Introdução à Enzimologia

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Fundamentos da 
Bioquímica
Aula 05: Introdução à Enzimologia
Prof. Luís Fernando Costa Jorge
Enzimas
• Os sistemas vivos são formados por uma variedade enorme de
reações bioquímicas, e quase todas elas são mediadas por
catalisadores biológicos conhecidos como enzimas;
• A maioria das enzimas são proteínas, com exceção de um pequeno
grupo de moléculas de RNA catalíticas;
• Como toda proteína, a sua função está intimamente relacionada com
a sua estrutura;
• Portanto, a atividade catalítica de uma enzima depende da
integridade da sua conformação nativa.
Enzimas
• Se uma enzima for desnaturada, ou dissociada nas suas subunidades, a sua
atividade catalítica estará perdida;
• No nosso corpo, as enzimas possibilitam que diversas reações que não
ocorreriam ao acaso aconteçam em apenas alguns segundos, ou mesmo
em fração deles;
• A reação de catalisação mediada pela enzimas ocorre confinada em uma
região específica denominada de sítio ativo;
• A molécula que se liga no sítio ativo e sobre qual a enzima age, é
denominada de substrato;
• Toda enzima é específica para um substrato e o complexo enzima-
substrato, é fundamental para a ação enzimática.
Enzimas
Uma reação enzimática simples pode ser escrita como:
E + S ↔ ES ↔ EP 3 + P
Onde:
E = Enzima
S = Substrato
P = Produto
ES e EP = Complexos transitórios da enzima com o substrato e com o produto
No final de uma reação enzimática, a enzima (E) permanece inalterada, enquanto o
substrato (S) sofre alterações transformando-se em um produto (P).
Enzimas
• Algumas enzimas necessitam de componentes químicos adicionais para exercerem a sua
função;
• Esses componentes são chamados de cofatores;
• Eles podem se dividir em 3 grupos:
Grupos Prostéticos
São considerados como um cofator firmemente ligados
às proteínas enzimáticas. Ex.: o grupo heme da
hemoglobina.
Coenzimas
São moléculas orgânicas pequenas, termoestáveis que
facilmente dissociam-se da proteína enzimática. Ex.: as
vitaminas.
Ativadores Metálicos
São representados por cátions metálicos mono ou
divalentes como K+, Mn2+, Mg2+, Ca2+ ou Zn2+. São
indispensáveis para atividade de um grande número de
enzimas. Esses íons podem estar fraca ou firmemente
ligados a uma proteína enzimática.
Energia de Ativação Enzimática
• Grande parte do conhecimento sobre o modo como as enzimas catalisam
as reações químicas é proveniente da teoria do estado de transição;
• O estado de transição é um momento molecular transitório no qual
eventos como a quebra de ligação, a formação de ligação ou o
desenvolvimento de carga ocorrem com a mesma probabilidade de
seguirem tanto para formar novamente o substrato como para formar o
produto;
• A diferença entre os níveis energéticos do estado basal e do estado de
transição é chamada de energia de ativação (∆G+);
• A energia de ativação é, portanto, a energia necessária para levar um mol
de uma substância até seu estado de transição.
Energia de Ativação Enzimática
• Quanto maior a energia de ativação, mais difícil torna-se a reação;
• Uma substância não pode chegar à sua energia de ativação sem um
agente ou um fator que possibilite o aumento dessa energia por
parte da molécula;
• Os catalisadores atuam reduzindo a energia livre do estado de
transição da reação catalisada.
Energia de Ativação Enzimática
Diagrama mostrando a energia livre de uma reação sem catalisador e com
catalisador.
Energia de Ativação Enzimática
• As enzimas conseguem acelerar as velocidades das reações químicas por
meio de diferentes mecanismos catalíticos, incluindo, por exemplo, a
catálise ácido-básica, catálise covalente e catálise por íons metálicos:
Catálise Geral Ácido-Básica É um processo no qual a transferência ou a remoção parcial de prótons de um
ácido reduz a energia livre do estado de transição de uma reação.
Catálise Covalente Acelera as velocidades das reações por meio da formação transitória de uma
ligação covalente entre o catalisador e o substrato.
Catálise por Íons Metálicos
Metais, tanto ligados firmemente à enzima quanto tomados da solução
juntamente com o substrato, podem participar da catálise das reações. Os metais
participam dos processos catalíticos de três maneiras principais: ligando-se ao
substrato para orientá-lo apropriadamente para a reação; mediando reações de
oxidação-redução por intermédio de mudanças reversíveis no estado de
oxidação do íon metálico ou estabilizando eletrostaticamente cargas negativas.
Fatores que influenciam na atividade 
Enzimática
• Um fator chave que afeta a velocidade das reações enzimáticas é a
concentração do substrato [S];
• Quando o substrato é adicionado a uma enzima (E), a reação
rapidamente atinge um estado estacionário no qual a velocidade pela
qual o complexo ES se forma é compensada pela velocidade pela qual
ES se decompõe;
• Em uma concentração fixa de enzima, à medida que a concentração
de substrato aumenta, a atividade do estado estacionário aumenta de
maneira hiperbólica até se aproximar de uma velocidade máxima
característica denominada de Vmáx na qual, essencialmente, toda a
enzima formou um complexo com o substrato.
Fatores que influenciam na atividade 
Enzimática
• A concentração de substrato que resulta em uma velocidade de
reação igual à metade da Vmáx é a constante de Michaelis (Km) a qual é
característica para cada enzima agindo sobre determinado substrato;
• Esta equação relaciona a velocidade inicial de uma reação (V0) com
[S] e Vmáx por meio da constante Km. A cinética de Michaelis-Menten
também é denominada cinética do estado estacionário.
Fatores que influenciam na atividade 
Enzimática
• Da mesma forma que um substrato interfere com a velocidade de uma
reação enzimática, a temperatura e o pH em que a reação ocorre também
influenciam;
• As enzimas têm um pH (ou uma faixa de pH) ótimo no qual a atividade
catalítica é máxima;
• Da mesma forma, a temperatura também pode ser um fator limitante para
a atuação das enzimas;
• Em uma temperatura perto de 0°C a enzima praticamente não apresenta
nenhuma reação, ao se aumentar a temperatura a reação enzimática
torna-se favorecida;
• Entretanto, a temperatura também é um fator que pode quebrar as
ligações peptídicas das proteínas tirando a enzima de sua conformação
nativa, e, portanto, sua função catalítica.
Fatores que influenciam na atividade 
Enzimática
• A temperatura e o pH, dessa forma, são responsáveis pela boa
atuação enzimática, podendo alterar a conformação da molécula em
casos de alterações bruscas, bem como podendo tornar a enzima
muito mais eficiente no seu mecanismo de ação.
Inibidores Enzimáticos
• Inibidores de enzimas são moléculas que interferem com a catálise,
diminuindo ou interrompendo as reações enzimáticas;
• Uma só enzima pode ter muitos inibidores e a forma como eles
atuam em uma determinada enzima também pode variar;
• Uma vez que as enzimas catalisam quase todos os processos
biológicos em uma célula, os inibidores enzimáticos apresentam
grande importância médica.
Inibidores Enzimáticos
• Os inibidores enzimáticos podem ser classificados em dois grupos:
• inibidores reversíveis
• inibidores irreversíveis
• Os inibidores irreversíveis reagem quimicamente com as enzimas,
deixando-as inativas permanentemente;
• Já os inibidores reversíveis podem ser classificados de acordo com a
forma como atuam na enzima; eles podem ser classificados como
inibidores reversíveis competitivos ou não competitivos.
Inibidores Enzimáticos
• Os inibidores reversíveis competitivos possuem uma estrutura
molecular muito semelhante à do substrato;
• Dessa forma, podem se ligar ao centro ativo da enzima formando um
complexo enzima-inibidor semelhante ao complexo enzima-substrato;
• Entretanto, o complexo enzima-inibidor nunca formará o produto,portanto, a ação da enzima estará bloqueada, diminuindo assim a
velocidade da reação.
Inibidores Enzimáticos
• Os inibidores reversíveis não-competitivos não apresentam nenhuma
semelhança estrutural com o substrato da reação que eles inibem;
• Na verdade, nesse tipo de inibição os inibidores atuam com ligações
em radicais que não pertencem ao centro ativo da enzima;
• Esta ligação modifica a estrutura da enzima, afetando também a
estrutura do centro ativo, não permitindo portanto que essa enzima
se ligue ao seu substrato.
Isoenzimas
• O termo isoenzima faz referência às diferentes formas moleculares
(alelos) que uma determinada enzima pode apresentar, porém,
reagindo sempre com o mesmo substrato, ou seja, são enzimas que
diferem na sua sequencia de aminoácidos porém apresentam funções
catalíticas iguais ou semelhantes;
• As isoenzimas resultam de mutações ao nível do DNA e que podem
provocar diferenças significativas nas cargas iônicas das cadeias
polipeptídicas e, ainda, nas suas dimensões e formas.
Isoenzimas
• Segundo a União Internacional dos Bioquímicos, a definição de isoenzimas
seria:
“Múltiplas formas de uma enzima apresentando, entre si, diferenças na 
estrutura primária, determinadas geneticamente”
• As isoenzimas podem ocorrer em uma mesma espécie, em um mesmo
tecido, ou até mesmo em uma mesma célula, podendo ser expressas em
organelas distintas ou variar de acordo com o estágio de desenvolvimento
da célula;
• As diferentes formas de isoenzimas podem ser distinguidas umas das
outras por propriedades bioquímicas, tais como propriedades cinéticas ou
de regulação, qual o cofator utilizado por elas (NADH ou NADPH, por
exemplo), ou na sua distribuição subcelular (solúveis ou ligadas à
membrana).
Isoenzimas
• A existência de isoenzimas permite o ajuste fino do metabolismo para
satisfazer as necessidades particulares de um determinado tecido ou
determinado estágio de desenvolvimento do organismo;
• Considere o exemplo da lactato desidrogenase (LDH), uma enzima com
funções no metabolismo da glicose anaeróbia e síntese de glicose;
• A LDH foi uma das primeiras enzimas descobertas a possuir isoenzimas;
• Em tecidos de vertebrados existem pelo menos cinco diferentes isoenzimas
da LDH;
• Os seres humanos apresentam duas cadeias polipeptídicas isoenzimáticas
para esta enzima: a isoenzima H altamente expressa em coração (H de
heart em inglês) e a isozima M (M de muscle em inglês) encontrada no
músculo esquelético.
Isoenzimas
• As sequências de aminoácidos dessas duas enzimas são 75%
idênticas;
• A enzima funcional é tetramérica e muitas combinações diferentes
das duas subunidades (H ou M) são possíveis de se encontrar;
• A isoenzima H4, encontrada no coração, tem uma maior afinidade
para determinados substratos do que a isoenzima M4, por exemplo.
Isoenzimas
• Estas diferenças no conteúdo de isoenzimas nos tecidos celulares podem ser uma
importante ferramenta para diagnóstico clínico;
• Voltemos ao exemplo da LDH novamente. É possível de se avaliar a época e a
extensão de danos causados ao coração devido a enfarte do miocárdio (ataque
cardíaco) pela avaliação da liberação de isoenzimas de LDH do coração para o
sangue;
• Pouco tempo depois de um ataque cardíaco, o nível sanguíneo de LDH total
aumenta, havendo mais isoenzima LDH2 do que a isoenzima LDH1;
• Após 12 horas, as quantidades de LDH1 e LDH2 são muito semelhantes, e, após
24 horas há mais LDH1 do que LDH2;
• Essa mudança na proporção entre LDH1/LDH2, combinada com o aumento no
sangue de outra enzima do coração, a creatina quinase, é uma forte evidência de
um recente infarto do miocárdio.
Isoenzimas
Em geral, a distribuição das diferentes isoenzimas de uma determinada enzima reflete, pelo menos, quatro
fatores:
1. Diferentes padrões metabólicos em diferentes órgãos. Por exemplo, para a glicogênio fosforilase, as
isoenzimas presentes no músculo esquelético e no fígado apresentam diferentes propriedades
reguladoras, refletindo os diferentes papéis de quebra de glicogênio nestes dois tecidos.
2. Diferentes locais e funções metabólicas para as isoenzimas em uma mesma célula. Por exemplo a
isoenzima da isocitrato desidrogenase presente no citoplasma e na mitocôndria, exercendo diferentes
papéis em cada local.
3. Diferentes estágios de desenvolvimento em tecidos embrionários ou fetais e em tecidos adultos. Por
exemplo, o fígado fetal tem uma distribuição característica da isoenzima LDH, que muda conforme o
órgão se desenvolve na sua forma adulta. Algumas enzimas do catabolismo da glicose em células
malignas (cancerosas) ocorrem como sua fetal, e não como sua forma em adultos.
4. Respostas diferentes de isoenzimas para moduladores alostéricos. Esta diferença é útil para o ajuste fino
de taxas metabólicas. Por exemplo, a hexoquinase IV (glicoquinase) do fígado e as isoenzimas
hexoquinase de outros tecidos diferem na sua sensibilidade à inibição por glucose-6-fosfato.
Atividade para a Próxima Aula
Laboratório em Casa
Tema: Propriedades das proteínas e cinética 
enzimática
Atividade para a Próxima Aula
Para essa atividade você irá precisar de:
• Uma batata pequena;
• 100 mL de peróxido de hidrogênio – H2O2 (Água oxigenada 10 a 30 volumes). A CREMOSA NÃO SERVE. Um
frasco é suficiente;
• Quatro copos;
• Uma panela pequena;
• Aquecedor (fogão, micro-ondas ou “banho maria”);
• Um garfo e uma faca;
• Meio copo de suco de limão ou meia xícara de café ou meio copo de refrigerante à base de cola;
• Detergente;
• Quatro pires ou pratos pequenos;
• Papel e caneta;
• Celular para fazer fotos e vídeos.
Atividade para a Próxima Aula
Siga as instruções abaixo por etapas:
1. Descasque a batata;
2. Corte a batata em cubos médios (uma batata pequena pode ser cortada em seis e até em oito
pedaços);
3. Prepare em cada copo os seus “Meios de Reação”, com volume suficiente para cobrir os pedaços de
batata:
a. Água a temperatura ambiente (condição controle);
b. Água fervendo (condição experimental 1);
c. Suco de limão ou café ou refrigerante (condição experimental 2);
d. Detergente (condição experimental 3);
4. Adicione um ou dois pedaços de batata em cada um dos copos e marque o tempo. Deixe-os por um
minuto;
5. Retire os pedaços de batata e coloque-os sobre os pires separados, de modo que saiba identificar
cada um, as diferentes condições em que estiveram.
Atividade para a Próxima Aula
6. Agora, adicione cerca de 20 mL de água oxigenada sobre as batatas (não precisa cobrir toda a
batata), espere um pouco e observe;
7. Registre todas as suas observações, compare o que você está vendo acontecer em cada pedaço
de batata;
8. Faça vídeos e fotos, compartilhe com os seus colegas e leve para a aula para conversar a
respeito;
9. Descarte o material utilizado, limpe tudo, lave, seque e guarde seus equipamentos;
10.Responda às questões a seguir.
Atividade para a Próxima Aula
Questões
1. Defina o que é Sítio Ativo ou Sítio Catalítico.
2. Identifique quais são os substratos e produtos da enzimas peroxidase.
3. Correlacione a formação do produto da reação enzimática às observações feitas a partir das
diferentes condições.
4. Como você espera que esteja a estrutura tridimensional da enzima em cada uma das
condições?
5. Explique o que houve com a enzima em cada condição testada.
Atividade para a Próxima Aula
Recomenda-se a leitura no livro proprietário da disciplina (seguintes
unidades e páginas):
2.2 Proteínas 32
2.2.1 Estrutura das Proteínas 32
2.2.2 Função das Proteínas 36
2.3 Enzimas 39
2.3.1 Energia de ativação enzimática 40
2.3.2 Fatores que influenciam na atividade enzimática 42
2.3.3 Inibidores Enzimáticos 43
2.3.4 Isoenzimas 44
Atividade para a Próxima Aula
Obrigado!