 6 
 
A matéria das provas será CUMULATIVA. No final do curso, será oferecida uma prova substitutiva para 
alunos que tenham sido impossibilitados de fazer uma das provas por motivo de doença, que incluirá toda a 
matéria do curso. Um atestado médico deverá ser entregue neste caso. O peso da prova substitutiva será igual 
ao da prova perdida. 
 
 
Os alunos que não atingirem Nota Final ≥ 5,0, porém atingirem ≥ 3,0 e 75% de frequência poderão realizar a 
prova de recuperação, que será administrada em fevereiro 2010. 
 
A FREQUÊNCIA OBRIGATÓRIA MINÍMA ÀS AULAS É DE 75%. 
 
 
 
 
 
 
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CRONOGRAMA QBQ-3401 
 
21/8 Aula1 - Introdução à Biologia Molecular. Estrutura e Função dos Ácidos 
Nucléicos. Exercício 1 
28/8 Aula 2 - Replicação do DNA. Exercício 2 
04/9 Experiência 1: Extração de DNA de E. coli 
11/9 Aula 3 - Mutação e Reparo de DNA. Exercício 3 
18/09 Aula 4 - Estrutura gênica e Transcrição. Exercício 4 
25/09 Experiência 2: Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para detecção 
de genes 
02/10 Aula 5 - Código Genético. Exercício 5 
09/10 Prova 1 
16/10 Aula 6 - Processamento do RNA e Tradução/Síntese de Proteínas. 
Exercício 6 
23/10 Aula 7 - Regulação da Expressão Gênica. Exercício 7 
30/10 Experiência 3: Transformação de bactérias com plasmídeos 
06/11 Aula 8 - Transdução de Sinal e Câncer. Exercício 8 
13/11 Aula 9 - Tecnologia do DNA recombinante. Exercício 9 
20/11 CONSCIÊNCIA NEGRA– Não haverá aula 
27/11 Experiência 4: Indução de Beta-galactosidase com IPTG 
04/12 Prova 2 
11/12 Prova substitutiva 
 
 
 
BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA: 
 
Inglês: 
• Biochemistry - D. Voet & J.G. Voet - John Wiley & Sons – 3rd edition. 2004. 
• Biochemistry – J. M. Berg, J.L. Tymoczko & L. Stryer. W.H.Freeman – 6th edition - 2006. 
• Genes IX – Lewis, B. Jones & Bartlett Publishers; 9th edition. 2007 
• Lehninger Principles of Biochemistry - D.L. Nelson & M.M. Cox. Worth Publishers 4th edition – 2004. 
• Molecular Biology of the Gene. James D. Watson, Nancy H. Hopkins, Jeffrey W. Roberts, Joan 
Argetsinger Steitz ,Alan M. Weiner. 5th Edition - 2003 
 
Português: 
• Bases Moleculares da Biotecnologia. A.H.Ulrich, W. Coli; P.L.Ho;M. Faria;C.A. Trujillo. Editora Roca.1° 
Edição. 2008 
• Biologia Molecular Básica – A. Zaha. Editora Mercado Aberto. - 3a edição. 2003 
• Biologia Molecular do Gene. James D. Watson, Nancy H. Hopkins, Jeffrey W. Roberts, Joan Argetsinger 
Steitz ,Alan M. Weiner. Editora Artmed. 5a edição. 2006 
• Bioquímica - L. Stryer - Editora Guanabara Koogan - 5a edição. - 2004. 
• Fundamentos de Bioquímica – D. Voet, J. G. Voet & C. W. Pratt – Editora Artmed. 3a edição. 2006. 
• Princípios de Bioquímica - A.L. Lehninger, D.L. Nelson & M.M. Cox. Editora Sarvier -4a edição. 2007. 
 
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Exercícios 
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Exercício 1. Estrutura e Função dos Ácidos Nucleicos 
 
1.Quais as diferenças de composição e estrutura entre RNA e DNA. Como se distingue entre uracila e 
timina, e entre ribose e desoxirribose? 
 
2. RNA é facilmente hidrolizado por álcali, enquanto DNA não o é. Por que? 
 
3.Escreva a seqüência de bases da fita complementar do DNA dupla fita que apresenta uma fita com a 
seqüência: 
(5') ATGCCGTATGCATTGCATTC (3') 
Exprima, em porcentagem, a composição de bases do DNA de fita dupla. 
 
 
4. Uma molécula de ácido nucleico tem a composição de bases abaixo. O que você pode afirmar sobre 
esta molécula? 
 
C = 24,1% G = 18,5% T = 24,6% A = 32,8% 
 
5. Explique por que ácidos nucleicos são desnaturados quando submetidos a alta temperatura ou pHs 
extremos? Uma molécula de DNA desnaturada por aquecimento pode ser renaturada? Como? 
 
 
6. O valor de Tm para o DNA pode ser calculado usando-se a fórmula: 
Tm = 69,3 + 0,41(%GC), onde GC é a porcentagem de Guanina + Citosina 
 
a) DNA de E. coli contém 50% GC. Calcular o Tm para o DNA desta bactéria. 
b) As curvas de fusão da maioria dos DNAs que ocorrem naturalmente revelam que o Tm é 
normalmente maior do que 65oC. Por que isto é importante para a maioria dos organismos? 
c) Como varia o Tm com a força iônica da solução? 
d) O que acontece com Tm quando se adiciona etanol à solução de DNA? 
 
 
7. Quais das seguintes afirmações sobre o DNA isolado de um cromossomo eucariótico são corretas? 
- É resistente à quebra durante a extração por seu grande tamanho. 
- É linear e não ramificado 
- É uma molécula única 
- Pode ter tamanho superior a 100 Mb 
 
8. O núcleo de uma célula humana tem 6µm de diâmetro e a extensão total do DNA dos seus 46 
cromossomos soma 1,8m. Como é resolvida a discrepância entre estas duas grandezas? 
 
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Exercício 2. Replicação do DNA 
 
1. Combine as características da coluna da direita com o tipo de hélice do DNA da coluna da esquerda 
 
 (a) A-DNA (1) As pirimidinas estão na configuração anti 
 (b) B DNA (2) Os fosfatos na cadeia estão em ziguezague 
 (c) Z-DNA (3) A sua formação é favorecida por superenovelamento negativo 
 (4) Apresenta um sulco maior relativamente largo e profundo 
 (5) Apresenta uma estrutura helicoidal no sentido dextrógiro 
 (6) Tem 10,4 pares de bases por volta 
 (7) Tem a estrutura similar àquela do RNA de fita dupla 
 (8) As fitas na hélice são anti-paralelas 
 
2. Descreva o experimento de Meselson-Stahl. Qual seria o resultado deste experimento se a replicação 
do DNA fosse conservativa? 
 
3. Combine as propriedades ou funções na colunaà direita com a DNA polimerase na coluna da 
esquerda: 
(a) DNA polimerase I (1) envolvida na replicação 
(b) DNA polimerase II (2) requer um iniciador e um molde 
(c) DNA polimerase III (3) envolvida no reparo de DNA 
 (4) sintetiza a maior parte do DNA durante a replicação 
 (5) remove o iniciador e preenche as lacunas durante a replicação 
 
 
 
4. O fragmento de DNA no esquema abaixo é de fita dupla em ambas as extremidades, porém de fita 
simples no meio. As extremidades da fita superior estão indicadas. 
 
 5'____________________________3' 
 __________P HO_________ 
 
a) O fosfato (P) indicado na fita inferior está na extremidade 5' ou 3' do fragmento ao qual ele pertence 
? (Indique no esquema). 
b) Como você esperaria que a lacuna fosse preenchida pelos processos de reparo do DNA "in vivo" ? 
c) Quantos fragmentos você esperaria encontrar na fita inferior se o experimento fosse realizado "in 
vitro", na presença de todos os desoxirribonucleotídeos-trifosfato e DNA polimerase, mas na ausência 
de DNA ligase? 
 
5. Explique porque certas variedades mutantes da DNA polimerase I podem apresentar atividade de 
DNA polimerase praticamente ausente, mas podem ter atividade de exonuclease 5' → 3' praticamente 
normal. 
 
 
6. Qual a atividade da DNA polimerase III que é responsável pela editoração durante a replicação? Por 
que essa atividade é importante? 
 
7. Que propriedades do DNA e da DNA polimerase sugerem que a duas fitas não podem ser replicadas 
pelo crescimento no mesmo sentido (como mostra a figura abaixo)? Como a célula supera o problema? 
Esquematize a formação da ligação fosfodiester durante a replicação a partir do nucleotídeo trifosfato 
livre, mostrando o grupo fosfato que é incorporado. 
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8. A técnica de PCR (polymerase chain reaction) é utilizada para obter grandes quantidades de DNA a 
partir de amostras contendo quantidades ínfimas de DNA. 
a) Descreva os passos envolvidos nesta técnica. 
b) Quais as características da DNA polimerase utilizada? Porque essas características são fundamentais 
ao desenvolvimento dessa técnica? 
c) Exemplifique aplicações desta técnica. 
 
 
 
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Exercício 3. Mutação e Reparo do DNA 
 
1. Quais os principais tipos de reparo de excisão e qual a especificidade de lesões de cada via? 
 
2. Descreva brevemente as etapas de reparo do DNA lesado por luz UV e as enzimas nelas envolvidas. 
 
3. Como os dímeros de timina podem ser diretamente removidos do DNA? 
 
4. Como a maquinaria de reparo de E. coli identifica a fita de DNA que tem um nucleotídeo não 
complementar incorporado durante a replicação? 
 
5. Bromouracila é um mutagênico que produz troca de bases, enquanto acridina causa adições ou 
deleções de uma base no DNA. Mutações causadas por acridina frequentemente podem ser 
compensadas por mutações secundárias, distantes vários nucleotídeos da primeira mutação, enquanto 
aquelas causadas por bromouracila geralmente requerem mudanças dentro do mesmo codon. Explique. 
 
6. Explique como algumas cepas da bactéria Salmonella são usadas para detectar substâncias 
carcinogênicas. Por que extrato de fígado de mamífero está envolvido no teste? 
 
7. Que propriedade da DNA polimerase I é responsável pela observação de que bactérias mutantes 
polA1 são mais sensíveis à luz ultravioleta ? Explique. 
 
8. Por que a taxa de mutacao observada em E.coli é de 10-8 a 10-10 / par de bases replicado, apesar das 
taxas de erro da Pol I e Pol III serem de 10-6 a 10-7 /par de bases replicado?
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Exercício 4. Estrutura gênica e Transcrição 
 
1. Genes de eucariotos são geralmente constituídos de introns e exons. Estas seqüências são tanto 
transcritas como traduzidas? A remoção dos íntrons (splicing) tem que ser um processo extremamente 
preciso. Por que? Dê um exemplo de "splicing" aberrante que leva a um tipo de talassemia em 
humanos. 
 
2. As DNA polimerases necessitam de um iniciador, ao qual se liga um novo nucleotídeo para o 
crescimento da cadeia polinucleotídica. É necessário um iniciador para a ação da RNA polimerase? 
 
3. Que subunidades da RNA polimerase bacteriana são necessárias para a iniciação da transcrição a 
partir de um promotor? E para a terminação da transcrição? Explique como uma mutação poderia dar 
origem a uma E. coli resistente ao antibiótico rifamicina. 
 
4. A seguinte fita simples de DNA vai se transcrita in vitro: 
 
 5'- ATGTACCGAAGTGGTTT - 3' 
 
Coloque os grupos fosfato e um asterisco naqueles que serão radiativos quando a transcrição for feita 
na presença de [γ 32P]-ATP 
(a?) 
b) Faça o mesmo para [α32P]-UTP 
 
5. Defina "promotor", enumere as suas propriedades e diga como podem ser localizados através da 
técnica de "footprinting". 
 
6. Combine as descrições na coluna da direita com a RNA pol DNA-dependente eucariótica 
apropriada: 
a) RNA pol I (1) localizada no nucléolo 
 (2) localizada no nucleoplasma 
 (3) sintetiza hnRNA 
b) RNA pol II (4) sintetiza tRNA 
 (5) sintetiza rRNA 
(6) sintetiza precursores do rRNA 
c) RNA pol III (7) inibida por α-amanitina 
 (8) sintetiza RNA na direção 5'-3' 
 (9) composta de várias subunidades 
 
7. Você usaria num paciente, como agente terapêutico anti-bacteriano, qual destes antibióticos: a) 
rifamicina ou b) actinomicina D ? Justifique a sua escolha. 
 
8. Quais as principais características das seqüências de promotores de genes eucarióticos transcritos em 
mRNAs? Qual a função dos fatores de transcrição e “enhancers”? 
 
 
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Exercício 5: O Código Genético 
 
1. No desenho abaixo, da esquerda para a direita, indique as pontas 5' e 3' em cada uma das fitas. Selecione 
uma das opções abaixo e explique o porquê de suas escolhas: 
 
fita codificadora de DNA 
___________________________________________________ 
 
fita complementar ou fita molde de DNA 
___________________________________________________ 
 
fita de mRNA 
___________________________________________________ 
 
fita de tRNA (anticódon para Metionina) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2. Faça um x no ácido nucleico (pode ser mais de um) que corresponde aos conceitos abaixo: 
 
código genético ( ) DNA ( ) mRNA ( ) rRNA ( ) tRNA 
códon ( ) DNA ( ) mRNA ( ) rRNA ( ) tRNA 
anti-códon ( ) DNA ( ) mRNA ( ) rRNA ( ) tRNA 
moldura de leitura ( ) DNA ( ) mRNA ( ) rRNA ( ) tRNA 
 
3. Baseando-se na lista de códons e amino ácidos abaixo, quais das seguintes afirmações são corretas? 
AGU = serina 
AGC = serina 
AAG = lisina 
AAA = lisina 
AUG = metionina 
AUA = isoleucina 
a) O código genético é degenerado 
b) A alteração de um único nucleotídeo no DNA que dirige a síntese destes códons poderia levar à 
substituição de uma isoleucina por uma lisina no polipeptídeo. 
c) A alteração de um único nucleotídeo no DNA que dirige a síntese destes códons necessariamente levaria 
à substituição de um aminoácido no polipeptídeo codificado. 
 
4. Um tRNA com o anticódon ACU se ligaria a um ribossomo na presença de um dos códons da questão 3. 
Qual? Olhando a tabela ao final deste exercício faça a previsão do anti-códon para terminação da tradução 
e a seqüência das bases correspondentes no DNA codificador . 
 
5. Uma globina de 146 aminoácidos sofreu uma mutação no códon correspondente ao sexto aminoácido da 
cadeia (ver tabela ao final do exercício). A análise do DNA indicou uma mudança de TTC para TAC na 
fita molde. Pergunta- se: 
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a) A mutação provocou a troca de um aminoácido por outro? Em caso afirmativo, quais são estes 
aminoácidos?b) Quais as implicações para a estrutura da proteína? 
 
6. Uma fita de um fragmento de DNA isolado de E. coli tem a seguinte sequência 
5'...AGGTTACCTAGTTGC...3' 
Qual é a sequência do polipeptídeo que seria codificado pelo mRNA sintetizado na questão 3 (não 
intendi!). Assuma que o quadro de leitura começa com o primeiro nucleotídeo. 
 
7. Abaixo está anotado o gene completo da insulina como se encontra no Banco de dados NCBI. Para 
facilitar a leitura e a contagem, há um número que denota a primeira base da fila e as bases estão separadas 
por um espaço colocado a cada 10 bases. O códon de iniciação e o códon de terminação estão sublinhados 
e em negrito. Qual o número de aminoácidos na proteína resultante da transcrição desta seqüência? 
Explique porque. 
 
1 gctgcatcag aagaggccat caagcacatc actgtccttc tgccatggcc ctgtggatgc 
61 gcctcctgcc cctgctggcg ctgctggccc tctggggacc tgacccagcc gcagcctttg 
121 tgaaccaaca cctgtgcggc tcacacctgg tggaagctct ctacctagtg tgcggggaac 
181 gaggcttctt ctacacaccc aagacccgcc gggaggcaga ggacctgcag gtggggcagg 
241 tggagctggg cgggggccct ggtgcaggca gcctgcagcc cttggccctg gaggggtccc 
301 tgcagaagcg tggcattgtg gaacaatgct gtaccagcat ctgctccctc taccagctgg 
361 agaactactg caactagacg cagcccgcag gcagcccccc acccgccgcc tcctgcaccg 
421 agagagatgg aataaagccc ttgaaccagc 
 
8. O gene de uma proteína, cuja seqüência parcial está indicada abaixo, sofreu uma série de mutações 
pontuais independentes, o que levará à produção de diferentes RNAs mensageiros, Indique a seqüência de 
aminoácidos do peptídeo correspondente (a tabela se encontra no fim dos exercícios) e explique a 
conseqüência do tipo de mutação que ocorreu em cada um dos RNAs resultantes. 
 
5'UUCACACAGGAAACAGCUAUGCGAAGCGUGGCUUGUAACU....3' 
(a) 5'UUCACACAGGAAACAGCUAUGCGAAGCGGGGCUUGUAACU....3' 
(b) 5'UUCACACAGGAAACAGCUAUGCGAAGCAUGGCUUGUAACU.....3' 
(c) 5'UUCACACAGGAAACAGCUAUGCGAAGCGUCGCUGUAUACU......3' 
(d) 5'UUCACACAGGAAACAGCUAUGCGAAGCGUUGGCUUGUAACU....3' 
 
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Exercícios 6. Síntese de proteínas 
 
 
1. Considere a seguinte sequência de um fragmento de DNA isolado de bactéria: 
5'CTGATAAGGGATTTAAATTATGTGTCAATCACGAATGCTAATCGCTTAACACTTC 3' 
 
a) Assumindo que esta seqüência corresponde à seqüência da fita codificadora, qual seria a seqüência 
de aminoácidos do polipeptídeo produzido quando um mRNA transcrito deste gene for traduzido? Que 
características na seqüência do mRNA determinam qual é o códon iniciador? Considere a primeira 
base como o início da transcrição. 
 
b) De acordo com o princípio de oscilação no pareamento de bases ("wobble"), qual o número mínimo 
de tRNAs necessário para decodificar os seis códons de leucina - UUA, UUG, CUU, CUC, CUA e 
CUG ? Explique. 
 
2. Num sistema de síntese de proteínas in vitro, que permita o início e término da síntese em qualquer 
seqüência de RNA, que peptídeo seria produzido pelo poli-ribonucleotídeo 5'-UUUGUUUUUGUU-3'? 
Indique qual o aminoácido N-terminal e o C-terminal do polipeptídeo obtido. 
 
3. O códon AUG funciona tanto para iniciar uma cadeia polipeptídica quanto para dirigir a 
incorporação de uma metionina em posições internas de uma proteína. Quais os mecanismos de 
seleção do códon AUG para a iniciação da tradução em procariotos? 
 
4. No que consiste a sequência de Shine Dalgarno? Ela é universal? Explique. 
 
5. Escreva os produtos finais das seguintes reações: 
a) valina + ATP + tRNAVal + valil-tRNA sintetase 
b) valina + ATP + tRNAIle + isoleucil-tRNA sintetase 
 
6. Explique quais são os mecanismos de ação dos antibióticos que agem na célula procariótica. Se 
muitos antibióticos exercem sua ação por inibição da síntese protéica, como alguns destes antibióticos 
podem ser usados em humanos para combater infecções microbianas sem causar efeitos tóxicos devido 
à inibição da síntese protéica eucariótica? 
 
7. O que se entende por chaperona? 
 
8. Quais eventos podem acontecer com uma proteína depois de terminada sua síntese? 
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Exercício 7. Regulação da Expressão Gênica 
 
1. Compare a expressão gênica em procariotos e eucariotos quanto a: 
a) grau de acoplamento da transcrição e da tradução. 
b) número de produtos gênicos em um transcrito primário. 
c) número de proteínas resultantes da tradução de um transcrito primário. 
d) proporção de seqüências codificadoras no DNA. 
e) organização de genes em operons. 
 
2. Defina expressão gênica constitutiva. Compare expressão gênica induzida com repressão gênica. 
Use o esquema proposto por Jacob e Monod para o operon da lactose e defina os termos operon, gene 
estrutural, gene regulador, operador, promotor, indutor, repressor e co-repressor. 
 
3. Numa cultura de E.coli em um meio contendo tanto lactose quanto glicose, qual dos açúcares é 
metabolizado preferencialmente? Qual é o mecanismo que permite esta seletividade? O que acontece 
quando a glicose se esgota durante o crescimento da bactéria? 
 
4. Para o cultivo de E.coli utilizaram-se meios contendo além dos sais necessários, os componentes: 
a) lactose d) glicose + cAMP 
b) lactose + glicose e) lactose + glicose + cAMP 
c) glicose 
 
Analise a produção de β- galactosidase em cada caso, justificando a resposta segundo o modelo de 
Jacob e Monod. 
 
5. Qual o efeito da deleção do gene regulador do operon lac? Haveria outro tipo de mutação resultando 
no mesmo efeito? 
 
6. Um mutante incapaz de crescer tanto em galactose quanto em arabinose, além de diversas outras 
fontes de carbono, foi isolado de uma cultura de E. coli do tipo selvagem. Que tipo de mutação pode 
ter produzido estes resultados? 
 
7. Demonstrou-se que o operon para a biossíntese do aminoácido fenilalanina de certa bactéria é 
regulado por um mecanismo de atenuação. O que pode ser afirmado sobre a seqüência de aminoácidos 
do peptídeo líder para este operon? Explique. 
 
8. A cromatina que é ativa transcricionalmente (eucromatina) tem estrutura dispersa, enquanto a 
cromatina que é inativa (heterocromatina) é compacta. Quando núcleos de células de galinha 
produzindo globina foram tratados brevemente com DNase pancreática, os genes de globina de adultos 
foram seletivamente destruídos, mas os genes para globina embriônica e ovalbumina permaneceram 
intactos. Quando os núcleos de células de oviduto foram tratadas com DNase, os genes de ovalbumina 
foram destruídos. Explique estes resultados. 
 
 
 
 
 
 
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Exercício 8. Transdução de Sinal e Câncer 
 
1. Descreva o mecanismo de ativação: 
a. das Proteínas G pelos receptores serpentina 
b. da Proteína Quinase A por cAMP 
 
2. O que são protooncogenes e oncogenes? Que tipos de proteínas estes genes podem codificar? 
 
3. A proteína c-src é homóloga à proteína viral oncogênica conhecida com v-src e atua como tirosina 
quinase citossólica, cuja atividade é regulada por fosforilação. Qual a característica de v-src que a torna 
uma proteína oncogênica. 
 
4. Qual o tipo de modificação covalente reversível em proteínas mais frequente nas cascatas de 
sinalização intracelular? Quais são as enzimas que catalisam esta modificação? 
 
5. O cAMP (AMP cíclico) é um importante mensageiro secundário para muitos hormônios. Como 
pode ocorrer a ativação da enzima adenilato ciclase após ativação de um receptor hormonal? 
 
6. Como a transcrição de certos genes pode ser influenciada em resposta a um sinal extracelular? 
 
7 A predisposição ao câncer pode ser hereditária. Explique este fato lembrando-se que existem 
proteínas que agem como supressores do crescimento celular. 
 
8. Retinoblastoma, um câncer de retina que aflige crianças, está asssociado a uma deleção no 
cromossomo 13. Proponha uma possível função para o gene selvagem(Rb) e que codifica uma 
proteína de 105 kD localizada no núcleo e capaz de se ligar ao DNA. 
 
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Exercício 9. Tecnologia do DNA recombinante 
 
1. A figura na página seguinte mostra o autorradiograma de um gel de sequenciamento de DNA pelo 
método de Sanger. Escreva a seqüência deste fragmento de DNA lendo o gel de baixo para cima. 
Traduza a seqüência obtida, considerando as três fases de leitura. O que aconteceria se durante a leitura 
do gel você tivesse omitido uma base? Como você faria para ter segurança absoluta da seqüência deste 
fragmento de DNA? 
 
2. O que a diferencia a técnica de Southern blot da técnica de Northern blot? 
 
3. Você gostaria de analisar os níveis de expressão do gene que codifica a proteína A de um fungo em 
resposta ao estresse hipertérmico. Que metodologias poderia utilizar? Por outro lado, se você quiser 
analisar simultaneamente os níveis de expressão de milhares de genes deste fungo na mesma condição, 
qual seria a metodologia mais adequada? 
 
4. Qual a diferença entre uma biblioteca genômica e uma biblioteca de cDNA? Explique como a 
presença de íntrons em genes eucarióticos complica a geração de produtos protéicos que eles codificam 
quando a expressão é feita em bactéria. Como se pode resolver este problema? 
 
5. A partir de uma biblioteca de cDNA você isolou um cDNA completo que codifica para uma proteína 
que é um potente estimulador do sistema imunológico. Agora você deseja clonar este cDNA em um 
vetor de expressão para produzir grande quantidade desta proteína em E. coli. O cDNA possui nas 
suas extremidades sítios para enzima BamHI e você planeja cloná-lo no sítio de BamHI do vetor de 
expressão. Esta é sua primeira vez com experimentos de clonagem e você decide seguir 
cuidadosamente as instruções do manual de clonagem que recomenda que o vetor digerido deve ser 
tratado com fosfatase alcalina para remover o fosfato da extremidade 5’. 
 
a) Por que deve ser feito o tratamento com fosfatase alcalina? 
b) Como você analisaria se a clonagem foi bem sucedida? 
c) A proteína de seu interesse afeta o crescimento das bactérias. Como você faria para obter grande 
quantidade desta proteína recombinante? 
 
 
QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 
 17 
 
 
 G A T C 
 
QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 
 18 
 
6. O gene completo (contendo todos os exons e íntrons) do hormônio de crescimento de ratos pode ser 
expresso em camundongos sob o controle de um promotor indutível por Cd2+. Como podem ser 
obtidos tais camundongos transgênicos? Quais as suas características? Como você explica o fato da 
expressão do gene do rato ser expresso perfeitamente em camundongos? 
 
7. Planeje a obtenção de cabras transgênicas que possam produzir o hormônio de crescimento humano 
em seu leite. 
 
8. Há poucos anos, cientistas europeus realizaram a clonagem de uma ovelha (Dolly), a partir de 
células de uma ovelha adulta. Compare este tipo de experiência com a obtenção de um animal 
transgênico. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 
 19 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ROTEIRO PARA AS 
AULAS PRÁTICAS 
QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 
 20 
 
ROTEIRO PARA AULAS PRÁTICAS 
 
RECOMENDAÇÕES: 
 
1. Por razões de segurança não será permitido ao aluno frequentar as aulas sem avental. É PROIBIDO 
COMER, BEBER E FUMAR NO LABORATÓRIO. 
 
2. Leia com detalhe o protocolo e preste atenção às instruções fornecidas antes de iniciar a experiência. 
 
3. Procure utilizar reagentes, vidraria e equipamentos disponíveis com cuidado, para evitar desperdício 
e quebra. 
 
4. Mantenha sua área de trabalho organizada. Ao terminar a experiência passe água na vidraria 
utilizada e coloque-a no local indicado. 
 
5. O relatório individual deverá ser entregue no final de cada uma das aulas práticas. O relatório deverá 
ser feito de acordo com modelo ao final de cada protocolo experimental. Após preenchidas, as 
respectivas folhas devem ser destacadas e entregues. 
 
6. Qualquer dúvida ou acidente peça auxílio às técnicas, às monitoras ou à professora. 
 
 
 
USO DO AVENTAL NAS AULAS PRÁTICAS 
 É OBRIGATÓRIO. 
QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 
 21 
 
EXPERIÊNCIA No.1: EXTRAÇÃO DE DNA (E RNA) DE Escherichia coli. 
 
Fundamento 
 
 Freqüentemente é necessária a purificação de DNA de alto peso molecular para sua 
manipulação e análise subsequentes. Procedimentos mais comuns para preparação de DNA genômico 
bacteriano consistem na lise das bactérias com a utilização de lisozima e/ou detergente, seguida de 
extrações com solventes orgânicos (fenol/clorofórmio) para remoção de proteínas. Os ácidos nucléicos 
são então precipitados com etanol na presença de concentrações relativamente altas de sal (0,1M – 
0,5M). Na obtenção de DNA de alto peso molecular (molécula longa e fibrosa) devem ser tomados 
cuidados para se evitar sua fragmentação. 
 
Material 
- 2 Tubos de ensaio médio 
- 1 Proveta de 50 mL 
- 1 cálice graduado 
- 1 bastão de vidro 
- 1 tubo de centrifuga 
- 1 recipiente de descarte c/ lisoforme 
- 10 mL de SDS 10% 
- 10 mL de NaCl 1% 
- 1 frasco de Clorofórmio c/ Álcool Isoamílico na Capela 
- 1 frasco de Etanol no freezer -20 °C 
 
Procedimento Experimental 
 
Será utilizada uma cultura de bactérias E.coli HB101 que foi inoculada ontem no final da tarde em 
meio de cultura líquido esterilizado (meio LB: triptona 1%, extrato de levedura 0,5%, NaCl 1%, pH 
final ajustado para 7,5 com NaOH) e mantida sob agitação vigorosa a 37°C até hoje pela manhã, 
quando a cultura foi transferida para a geladeira. 
 
1. Coletar as bactérias pela centrifugação de 20mL da cultura a 5000rpm por 5 min. Descartar o meio 
de cultura em um frasco contendo Lisoform a 10 %. Secar bem o tubo, invertendo-o sobre papel 
absorvente. Balancear os tubos! 
 
2. Adicionar 6mL da solução I (citrato de sódio 0,015M, NaCl 0,15M, pH final ajustado para 7,0 com 
HCl). Tampar o tubo e ressuspender o precipitado de bactérias por inversão. 
 
3. Remover a tampa e adicionar 0,7mL da solução II [Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) 10% (m/V)]. 
Fechar o tubo e incubá-lo em banho-maria a 60°C por 10 min, com agitação manual suave. 
 
4. Retirar o tubo do banho, abrir e deixá-lo a temperatura ambiente por 5min. Adicionar igual volume 
(6,7mL) da solução III (Clorofórmio:alcool isoamílico 24:1 V/V). Não pipetar com a boca! Fechar 
muito bem o tubo. Agitar suavemente por 10 min à temperatura ambiente. Esta etapa deve ser realizada 
na capela de exaustão. 
QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 
 22 
 
5. Centrifugar 5 minutos a 5000 rpm. 
 
6. Remover delicadamente a fase aquosa (fase superior) com pipeta Pasteur de ponta grossa para uma 
proveta. Estimar o volume e transferir para um cálice graduado. 
 
7. Medir, na mesma proveta, 2 volumes de etanol resfriado a -20°C e adicioná-lo lentamente com 
pipeta Pasteur, pela parede do cálice. 
 
8. "Enrolar" o DNA com uma pipeta Pasteur de ponta curva. Transferí-lo para um tubo de ensaio 
contendo 10mL de Solução IV (NaCl 1%). Aquecer a 50oC, por 10-20 minutos, até completa 
dissolução. 
 
9. Identificar o tubo com o número do grupo. Tomar uma alíquota e diluir em 1 mL de água. Medir a 
D.O.260nm e D.O.280nm e calcular a relação D.O.260nm /D.O.280nm. Estimar a quantidade de DNA obtida 
assumindo que D.O.260nm (Densidade Óptica a 260nm) = 1 equivale a 50µg DNA/mL.QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 
 23 
 
RELATÓRIO - EXPERIÊNCIA No.1 
 
 
Grupo No. Data 
Nomes dos Integrantes do Grupo: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
OBJETIVO DA EXPERIÊNCIA:_________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
 
RESULTADOS OBTIDOS :_____________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 
 24 
 
 
QUESTÕES: 
 
1. Qual a função do SDS, Clorofórmio: Álcool Isoamílico e Etanol nas etapas da purificação? 
Consultar tabela (no fim da apostila). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2. Por que é possível "enrolar" o DNA no bastão de vidro? 
 
 
 
 
 
 
 
 
3. Cite dois cuidados importantes para o sucesso da experiência realizada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
4. Se compararmos as medidas de absorção a 260nm e a 280nm da amostra de DNA obtida e de uma 
solução de DNA puro obtido a partir do mesmo volume inicial de cultura de bactérias, o que 
observaríamos? Por que? 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 
 25 
 
 
5. Qual o espectro de absorção do DNA na luz ultravioleta. Como se compara com o espectro de 
absorção de albumina? 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6. Como você faria para obter DNA puro a partir dessa preparação que contém DNA e RNA? 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
7. Por que ocorre o efeito hipercrômico na desnaturação do DNA? 
 
QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 
 26 
EXPERIÊNCIA No. 2: TRANSFORMAÇÃO DE BACTÉRIAS COM 
PLASMÍDEOS CONTENDO GENES DE RESISTÊNCIA A ANTIBIÓTICOS. 
 
Fundamento 
 
 A técnica de transformação permite a introdução de plasmídeo em uma bactéria e sua 
manutenção como um elemento autônomo auto-replicativo. Este plasmídeo pode conferir à bactéria 
hospedeira certas propriedades (por exemplo, resistência a drogas) que podem ter valor seletivo no 
meio. Várias técnicas são disponíveis para transformar uma bactéria. Na aula prática usaremos o 
método do CaCl2. Neste método as bactérias são submetidas a um tratamento num meio hipotônico 
contendo cálcio que as torna competentes para a transformação pelo DNA plasmidial. Usaremos o 
plasmídeo pBR322 (ver mapa abaixo). 
 O plasmídio pBR322 é comumente usado para clonagem de genes inteiros ou de fragmentos de 
genes. Além da origem de replicação que permite sua propagação em bactérias (E. coli) o pBR322 
apresenta duas marcas genéticas, ou seja, genes que codificam para proteínas que conferem resistência 
a ampicilina (ampr) e tetraciclina (tetr). Portanto a introdução de pBR322 em E. coli que normalmente 
é sensível tanto à ampicilina como à tetraciclina, leva ao aparecimento de bactérias capazes de crescer 
em meio (líquido ou sólido) contendo estes antibióticos. 
 Note que a introdução de genes exógenos no sítio da enzima de restrição Pst I leva à perda da 
resistência à ampicilina, uma vez que este sítio está localizado na região ampr. Da mesma forma, 
clonagem no sítio da enzima Bam HI leva à perda da resistência a tetraciclina. 
 Transformação de bactérias que são sensíveis a um antibiótico, em resistentes, será revelada 
através de plaqueamento (inoculação) de bactérias em placas de ágar contendo meio LB (meio rico de 
Luria Bertani) na ausência e na presença de antibióticos (ampicilina ou tetraciclina). 
 
 
 
 
 
Procedimento Experimental 
 
QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 
 27 
O ideal seria fazermos a experiência em condições estéreis, para evitar contaminação. Como isto não 
será possível, manipule convenientemente o material estéril fornecido. NÃO ABRA AS PLACAS DE 
ÁGAR ATÉ O MOMENTO DE USO. 
 
As bactérias competentes para transformação foram preparadas a partir de uma cultura em fase 
exponencial do crescimento e através de sucessivas lavagens do precipitado de bactérias com uma 
solução de CaCl2 e mantidas congelads a -80oC. 
 
1. Inocular 5 ml de meio LB líquido com uma colônia de bactérias HB101 (E. coli) e incubar à 37°C 
até o dia seguinte sob forte agitação (200-250 rpm). 
 
2. Diluir a pré-cultura 1/10 em 10 ml de meio LB, incubar à 37°C sob agitação até OD600nm =0,3 (fase 
logarítmica de crescimento). 
 
3. Transferir a cultura para o gelo, coletar as bactérias por centrifugação (4000 rpm, 5min). 
Ressuspender o sedimento de bactérias em 10 ml de tampão acetato de sódio (frio) 20 mM pH 6,5 
contendo CaCl2 0,1M. Incubar no gelo por 20 minutos. 
 
4. Coletar as bactérias (4000 rpm, 5 min) e ressuspender em 1 ml do mesmo tampão (frio). 
 
5. Após pelo menos 30 min no gelo estas BACTÉRIAS COMPETENTES podem ser transformadas. 
 
6. Para transformar, distribuir 0,1 mL/tubo da suspensão de bactérias competentes para cada um de 2 
tubos. Adicionar o DNA transformante (0,5 µg DNA de pBR322 em 10 µl de tampão 10 mM Tris pH 
7,5 contendo 1 mM EDTA) a um dos tubos. O outro tubo será usado como controle (bactéria apenas). 
 
7. Incubar em gelo por 15 min antes de dar o choque térmico (42°C por exatamente 90 segundos). 
Transferir os tubos novamente para o gelo por 2 min. 
 
8. Adicionar 0,9 ml/tubo de meio LB e incubar a 37°C sem agitação, em banho-maria, por uma hora. 
 
9. Transferir 25µl ou 250µl da suspensão para placas de ágar LB e LB-A (LB contendo ampicilina ou 
carbenicilina) previamente identificadas conforme a tabela abaixo. Espalhar as bactérias com o auxílio 
de uma alça de vidro, previamente flambada e em seguida resfriada na própria tampa da placa de Petri. 
 
10. Incubar as placas por __ h e contar as colônias formadas. 
 
Número de colônias/ placa Placa LB Placa LB-A 
#1 Bactérias controle 25µL 
#2 Bactérias controle 250µL 
 
#3 Bactérias transformadas 25µL 
#4 Bactérias transformadas 250µL 
QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 
 28 
 
RELATÓRIO - EXPERIÊNCIA No.2 
 
Nome: 
Grupo No. Data 
 
OBJETIVO DA EXPERIÊNCIA:________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
 
RESULTADOS OBTIDOS:1. Preencher a tabela com o número de colônias obtido em cada caso. 
 
Número de colônias/ placa 
 Placa LB Placa LB-A 
#1 Bactérias controle 25µL 
#2 Bactérias controle 250µL 
 
#3 Bactérias transformadas 25µL 
#4 Bactérias transformadas 250µL 
 
2. Qual a eficiência de transformação obtida, em termos de n° de colônias/ug de DNA? 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
 
QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 
 29 
 
Nome: 
 
QUESTÕES: 
 
1. Por que se usa cultura em fase exponencial de crescimento para obter bactérias competentes? 
 
 
 
 
 
 
 
2. Qual o papel do choque térmico? 
 
 
 
 
 
 
 
3. Por que as bactérias devem ser incubadas por 60 min a 37°C antes de espalhá-las em placas de ágar? 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4. Que utilidade teria esta técnica do ponto de vista biotecnológico? Dê um exemplo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 
 30 
 
EXPERIÊNCIA No.3: INDUÇÃO DA ββββ-GALAGTOSIDASE POR IPTG. 
 
Fundamento 
A β-galactosidase de E.coli é uma enzima indutível que hidrolisa β-D-galactosídeos. A atividade desta 
enzima pode ser medida com substratos cromogênicos que quando hidrolisados dão origem a produtos 
coloridos. Um exemplo é o orto-nitrofenil-β-D-galactosídeo (ONPG) que é incolor, mas na presença de 
β-galactosidase é convertido a galactose e orto-nitrofenol. O orto-nitrofenol é amarelo e sua absorção 
pode ser medida a 420nm. Altos níveis de β-galactosidase só são medidos em culturas crescendo na 
presença de lactose ou de um indutor não metabolizável, o IPTG (isopropil-tiogalactosídeo). 
 
Procedimento Experimental 
Será utilizada uma pré-cultura de bactérias E.coli CSH23 que foi semeada ontem no final da tarde em 
meio de cultura líquido esteril e mantida até hoje pela manhã, quando a cultura foi transferida para 
geladeira. 
 
1. Tomar uma alíquota da pré-cultura de bactérias e diluir em meio líquido na presença e ausência de 
IPTG (1mM) sob agitação vigorosa a 37°C até a cultura atingir D.O.600nm (Densidade Óptica a 600nm) 
= 0,7. Esfrie as culturas no gelo por 20 min. 
 
2. Retirar 0µL, 50µL e 100µL de cada cultura, transferindo separadamente para 3 tubos Eppendorf 
previamente identificados. Complete com água para um volume final de 100µL. Adicione 0,7mL de 
tampão de ensaio (tampão fosfato de sódio 0,1M pH 7,0 contendo KCl 10mM, MgSO4 1mM e β-
mercaptoetanol 50mM). 
Não descarte o restante das culturas, mantendo-as no gelo. 
 
3. Adicionar 50 µL de cloroformio. Agitar bem. Incubar os tubos em banho de água a 30oC por 5 min. 
 
 
 -IPTG +IPTG 
 
Cultura - 50µµµµl 100µµµµl 50µµµµl 100µµµµl 
H2O 100µµµµl 50µµµµl - 50µµµµl - 
T.E. 700µµµµl 700µµµµl 700µµµµl 700µµµµl 700µµµµl 
Clorofórmio 50µµµµl 50µµµµl 50µµµµl 50µµµµl 50µµµµl 
 
 
QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 
 31 
4. Iniciar a reação pela adição de 200 µL de ONPG (4mg/mL) e incubar a mistura de reação em banho 
de água a 30oC por 10 min. 
 
5. Interromper a reação adicionando 0,4mL de Na2CO3 1M. 
 
6. Centrifuguar os tubos por 5 minutos na minicentrífuga. 
 
7. Remover delicadamente o sobrenadante de cada tubo para a cubeta sem retirar o clorofórmio, e faça 
a leitura da D.O.420nm (Densidade Óptica a 420nm). Enxaguar as cubetas com água entre a cada leitura. 
 
8. Fazer uma diluição 1:10 das culturas de E.coli e faça a leitura da D.O.600nm (Densidade Óptica a 
600nm). 
 
 
9. Calcular a atividade de β-galactosidase das duas culturas: 
 
Atividade de β-galactosidase = 
culturadaODmLvolumetempo
OD
nm
nm
600
420
..)((min)
..1000
××
×
 UNIDADES 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RELATÓRIO - EXPERIÊNCIA No.3 
QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 
 32 
 
Nome: 
Grupo No. Data 
 
OBJETIVO DA EXPERIÊNCIA:________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
 
RESULTADOS OBTIDOS :_____________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
_____________________________________________________________________ 
QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 
 33 
 
Nome: 
 
QUESTÕES: 
 
1. O que você pode concluir sobre o genótipo da cepa CSH23? 
 
 
 
 
 
 
 
2. O que você esperaria encontrar em um experimento semelhante utilizando uma cepa cujo genótipo é 
I-O+Z+? E no caso de uma cepa I+O-Z+? Proponha um experimento para distinguir entre estas cepas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 
 34 
 
EXPERIÊNCIA No. 4: DIGESTÃO DE DNA PLASMIDIAL COM ENZIMAS DE 
RESTRIÇÃO e ELETROFORESE DE DNA EM GEL DE AGAROSE 
 
Fundamento 
 
Preparações de DNA plasmidial ou cromossomal purificadas podem ser submetidas a digestão com 
enzimas de restrição para identificação e caracterização do DNA. A escolha das enzimas de restrição 
deve ser baseada no mapa de restrição (quando disponível) ou opta-se pelo emprego de um conjunto de 
enzimas de forma a permitir a caracterização do DNA em questão, ou seja, obter seu mapa físico. As 
enzimas de restrição classificam-se em 3 gupos quanto a força iônica para a atividade (alta, média e 
baixa). As enzimas de restrição comercialmente disponíveis costumam vir acompanhadas do tampão 
correspondente e instruções para realizar a reação. 
 
Procedimento experimental 
 
A - Digestão do DNA com enzimas de restrição 
 Na experiência a ser realizada o DNA do plasmídeo será digerido com 4 enzimas de restrição 
diferentes. 
Cada grupo (ver tabela abaixo) receberá um tubo Eppendorf contendo os componentes da 
reação com exceção do DNA plasmidial. Manter o tubo em banho de gelo. 
 
- Cada aluno deverá providenciar uma folha de papel monolog para construçãodo gráfico 
(Questão 3). 
 
 
1. Acrescentar 10µL da solução de plasmídeo (DBQ1, 150ng/10µL) no tubo. 
 
GRUPOS 1,7,13,19 2,8,14,20 3,9,15,21 4,10,16,22 5,11,17,23 6,12,18,24 
 EcoRI BglII EcoRI e 
BglII 
EcoRI e 
XbaI 
BglII e 
XbaI 
sem enzima 
H2O 7 µL 7 µL 6 µL 6 µL 6 µL 10µL 
Tampão da 
enzima (10X) 
2 µL 2 µL 2 µL 2 µL 2 µL - 
Enzima (1 U) 1µL 1µL 1µL / 1µL 1µL / 1µL 1µL / 1µL - 
Plasmídeo 10µL 10µL 10µL 10µL 10µL 10µL 
Volume total 20µL 20µL 20µL 20µL 20µL 20µL 
 
2. Misturar o conteúdo dos tubos por agitação e centrifugação rápida. 
 
3. Incubar a reação em banho maria a 37°C durante 60min. 
 
4. Interromper a reação pela adição de 1µL EDTA 0,1 M (Opcional). Transferir o tubo para um banho 
a 65°C, durante 15min. Retirar o tubo do banho e rapidamente colocá-lo em gelo. 
 
5. Adicionar a cada um dos tubos 5µL de tampão da amostra. Misturar e centrifugar. A amostra está 
pronta para ser analisada em eletroforese em gel de agarose. 
 
QBQ-3401 / Biologia Molecular – 2008 
 35 
Tampão de digestão 10X Tampão da amostra 
Tris-HCl 100mM - 500mM* Tris 10mM pH 8, 
NaCl 500mM-1M* EDTA 1mM pH 8, 
MgCl2 100mM azul de bromofenol 0,25% p/v 
DTT 10mM xileno cianol 0,25% p/v 
*(depende da enzima) sacarose 40% p/v 
 
 
B. Fracionamento do DNA em gel de agarose. 
 
Preparo do gel de agarose 1,0% 
 
OBS: Serão montados dois géis com espaço para aplicação de até 14 amostras 
 
1. Pesar 1,0 g de agarose. Adicionar 100mL de tampão TBE (Tris-borato 89mM, EDTA 2mM pH 8). 
 
2. Aquecer em banho fervente e misturar até completa dissolução da agarose. Enquanto espera-se a 
dissolução da agarose, preparar a forma para o gel. Resfriar até 40°C (até conseguir segurar com as 
mãos) e acrescentar 5µL de uma solução de brometo de etídio 10mg/mL. CUIDADO BROMETO DE 
ETÍDIO É CARCINOGÊNICO! 
Despejar sobre a forma para o gel previamente preparada, incluindo a colocação do pente. Deixar 
solidificar por pelo menos 30min. 
 
3. Retirar o pente e transferir o gel para a cuba. Adicionar tampão TBE à cuba de modo a cobrir o gel 
com menor volume possível. 
 
4. Aplicar as amostras preparadas na experiência anterior. Ligar a fonte de eletroforese e aplicar 
aproximadamente 100V. Cuidado para não tocar o tampão. 
 
5. Interromper a eletroforese quando o corante azul estiver a 0,5cm do fim do gel. 
 
6. Tranferir o gel para o transiluminador e, em seguida observar o gel sob luz UV, utilizando óculos 
protetores. Fotografar o padrão de bandas observado com uma régua posicionada na lateral do gel. 
 
OBS: Ordem de aplicação das amostras nos géis 
 
GEL 1: 1 - 2 - 3 - 4 -5 – 6 - Padrão de tamanho - 7 - 8 - 9 – 10 – 11- 12 
 
GEL 2: 13 - 14 -15 – 16 – 17 – 18 - Padrão de tamanho - 19 – 20 – 21 – 22 – 23 –24 
 
 
 
 
 
 
 
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RELATÓRIO - EXPERIÊNCIA No.4 
 
Nome: 
Grupo No. Data 
 
OBJETIVO DA EXPERIÊNCIA:________________________________________ 
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RESULTADOS OBTIDOS: :____________________________________________ 
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Nome: 
 
QUESTÕES: 
 
1. Por que se observam duas bandas no plasmídeo que não foi incubado com a enzima? 
 
 
 
 
2. Por que se utiliza EtBr (Brometo de Etídio) no gel e no tampão da eletroforese? 
 
 
 
 
 
3. Géis de agarose podem ser usados para análise de fragmentos de DNA que tenham entre 70 e 
800.000 pares de base. Assim, é possível estimar o tamanho e a quantidade dos fragmentos de DNA. O 
tamanho pode ser estimado tomando-se por base a sua mobilidade em relação à de outros de tamanho 
conhecido. Se o gel foi fotografado com uma régua ao lado, a mobilidade relativa pode ser lida 
diretamente da foto. O gráfico da mobilidade em cm (M) contra o tamanho em pb (L) dará uma curva 
que pode ser usada para leitura do tamanho com relação a uma determinada mobilidade. Entretanto, a 
interpolação é muito mais precisa se a função puder ser encontrada em uma linha reta: gráfico de log L 
versus M. Desenhe a reta utilizando papel monolog (eixo x, mobilidade em cm, eixo y, tamanho em 
pb). Usando-se a mistura de padrões de tamanho em pb conhecida calcule o tamanho dos fragmentos 
obtidos da digestão do pQBQ com as enzimas utilizadas. Faça um desenho do pQBQ indicando a 
posição dos sítios de clivagem para estas enzimas. 
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PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DOS ÁCIDOS NUCLEICOS 
 
 DNA RNA 
 
Força iônica 
baixa ("Salting in") 
alta ("salting out) 
 
Solubiliza 
Precipita 
 
Solubiliza 
Precipita 
 
Meio ácido 0,5N 
(brando) à frio 
 
Precipita 
Despurina 
 
Precipita 
Despurina 
 
Meio alcalino brando 
(0,3N KOH; 37°C; 18h) 
 
ss: estável 
ds: desnatura 
 
Hidrolisa 
2' e 3'nucleosídeos 
 
Solvente orgânico 
(cte dieletr. < que da H2O) 
ex.: etanol, isopropanol 
 
Precipita 
 
Precipita 
 
Agentes desnaturantes que 
quebram pontes de H 
ex.: formamida, uréia 
 
ss: estável 
ds: desnatura 
 
1ária: estável 
2ária: destruída 
 
Luz UV (260 nm) 
 
ss: absorve mais 
ds: absorve menos 
 
Absorve 
 
Calor 
 
ss: estável 
ds: desnatura (T
m
) 
 
1ária: estável 
2ária: destruída 
 
Nucleases Exonucleases 
+ + 
 
 
Endonucleases + + 
 
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 INIBIDORES DE TRANSCRIÇÃO OU DE TRADUÇÃO 
 
ANTIBIÓTICOS 
 
 
Rifamicina (Streptomyces) Rifampicina (sintética) 
 Inibe iniciação da transcrição (impede a formação da la. ligação fosfódieser) mas não inibe 
elongação da cadeia de mRNA. Liga-se à subunidade β de RNAP. 
 
Actinomicina D: Estrutura: 2 peptídeos + 3 anéis benzeno fenoxazona (ver p 715 Stryer). Extraída de 
Streptomyces. Inibe transcrição. Liga-se a dsDNA impedindo que seja usado como template. Anéis 
fenoxazona intercalam-se entre as bases nitrogenadas do RNA. Usado em tratamento de câncer. 
 
α-Amanitina (octapeptídeo cíclico) de um cogumelo (Amanita) 
 Inibe RNAPII (muito) e III (um pouco, em maior concentração). 
 Liga-se a RNAPII bloqueando a formação de mRNA ou de precursores de mRNA. Inibe 
elongação. 
 
Puromicina: Inibe tradução. Análogo de aminoacil-tRNA.Liga-se ao sítio A do ribossomo, impedindo 
a entrada de aminoacil-tRNAS. 
 Foma ligação peptídica com a cadeia polipeptídica nascente (peptidil transferase). Peptidil-
puromicina: peptídeo liberado do ribossomo contendo puromicina ligada covalentemente ao C-
terminal. 
 
Tetraciclina: Liga-se ao sítio A do ribossomo, impede ligação de aminoacil-tRNA neste sítio. 
 
Cloranfenicol: Só inibe a síntese de proteínas de procariotos e mitocôndira (não inibe a síntese protéica 
extramitocondrial de eucariotos). 
 
Cicloheximida: Inibe a formação dos ribossomos de eucariotos (80S), mas não de procariotos (70S). 
 
Estreptomicina: Causa leitura incorreta do código genético. 
 
 
TOXINAS 
 
 
Diftérica: Inibe síntese protéica. Alvo é EF2 que cataliza a translocação do peptídeo. 
 O fragmento A da toxina cataliza a transferência de ADP para EF2 (ADP-ribosilação) 
inativando este fator de elongação da cadeia polipeptídica. 
 
Ricina: Inativa a subunidade 60S dos ribossomos eucarióticos. 
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CÓDIGO GENÉTICO 
UUU Phe UCU Ser UAU Tyr UGU Cys 
UUC Phe UCC Ser UAC Tyr UGC Cys 
UUA Leu UCA Ser UAA STOP UGA STOP 
UUG Leu UCG Ser UAG STOP UGG Trp 
CUU Leu CCU Pro CAU His CGU Arg 
CUC Leu CCC Pro CAC His CGC Arg 
CUA Leu CCA Pro CAA Gln CGA Arg 
CUG Leu CCG Pro CAG Gln CGG Arg 
AUU Ile ACU Thr AAU Asn AGU Ser 
AUC Ile ACC Thr AAC Asn AGC Ser 
AUA Ile ACA Thr AAA Lys AGA Arg 
AUG Met ACG Thr AAG Lys AGG Arg 
GUU Val GCU Ala GAU Asp GGU Gly 
GUC Val GCC Ala GAC Asp GGC Gly 
GUA Val GCA Ala GAA Glu GGA Gly 
GUG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gly 
 
AUG é parte do sinal de iniciação e também é o códon para as metioninas internas à 
cadeia.