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1 MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO SECRETARIA DE EDUCAÇÃO PROFISSIONAL E TECNOLÓGICA Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro Campus Duque de Caxias APOSTILA DE RERFORÇO DAS ATIVIDADES DIDÁTICO- PEDAGÓGICAS DA DISCIPLINA BIOLOGIA GERAL I Licenciatura em Química Profº Dr. Marcio Martins Loureiro marcio.loureiro@ifrj.edu.br 2 AULA PRÁTICA 1 – O MICROSCÓPIO Partes do Microscópio Como utiliza-lo O Microscópio é o instrumento destinado a observar seres e coisas tão pequenos que se tornam invisíveis a olho nu. Fundamentalmente, o microscópio está formado por um conjunto de peças móveis (parte mecânica) e por uma associação de lentes (parte óptica). A partir do momento em que o homem aprendeu e conseguiu polir a primeira lente, tornou-se possível o descobrimento de um mundo até então inimaginado, povoado de numerosos e variados seres. A princípio, o microscópio era formado por uma simples lente de aumento. Posteriormente, a associação de lentes tornou-se possível obter maiores aumentos, e com isto, o homem começou a “espionar” aquele mundo até então invisível, descobrindo mais e mais, à medida que as técnicas de preparo das lentes e a utilização de corantes evoluíram. Hoje em dia, não só usamos os microscópios comuns com lentes e luz, mas também microscópios eletrônicos que se utilizam de campos eletromagnéticos e feixes de elétrons, conseguindo com esta nova técnica, aumentos que ultrapassam a 100.000 vezes. É um “mergulho” no mundo do infinitamente pequeno. Agora que você já aprendeu algumas coisas sobre o microscópio e as partes que o constituem, vamos familiarizar-nos com o seu uso e entender o seu funcionamento. 1 – Quando giramos o parafuso macrométrico para um lado ou para o outro, aproximamos ou afastamos as lentes ___________________________ da mesa de platina. O que ocorre quando giramos o parafuso micrométrico? Há um movimento tão nítido quanto o anterior? ___________________________________ ___________________________________________________________________ 3 2 – Em seu microscópio localize o parafuso “charriot”, e faça o seguinte: a – Gire um dos parafusos e observe que movimento ele fará executará no microscópio . b – Gire agora o outro parafuso; produziu o mesmo movimento? c – Que movimento você poderá executar, se girar os dois parafusos ao mesmo tempo? ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ _____________________________________________________________ Quando você estiver mais treinado em trabalhar com os parafusos do “charriot”, não terá dificuldade em seguir os movimentos dos mais ágeis microrganismos. 3 – Eleve o tubo canhão e girando o revólver, observe as diversas objetivas. São todas iguais e do mesmo tamanho? ________________________________ Observe a parte inferior das objetivas. São iguais os diâmetros das lentes? Estabeleça uma relação entre os artifícios de abertura das diversas objetivas e o número de aumentos gravados em cada lente. ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ _____________________________________________________________ 4 – O aumento de uma imagem vista ao microscópio óptico é sempre o produto dos aumentos fornecido pela ocular, multiplicado pelos aumentos fornecidos pela lente objetiva usada. Portanto, se você estiver usando uma ocular de 10 X e uma objetiva de 40 X, a imagem observada estará _____________________ vezes aumentada. 5 – Repare na figura, que, quanto maior for o aumento, menor será a área observada. Toda vez que for observar alguma coisa ao microscópio, use sempre a objetiva de menor aumento em primeiro lugar, pois ela lhe dará maior visão do material. Em seguida use o segundo aumento. Atenção: A objetiva 100x deverá ser usada em microscopia de imersão, isto é, coloca-se sobre a lâmina uma gota de óleo de cedro e, sobre esta gota, mergulha- se a objetiva. A função do óleo de cedro é proporcionar maior iluminação ao canhão. 6 – Localize em seu microscópio o condensador, movimente-o, para baixo e para cima, girando o seu parafuso. Em que posição você obterá um campo mais iluminado? Apenas movendo o condensador, poderemos variar a quantidade de luz do campo? ______________________________________________________ A finalidade do condensador, como o próprio nome indica, é a de reunir toda a luz refletida pela fonte luminosa, condensando um feixe estreito, mas de grande intensidade luminosa. Junto ao condensador existe o diafragma, que funciona da mesma maneira que os diafragmas das máquinas fotográficas, ou melhor, que funciona como a sua íris, aumentando ou diminuindo o tamanho da pupila, regulando assim a entrada de luz. Mova a alavanca que fecha e abre o diafragma. Houve mudança na iluminação do campo? ________________________________________________ 4 ___________________________________________________________________ Atenção: Em qualquer trabalho com o microscópio é de grande importância uma iluminação adequada. Se o material estiver muito iluminado ou com pouca luz, não dará uma visão nítida e real. Tenha sempre em mente todos os recursos de que o microscópio dispõe para se obter melhor contraste. Vamos agora observar alguma coisa ao microscópio e para isto precisaremos preparar uma lâmina. Como montar uma lâmina a – coloque sobre uma lâmina limpa e desengordurada uma gota de água; b – tome uma lamínula, também limpa e desengordurada e encoste um dos lados na lâmina, bem próximo da gota, de modo que o líquido se espalhe em toda extensão da lamínula; c – agora, vagarosamente, vá baixando a lamínula, só a soltando quando o ângulo formado pela lâmina e lamínula for bem pequeno. Procedendo assim, você evitará a formação de bolhas de ar que poderão prejudicar o seu trabalho; d – se houver excesso de água por fora da lamínula ou se a lamínula estiver frouxa, deveremos absorver o excesso de água com um papel de filtro. 5 7- Recorte um pedacinho de jornal (mais ou menos 1 cm 2 ), com letras bem pequeninas e nítidas. Para montar a lâmina proceda da seguinte maneira: a – limpe bem a lâmina e coloque uma gota de água; b – sobre a gota coloque o pedacinho de jornal e espere um pouco; c – sobre o jornal coloque a lamínula, limpa e desengordurada. Atenção: Tenha o cuidado de fazer a montagem da lâmina sem deixar nenhuma bolha de ar entre lâmina e lamínula; em certas montagens isto terá grande importância. 8- Para observar a lâmina ao microscópio proceda da seguinte forma: a – eleve o canhão girando o parafuso macrométrico; b – prenda a lâmina com o material a ser observado nas pinças encontradas sobre a mesa de platina; c – acenda a fonte luminosa de modo que a luz reflita através da lâmina, deixando o campo do microscópio bem iluminado; d – gire o revólver e coloque a objetiva de menor aumento; e – gire o parafuso macrométrico até chegar bem próximo da lâmina, (Atenção: Esta operação deverá ser realizada, olhando pelo lado de fora e não pela ocular, pois assim procedendo você evitará quebrar a lamínula, estragando o material e perdendo tempo); f – olhando pela ocular, você suspenderá vagarosamente o canhão, até que consiga ver alguma coisa; g – a focalização final deverá ser feita com o micrométrico, girando-opara frente e para trás até conseguir o ponto onde a imagem tem maior nitidez (o foco). 9- Procure focalizar uma letra do jornal (a ou e) e verifique qual a sua posição no campo. Olhe, pelo lado de fora, e verifique qual a sua posição na lâmina. Notou alguma diferença?________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ ______________________________________________________________ Se você mover a lâmina para a sua direita, para que lado a imagem se moverá? _________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________ 10 - Vamos agora passar para um aumento maior: a – eleve o canhão e troque a objetiva girando o revólver e torne a focalizar com todo cuidado. Atenção: O foco de uma lente, isto é, o ponto em que a imagem aparece com maior nitidez, varia com a potência da lente. Como temos objetivas com diferentes aumentos, isto significa que teremos diferentes focos. Quanto mais potente for a lente objetiva, tanto mais próxima ela estará da lamínula, aumentando assim o risco de quebrá-la, portanto, cuidado! 6 Em comparação com a observação anterior, o campo aumentou ou diminuiu? E a imagem? A quantidade de luz no campo variou? Você já sabe os recursos para melhora-la, tente! _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________ Cuidados com o Microscópio Como transporta-lo ? use as duas mãos, uma segurando o braço do microscópio e a outra o sustentando pela base. Nunca carregue o aparelho, usando apenas uma das mãos. Não gire o micrométrico indefinidamente para mover o canhão, pois poderá estragar o seu delicado mecanismo. Use-o somente para ajustar o foco e para as observações de profundidade. Não passe os dedos nas lentes para limpá-las. O vidro das lentes é facilmente arranhável (mais que o vidro comum), por isso só devemos usar um papel especial, bem macio, para limpá-las. Evite molhar o microscópio quando estiver trabalhando; se isto ocorrer, seque-o com um paninho macio. Não desmonte qualquer parte do microscópio. Este é um instrumento muito delicado e caro, portanto, todo cuidado é pouco. 7 8 AULA PRÁTICA 2 – OBSERVAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS E GRAM POSITIVAS Um dos primeiros passos para identificação de um microrganismo é a observação de sua forma e, de suas estruturas. Isto só é possível com a ajuda de microscópios. Para facilitar a observação dessas formas e estruturas, evidenciando-as melhor, desenvolveu-se uma série de combinações entre substâncias químicas e corantes. Coloração de bactérias pelo Método de Gram A maior dificuldade encontrada pelos antigos microbiologistas era, conseguir combinações de corantes que permitissem destacar as bactérias em meio aos tecidos corados. O Dr. Christian Gram, trabalhando no diagnóstico de doenças respiratórias junto com o Dr. Friendlander, em Berlin, verificou que após corar cortes de pulmão, de animais mortos por pneumonia, com violeta de Genciana e iodo, e posterior tratamento com álcool etílico, os tecidos perdiam facilmente a cor enquanto que, as bactérias neles incluídas permaneciam coradas. Tingindo-se os tecidos posteriormente continuavam destacando as bactérias. Gram aplicou esta técnica a esfregaços e registrou ainda, que certas bactérias também se descoravam pelo álcool e, se coravam pelo corante de fundo. Em 1886, Émile Roux dividiu as espécies bacterianas em Gram positivas e Gram negativas para fins de identificação. É ainda hoje o primeiro passo em qualquer chave de classificação bacteriana. Base da Técnica A parede celular das bactérias ditas Gram positivas é espessa e seus elementos constituintes principais são: peptídeoglicanos e ácidos teicóico. Com a adição do corante cristal violeta, este tinge a larga camada de glicopeptídeos, em seguida se acrescenta lugol, que é uma substância mordente, formando um composto a iodopararosanilina. Com o tratamento pelo álcool, este não é suficiente para descorar. Adicionando-se a fucsina, corante de fundo, esta não encontra o que corar, permanecendo a bactéria com a coloração violeta ao final da técnica. A parede celular das bactérias ditas Gram negativas é mais fina e seus elementos constituintes principais são lipopolissacarídeos, fosfolipídios, lipoproteínas e uma fina camada de peptídeoglicano. Com a adição do violeta se tinge a fina camada do glicopeptídeo, acrescentando-se o lugol fixa-se o violeta conforme dito anteriormente. Com o tratamento pelo álcool, este consegue penetrar muito mais facilmente nesta parede devido a quantidade de lipídios e, descora totalmente a fina camada de peptídeoglicanos. Adicionando-se a fucsina esta irá então, corar a referida camada permanecendo a bactéria corada em vermelho ao final da técnica. Técnica 1. Preparar um esfregaço de uma colônia bacteriana numa lâmina e esperar secar, e flambar rapidamente a lâmina no bico de Bunsen, para fixar as bactérias a lâmina. 2. Cobrir o esfregaço com cristal violeta por 1 minuto. 3. Retirar o excesso de cristal violeta num filete d’água; 4. Acrescentar lugol sobre o esfregaço e aguardar 1 minuto; 5. Inclinar a lâmina e lavá-la por 30 segundos com álcool; 6. Lavar em filete d’água; 7. Cobrir o esfregaço com fucsina por 30 segundos; 9 8. Lavar novamente em filete d’água, secar entre papel de filtro, ou à chama do bico de Bunsen, ou apoiada verticalmente a temperatura ambiente ou estufa; 9. Pingar 1 gota de óleo de cedro sobre a lâmina e observar em objetiva de 100x (Neste tipo de microscopia não utiliza-se lamínula). As bactérias Gram positivas se coram em roxo e as Gram negativas em vermelho. 10. Realize o confecção do desenho científico e suas anotações conclusivas sobre a aula. A Gram-positividade não é uma propriedade definitiva. Alguns fatores podem alterar o resultado da coloração: . Idade da cultura – os resultados só são válidos para culturas de 18 a 24 horas; . Composição do meio de cultura; . pH do meio de cultura; . Integridade da parede celular e membrana citoplasmática; . Problemas na aplicação da técnica; . Ação de substâncias químicas e outras substâncias que podem alterar a reação. 10 AULA PRÁTICA 3 – OBSERVAÇÃO DE PROTOZOÁRIOS OBTIDOS A PARTIR DE INFUSÕES. 1 – Arrume um frasco de boca larga, um copo ou um vidro de geléia, e encha até a metade com água. 2 – Pique umas duas folhas de alface e coloque no copo, tendo o cuidado de misturar bem com a água. 3 – Cubra a abertura do frasco com uma gaze e prenda-a com um elástico. Guarde o copo num local que não receba luz direta. Após mais ou menos uma semana, passe a examinar periodicamente a infusão, pois com o envelhecimento, desaparecem algumas espécies e aparecem outras. Você poderá preparar também outras infusões usando couve, capim, grãos de arroz, trigo etc. Haverá relação entre o tipo de infusão e as espéciesde microrganismos que aparecem? Investigue! 4- Realize os desenhos científicos e tire suas conclusões acerca da aula prática 11 12 13 14 AULA PRÁTICA 4 - OBSERVAÇÃO DE CÉLULAS DE Elodea sp., CICLOSE E OSMOSE Material: - microscópio, lâmina, lamínula - folhas de Elodea sp. - Água, solução salina 2M - Papel de filtro Procedimento: 1 – Retire uma folhinha da planta aquática (Elodea sp.), e utilizando água, prepare uma lâmina para observar ao microscópio. 2 – Use a lente de pequeno aumento para ter uma idéia geral da folha e, em seguida, coloque um aumento maior. Observe os corpúsculos verdes (cloroplastos) que preenchem as células. Tente localizar o núcleo e o citoplasma. Fique atento para ver se os cloroplastos se movimentam (ciclose). Faça o desenho científico deste tecido vegetal. 3 – Para evidenciarmos a ocorrência de osmose, basta pingarmos uma gota de solução salina 2M sobre um bordo da lamínula, e no lado oposto, utilizarmos um pedaço de papel de filtro para substituirmos a água pela solução salina 2M entre a lâmina e a lamínula. Observe as modificações sofridas pelas células deste tecido, faça o desenho científico e tire suas conclusões. 15 AULA PRÁTICA 5 - OBSERVAÇÃO DE CÉLULAS DE MUCOSA BUCAL Material: - microscópio, lâmina, lamínula - papel filtro, swab - corante (azul de metileno) Procedimento: 1 – Com um swab realize um esfregaço com cuidado na parte interna de sua boca (mucosa bucal). 2 – realize um esfregaço do swab numa lâmina e pingue uma gota de azul de metileno sobre o local do esfregaço, e cubra com lamínula. 3 – Observe ao microscópio e procure identificar as células. Conseguiu observar as células? Qual o seu aspecto geral? Observou o núcleo? Faça o desenho científico da célula observada. 16 MÓDULO TEÓRICO 1 - ORGANIZAÇÃO GERAL DAS CÉLULAS PROCARIOTAS Todos os organismos vivos conhecidos podem ser organizados em 5 reinos na chamada classificação de Whittaker. Estes 5 reinos são: monera, protista, fungi, vegetal e animal e suas subdivisões. Dentre os organismos componentes destes cinco reinos podemos distinguir 2 tipos distintos de células – as procariotas e as eucariotas. As células procariotas não possuem envoltório nuclear e tem seu DNA localizado num espaço chamado nucleóide. As células eucariotas possuem o chamado núcleo verdadeiro, tendo o seu DNA separado do citoplasma por uma membrana fosfolipídica chamada de membrana nuclear ou carioteca. Esta membrana permite intercâmbios entre núcleo e citoplasma, que participam do controle do metabolismo celular. Os procariontes são considerados ancestrais dos eucariontes. Comparação entre a organização celular dos procariontes e eucariontes Características Células Procarióticas Células Eucarióticas Bactérias,algas cianofíceas e micoplasmas Protozoários, outras algas, metafitos e metazoários Envoltório nuclear ausente Presente DNA desnudo Associado a proteínas cromossomas único Múltiplos nucléolo ausente Presente Divisão Amitose, cissiparidade ou bipartição mitose ou meiose Endomembranas Enzimas respiratórias e fotossintéticas na MP Presentes Mitocôndrias ausentes Presentes Cloroplastos ausente em células vegetais Parede celular não celulósica em células vegetais Exocitose e endocitose Ausente Presente Locomoção flagelos cílios e flagelos 17 18 As células procariotas são, em geral, as chamadas bactérias. A Escherichia coli é o procarionte mais conhecido. Muito de nosso conhecimento em biologia celular se deve a estudos deste microorganismo. Seu tempo de geração é de 60 min ou se acrescido de ácido nucléicos e aminoácidos pode chegar a 20 min. Composição: Parede celular – esta estrutura se encontra acima da membrana plasmática e é formada principalmente de peptideoglicanos. É uma estrutura rígida que dá forma e resistência às bactérias. Todas as bactérias possuem parede celular com exceção dos micoplasmas. A parede das bactérias pode ser de dois tipos e caracterizar dois tipos de bactérias: Bactérias Gram-positivas – quando coradas pela coloração Gram se coram de roxo. Possuem a parede simples, formada de uma camada espessa de peptideoglicanos (também chamada de mureína ou mucopolissacarídeos) entre a cápsula e a membrana plasmática. Possuem ácido teicóico, que não está presente nas bactérias Gram-negativas. Bactérias Gram-negativas – Sua parede é muito complexa e é formada de 4 camadas diferentes, uma camada de peptideoglicanos fina, uma camada de lipoproteínas, uma membrana externa trilaminar, e uma camada de lipopolissacarídeos (LPS) associada à membrana externa, esta camada torna a parede impermeável. As bactérias Gram-negativas possuem moléculas protéicas associadas a membrana externa chamadas de porinas que são canais para a passagem de moléculas como aminoácidos e carboidratos. Algumas espécies de bactérias possuem acima da parede uma cápsula viscosa, que pode estar relacionada a patogenicidade da bactéria, a cápsula fornece resistência à fagocitose. Esta cápsula pode estar presente tanto em bactérias Gram-positivas como Gram-negativas. Esta cápsula pode conter antígenos potentes que aumentam a imunogenicidade das bactérias. Esta cápsula tem uma composição química variada e freqüentemente mucosa. A membrana plasmática das bactérias tem a mesma estrutura trilaminar das células eucariotas e possui receptores, proteínas transportadoras e enzimas da cadeia respiratória similares às encontradas na membrana interna das mitocôndrias, em bactérias aeróbias. A membrana pode sofrer invaginações formando os mesossomos, que aumentam a superfície da membrana e contém enzimas respiratórias, estes mesossomos estariam também envolvidos na divisão celular, pois na reprodução bacteriana (bipartição, cissiparidade ou amitose) o DNA após duplicado, separa-se atracado a membrana (mesossomos). As bactérias possuem cromossomo único condensado numa região chamada de nucleóide seu DNA é circular, com cerca de 1 mm, codificando de 2000 a 3000 proteínas. Algumas bactérias possuem um DNA extra-cromossômico chamado de plasmídio que pode conferir resistência a antibióticos e produção de toxinas às bactérias. A superfície das bactérias pode possuir prolongamentos de 2 tipos: fímbrias e flagelos. Os flagelos são estruturas de locomoção, de tamanho variado (de 3 a 12 m). São formados por um polímero da proteína flagelina. O movimento dos flagelos depende de um fluxo de prótons que passam por um “motor” localizado em sua base. Este fluxo impulsiona o flagelo que pode rotar em mais uma direção. 19 As fímbrias são filamentos rígidos protéicos curtos e finos, não relacionados com a locomoção. Existem dois tipos de fímbrias, as que promovem aderência das bactérias com as células hospedeiras (Adesinas) e as fímbrias sexuais, que formam canais de aderência entre bactérias para a troca de DNA (plasmídeos) durante o processo de conjugação. As bactérias possuem toxinas que podem ser de 2 tipos: endotoxinas, existem só nas bactérias Gram-negativas e são os lipopolissacarídeos (LPS) da parede celular destas bactérias, são estáveis e em geral liberadas quando ocorre lise das bactérias.Exotoxinas, são moléculas protéicas secretadas pelas bactérias Gram-positivas ou Gram- negativas, são altamente tóxicas e instáveis às altas temperaturas. MÓDULO TEÓRICO 2- VÍRUS 20 Os vírus são partículas infectantes de células, não são capazes de se multiplicar fora de células hospedeiras, infectam as células e utilizam sua maquinaria genética para se reproduzir. As partículas virais possuem tamanho entre 10 a 300nm, sendo portanto, cerca de 100 vezes menores que a bactéria E. coli. O Vírion é a partícula de vírus completa que é capaz de infectar um hospedeiro. As formas vegetativas, não infectantes, dos vírus são chamadas de profagos. Enquanto livres, os vírus não apresentam atividades metabólicas, portanto, não são considerados como seres vivos. Somente depois que infectam células hospedeiras os vírus passam a apresentar atividades metabólicas. As bactérias Rickéttsias e as Clamídias são quase do tamanho de determinados vírus e são consideradas endoparasitas celulares, no entanto diferem dos vírus em três aspectos. Em primeiro lugar elas contêm ao mesmo tempo DNA e RNA ou contrário dos vírus. Em segundo lugar elas apresentam parte da maquinaria de síntese para se reproduzirem, mas necessitam da suplementação fornecida pelo hospedeiro e em terceiro lugar, apresentam uma membrana semipermeável, através da qual ocorrem trocas como o meio, o que não acontece com o vírus. Características dos vírus: São partículas infectantes de células, que dependem completamente do hospedeiro para se multiplicarem, pois não apresentam a maquinaria genética necessária para a síntese das macromoléculas que vão formar um novo vírus. Fora das células os vírions podem se cristalizar. Existem 3 tipos de vírus, que podem ser distinguidos por seus hospedeiros. Os vírus podem ser vírus animais, vegetais e bacteriófagos (vírus que infectam bactérias). Alguns vírus contêm DNA, enquanto outros contêm RNA. Os dois tipos de ácido nucléico jamais estão presentes no mesmo tipo de vírus. Os vírus de RNA catalisam a síntese de DNA a partir do RNA. O DNA formado é uma cópia do RNA viral que se incorpora ao DNA celular, este tipo de vírus é chamado de retrovírus e seu mais conhecido representante é o vírus da AIDS. Composição do Vírus: Os vírus são basicamente compostos de ácidos nucléicos e proteínas. As proteínas virais têm como funções principais: proteger o genoma, facilitar sua transferência para a célula hospedeira, facilitar sua aderência às células hospedeiras. As proteínas virais são antigênicas o que leva o hospedeiro a organizar defesas contra elas. Os vírus são formados pôr capsídeo, que é uma estrutura protéica formada por unidades menores chamadas capsômeros que envolvem o RNA ou DNA. Os vírus podem ter um invólucro viral que protege o capsídeo e é formado por fosfolipídios das células hospedeiras e por proteínas virais (Envelope). As proteínas virais deste envoltório estão relacionadas com o reconhecimento do hospedeiro. 21 MÓDULO TEÓRICO 3- MEMBRANA PLASMÁTICA A membrana plasmática é uma estrutura que possui a função de separar o meio intracelular do extracelular, sendo a principal responsável pelo controle de entrada e saída das substâncias da célula. Ela é responsável pela manutenção do equilíbrio do meio intracelular, seleciona a entrada e saída de substâncias na célula, possui receptores celulares, que são regiões capazes de reconhecer outras células ou moléculas específicas (estes receptores são em geral proteínas associadas à membrana). A membrana plasmática é capaz de responder a estímulos externos, promover movimentação celular, além de estar envolvida em processos de secreção celular, síntese de anticorpos e divisão celular, estando também envolvida nos processos de modificação do volume celular. As membranas são capazes de conter sistemas enzimáticos inseridos, ordenando uma cadeia enzimática, aumentando a eficiência destes sistemas como por exemplo membranas de bactérias e mitocôndrias. Modificações da concentração de sais do meio extracelular podem levar a modificações do volume intracelular devido a entrada e saída de água na célula. O controle de entrada e saída de água das células é chamado de osmose. No Meio isotônico as concentrações de sais são iguais do lado de dentro e de fora da célula, não há ganho nem perda de água pela célula. No Meio hipertônico existem mais sais do lado de fora que dentro da célula ocorrendo saída de água da célula para o meio externo, numa tentativa de se equilibrar a quantidade de sais entre o meio e a célula. Em células vegetais ocorre um fenômeno chamado de plasmólise, quando há perda de água da célula para o meio (ocorre em meio hipertônico) e o processo inverso é chamado de desplasmólise, quando a célula volta a seu volume normal. Nas hemácias a perda de volume celular em meio hipertônico é chamado de crenação. No meio hipotônico existem mais sais dentro que fora da célula, portanto ocorre entrada de água na célula, em células animais pode ocorrer lise celular. Em situações extremas, a parede celular das células vegetais pode se romper e ocorre o processo chamado de plasmoptise, onde ocorre a lise das células vegetais. Nas hemácias a lise celular provocada pelo aumento do volume celular é chamada de hemólise. 22 Composição das membranas: Em geral são compostas de lipídios, proteínas e carboidratos, sendo chamadas de fosfolipoprotéicas. A relação entre estes componentes da membrana varia de acordo com o tipo de estrutura ou células. Por exemplo, as membranas mitocondriais têm maior proporção de proteínas que lipídios porque são metabolicamente muito ativas. Já as membranas das fibras nervosas que têm como função básica proteção da célula, e são 80% lipídicas. A membrana é assimétrica (não possui a mesma composição de lipídios comparando-se os lados externo e interno), em geral a membrana externa é rica em fosfatidilcolina e a interna em fosfatidilserina ou fosfatidiletanolamina (fosfolipídios de membrana). Quando há predominância da fosfatidilserina (fosfolipídio mais carregado) na face interna da membrana, a membrana passa a apresentar carga elétricas. Os glicolipídios e glicoproteínas (lipídios e proteínas associados a carboidratos) têm sua parte glicídica (carboidratos) voltada para o lado externo da membrana. A camada externa da membrana tem os resíduos glicídicos das glicoproteínas e glicolipídios, que vão formar uma camada externa de açúcares chamada de glicocálice (ou glicocálix). Os lipídios das membranas São moléculas longas com uma cabeça hidrofílica e uma cauda hidrofóbica, sendo chamadas de moléculas anfipáticas devido a sua capacidade de interagir com ambiente hidrofílico e também com um hidrofóbico. Os principais lipídios componentes das membranas são os fosfolipídios, cujos principais são a fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, e o fosfatidilinositol; os glicolipídios, os esfingolipídios e o colesterol Arranjo estrutural da membrana As membranas são compostas de duas camadas lipídicas, fluídas e contínuas, com moléculas protéicas associadas, o modelo de estrutura mais aceito é o do mosaico fluído. Este modelo é válido para todas as membranas celulares. Neste modelo as duas camadas lipídicas da membrana celular estão associadas por interações hidrofóbicas entre as cadeias apolares dos fosfolipídios. A membrana plasmática é uma estrutura trilaminar, formada por uma camada hidrofóbica mediana (localizada no centro da membrana) e duas camadas hidrofílicas (polares) uma em contato com o meio extracelular e outra com o citoplasmadas células. As proteínas das membranas plasmáticas são capazes de se deslocar ao longo das membranas sem gasto de energia, e este deslocamento só ocorre entre proteínas de uma mesma camada. Os fosfolipídios da membrana também podem mudar de lugar ao longo de uma mesma face da bicamada lipídica. A troca de fosfolipídios entre as duas faces da bicamada é pouco comum e para ocorrer depende da ação de uma enzima chamada flipase, este processo é chamado de flip-flop. A estrutura trilaminar das membranas plasmáticas foi chamada de membrana unitária ou unidade de membrana, e estas unidades de membrana embora sigam um modelo base de organização, variam bastante de uma célula para outra de acordo com a função. Os lipídios de membrana são capazes de influenciar na atividade desta estrutura, entretanto, atividades como reconhecimento e capacidade catalítica (enzimática) estão diretamente relacionadas com proteínas de membrana. 23 Tipos de associação das proteínas aos lipídios da membrana plasmática: As proteínas de membrana podem estar associadas à bicamada lipídica constituinte das membranas de duas formas: Proteínas integrais ou intrínsecas, neste caso as proteínas estão inseridas na bicamada lipídica da membrana. E estão em contato com a cabeça polar e cauda apolar dos fosfolipídios. A maioria das proteínas das membranas são integrais como por exemplo as enzimas, as proteínas responsáveis pelo reconhecimento sangüíneo M-N, proteínas transportadoras, receptores hormonais. Estas proteínas são presas aos lipídios por interações hidrofóbicas, e a parte que fica para o lado externo das membranas é a parte hidrofílica da molécula protéica. Algumas das proteínas integrais podem ultrapassar de um lado ao outro das membranas, podendo ter extremidades no lado interno e no lado externo destas. São as chamadas proteínas transmembranares. As proteínas transmembranares podem passar sua cadeia polipeptídica uma única vez pela membrana, sendo chamadas de proteínas transmembranares de passagem única ou unipasso, ou várias vezes, sendo chamadas de proteínas transmembranares de passagem múltipla ou multipasso. Proteínas periféricas ou extrínsecas, são retiradas facilmente das membranas (por aumento da concentração de sais do meio), elas interagem apenas com a cabeça polar dos fosfolipídios ou com a parte das proteínas integrais. Elas são obtidas puras com facilidade, e estão muitas vezes relacionadas com os processos de transdução de sinais entre o lado externo das membranas e o lado interno. Glicoproteínas e glicolipídios: São proteínas ou lipídios associados a membranas, que possuem uma região associada a carboidratos voltada para o lado externo da membrana. Estas moléculas podem ser marcadores de superfície celular, como por exemplo as glicoproteínas de reconhecimento dos eritrócitos (hemácias) que estão relacionadas aos diferentes grupos sangüineos. Os grupos M-N estão relacionados à parte glicídica da proteína glicoforina. Os grupamentos A, B, AB e O estão relacionados à presença de diferentes carboidratos presentes nas proteínas (glicoproteínas) transmembranares dos eritrócitos. O sangue do tipo A contém N-acetilgalactosamina, as pessoas do tipo B, possuem uma galactose, as do tipo AB possuem galactose e N-acetilgalactosamina na mesma posição, já as pessoas do tipo O não possuem estes carboidratos na superfície de eritócitos. A função de Reconhecimento celular As células são dotadas de especificidade, que as permitem se reconhecerem e estabelecerem relações entre os tipos celulares afins. Elas têm capacidade de inibição por contato, isto é, as células crescem isoladamente e quando atingem um determinado grau de contato entre elas, o processo de mitose cessa (neste caso o contato com células do mesmo tipo inibiria o crescimento celular). No caso de células cancerosas, elas perdem a inibição por contato e mesmo depois de se encontrarem, continuam proliferando, e se amontoando desordenadamente. A capacidade imunogênica das células é conferida por moléculas glicoprotéicas, estas moléculas formam o chamado complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Existem 2 tipos de MHC, o MHC I que é o complexo da maioria das células do organismo e o MHC II encontrado principalmente nos leucócitos. 24 Estes complexos são diferentes para cada indivíduo, sendo semelhantes somente no caso de gêmeos univitelinos. Mecansimos de Transporte através da membrana O transporte através da membrana pode ocorrer de duas maneiras, diretamente através dos fosfolipídios de membrana ou ser mediado por proteínas. Existem dois mecanismos de passagem através da membrana mediados por proteínas: o transporte ativo e a difusão facilitada. Difusão passiva é a passagem de substâncias através da membrana (entre os fosfolipídios de membrana), a favor de um gradiente de concentração (as moléculas do soluto tendem a ficar na mesma concentração em ambos os lados da membrana, do meio mais concentrado para o meio menos concentrado). Este é um processo que ocorre sem gasto de energia para a célula. Difusão facilitada é um tipo de difusão passiva, só que mediada por proteínas que formam canais nas membranas. Ocorre sem gasto de energia para as células, e é mais rápida e controlada que a difusão passiva. Este processo é específico para um tipo de molécula, por exemplo a D-glicose, que passa facilmente enquanto a L-glicose não. As proteínas relacionadas com este transporte são capazes de reconhecer a molécula a ser transportada. A velocidade de entrada nas células não é diretamente dependente da concentração da molécula. A entrada da substância na célula vai ser gradativa e pode chegar a um ponto de saturação que bloqueia a entrada desta, mesmo existindo ainda um gradiente de concentração. Este tipo de transporte está relacionado com a ligação da substância a ser transportada, com uma proteína transportadora, que facilita a entrada da molécula na célula. O Transporte ativo ocorre contra um gradiente de concentração e leva a um gasto de energia celular. Este gradiente pode ser químico ou elétrico, como o transporte de sódio pelas células, onde o sódio que está em menor concentração dentro da célula indo para o meio externo de maior concentração deste íon. Este tipo de transporte é mediado por proteínas. 25 Direção do transporte ativo através da membrana mediado por proteínas: O Co-transporte é o transporte de 2 substâncias ao mesmo tempo através da membrana e pode ser de dois tipos: simporte, neste tipo de transporte duas moléculas diferentes são transportadas na mesma direção. Como exemplo temos a entrada de glicose nas células epiteliais do intestino, que é acoplada à entrada de sódio. A molécula de glicose entra na célula juntamente com um íon sódio, estes íons entram a favor de um gradiente de concentração e auxiliam a entrada de glicose nas células. Outro tipo de co-transporte é o antiporte, onde as duas moléculas são transportadas ao mesmo tempo, sendo que em direções opostas, ou seja, uma molécula entra na célula e a outra sai . Como no caso da bomba de sódio e potássio, onde o sódio sai da célula e o potássio entra. Uniporte, no caso deste tipo de transporte, apenas uma molécula entra ou sai da célula em uma única direção, como por exemplo no caso dos transportadores de glicose. Transporte de moléculas grandes para interior das células ocorre por endocitose:O processo de endocitose envolve modificações da membrana que permitem o englobamento de moléculas pelas células. Existem dois tipos de endocitose: A Fagocitose que envolve a emissão de pseudópodes, isto é, a membrana plasmática sofre envaginação. A partícula a ser fagocitada, em geral é sólida, e se liga a receptores específicos que vão acionar o movimento celular para englobá-la. No organismo humano este processo depende de reconhecimento. Nos animais existem células especializadas em fagocitose, as células fagocitárias, que reconhecem corpos estranhos ou microrganismos invasores, englobando-os e destruindo-os (macrófagos e neutrófilos). Nos protozoários este processo está envolvido com a obtenção de alimentos. A molécula fagocitada é envolvida por uma membrana no citoplasma da célula fagocitária. Este vacúolo é chamado de fagossoma. Este fagossoma vai se fundir aos lisossomos para a digestão do material fagocitado, formando o fagolisossomo que depois do conteúdo digerido irá se unir à membrana para que haja a excreção celular ou clamocitose (mecanismo de exocitose). 26 A Pinocitose é o englobamento de lipídios e, moléculas líquidas em geral. Ela ocorre por uma invaginação da membrana e pode ser uma pinocitose não-seletiva onde são englobadas todas as partículas de soluto ao redor de uma região da membrana, independente do reconhecimento celular. A pinocitose na maioria dos casos é seletiva e ocorre em etapas. Primeiro ocorre a ligação da molécula a um receptor celular, depois o afundamento da membrana, e então, a formação de uma vesícula que vai para o citoplasma celular. Esta vesícula pinocítica é recoberta com proteína chamada clatrina (uma proteína do citoesqueleto) que auxilia na formação da vesícula e sua movimentação no citoplasma. Estas vesículas são chamadas de vesículas cobertas. Esta cobertura está relacionada com o transporte destas vesículas para dentro das células por meio de interações com outras proteínas do citoesqueleto. Mecanismos de adesão celular As células num organismo estão organizadas em tecidos e órgãos, e as células de uma forma geral estão dispostas sobre uma camada de proteínas secretadas pelas células deste tecido, onde o conjunto destas proteínas é chamado de matriz extracelular, cujo sua composição química forma uma espécie de leito ou assoalho onde as células podem interagir umas com as outras ou com estas proteínas de matriz, através de interações do tipo célula-matriz (quando a célula interage com proteínas de matriz) ou interações do tipo célula-célula (quando uma célula interage com outra célula) Os mecanismos de adesão celular são divididos em dois grandes grupos: os mecanismos de adesão não juncionais e os mecanismos de adesão juncionais. Os mecanismos não juncionais são mediados por proteínas de membrana, sendo considerados mecanismos de adesão relativamente fracos, enquanto que os mecanismos de adesão 27 juncionais são mediados por especializações de membrana (modificações de membrana), sendo considerados mecanismos de adesão relativamente fortes. Os mecanismos de adesão não juncionais podem ser de dois tipos: célula-célula e célula-matriz. Os mecanismos do tipo célula-célula podem ser mediados pelas seguintes proteínas: CAM (Cell Adhesion Molecules) – Estas proteínas são integrantes da superfamília da imunoglobulinas, são independentes do cálcio e são específicas de órgãos e tecidos. Caderinas – Esta proteínas além de participarem dos mecanismos de adesão não juncionais, também podem participar dos mecanismos juncionais tais como: desmossomos e junção aderente. Realizam um mecanismos de interação do tipo célula-célula. Estas proteínas são dependentes de cálcio. Selectinas – São proteínas ligadoras de carboidratos em interações do tipo célula- célula. Um exemplo clássico são os leucócitos, que apresentam selectinas em suas membranas para ligarem-se a carboidratos encontrados na superfície de células que compõem a estrutura de um vaso sangüíneo, com finalidade de migrarem para os tecidos e realizarem reações inflamatórias. Estas proteínas são dependentes do cálcio. Os mecanismos não juncionais do tipo célula-matriz podem ser mediados por proteínas integrinas e proteoglicanos, que são glicoproteínas possuidoras de carboidratos voltados para o meio extra-celular com finalidade de interagirem com proteínas da matriz extracelular (principalmente fibronectina, colágeno e laminina). Estas proteínas são dependentes de cálcio para realizarem interação. As proteínas integrinas também podem participar de mecanismos de adesão juncionais tais como: hemidesmossomos e contato focal. Os mecanismos de adesão celular do tipo juncional são considerados mecanismos de adesão relativamente fortes e são mediados por especializações da membrana plasmática tais como: Juncões de oclusão – são mecanismos de adesão do tipo célula-célula realizadas por proteínas transmembranares de adesão, que formam uma espécie de cordão no ápice de células epiteliais, que veda total ou quase totalmente a passagem de íons entre células vizinhas, através da obstrução dos poros de membrana, criando o aparecimento de potenciais elétricos, devido a diferenças de concentração de íons nas faces de células vizinhas em tecidos epiteliais. Desmossomos – são mecanismos de adesão do tipo célula-célula realizadas por modificações de membrana, cujo sua estrutura é formada pelo espessamento de membrana de células vizinhas (formando uma placa arredondada), condensação do citoplasma das 2 células realizado por proteínas citoplasmáticas conhecidas como desmoplaquinas, e fixação de proteínas do citoesqueleto (filamentos intermediários). A junção das 2 metades do citoesqueleto é realizada por proteínas caderinas (desmogleínas ou democolinas). Hemidesmossomos – corresponde a metade de um desmossomo, e atuam em mecanismo de adesão juncional do tipo célula-matriz. Outra diferença em relação aos desmossomos é que em vez de uma caderina em sua estrutura, é encontrada uma proteína integrina (glicoproteína). Junção aderente – é um mecanismo de adesão juncional do tipo célula-célula, em que ocorre a conexão do córtex de actina (filamento do citoesqueleto) entre células vizinhas através de proteínas caderinas. Neste tipo de mecanismos de adesão forma-se uma espécie de cinto de adesão contínuo entre células vizinhas. Complexo juncional – é um mecanismo de adesão celular do tipo célula-célula presente em epitélios próximos a extremidade celular livre, e é composto por juncões de oclusão, juncões aderentes e desmossomos, portanto, é considerado uma estrutura de adesão e vedação entre células vizinhas. 28 Contato focal - é um mecanismo de adesão celular do tipo célula-matriz onde a membrana está associada aos componentes da matriz extracelular através de proteína transmembranar da família das integrinas. No domínio citoplasmático da integrina se liga a talina, que por sua vez se liga a vinculina, que se associa a fibras de actina. Outras modificações de membrana (Obs: não relacionadas com mecanismos adesão celular) Junção comunicante ou junções em hiato ou nexons ou gap-junctions – são estruturas proteicas, formadas por 6 sub-unidades proteicas denominadas conexons, formadores de uma espécie de tubo proteico que atravessa a estrutura da membrana de células animais vizinhas num tecido, que permite a troca de substâncias citoplasmáticas de pequena estrutura molecular (íons, aminoácidos e nucleotídeos). Plasmodesmos – são modificações de membrana citoplasmática de células vegetais, que apresentam a forma de um tubo de comunicação citoplasmática e permitem a troca de substâncias de alto peso molecularentre células vegetais vizinhas num tecido. Interdigitações – são modificações de membrana citoplasmática, que formam um aumento de superfície de contato entre células animais vizinhas numa estrutura tecidual. Microvilosidades – são expansões digitiformes comumente encontrada em membrana citoplasmática de células intestinais, que aumentam a capacidade de absorção de substâncias neste tipo celular. 29 MÓDULO TEÓRICO 4 – MITOCÔNDRIAS E METABOLISMO CELULAR As células possuem funções comuns a todos os organismos, tais como a multiplicação, movimentação, sensibilidade, condução de impulsos e secreção. Todas estas funções dependem de gastos de energia para ocorrer. A energia celular é obtida a partir da ruptura de ligações de alta energia armazenada em compostos orgânicos. Os compostos orgânicos que fornecem energia para os seres vivos são produzidos a partir da conversão da energia solar em química, durante a fotossíntese. Os compostos energéticos mais empregados são os carboidratos, principalmente as hexoses, cujo principal exemplo é a glicose. A união de várias glicoses forma o amido, que é a principal fonte de armazenamento de energia das células vegetais, e o glicogênio dos animais. A combustão de uma molécula de glicose até CO2 e H2O libera tanta energia, que se ocorresse em uma célula diretamente esta queimaria, por isto a célula quebra a molécula de glicose progressivamente armazenando a energia obtida num composto intermediário chamado de ATP (adenosina-trifosfato). A glicose e os ácidos graxos são energia não diretamente disponível para a célula, o ATP e os compostos carreadores de íons (NAD + , FAD + ), são energias diretamente disponíveis para os processos metabólicos das células. Uma molécula-grama de glicose fornece 38 moléculas-grama de ATP e uma molécula-grama de ácido graxo (o ácido palmítico com 16 carbonos) fornece 126 moléculas-grama de ATP. O ATP possui 2 ligações ricas em energia, a quebra de cada uma delas libera 10 kcal/mol. A reação é ATPADP + Pi, isto é, adenosina difosfato + fosfato inorgânico + energia. No citoplasma esta energia é acumulada na forma de glicogênio e triglicerídios (gorduras neutras) e de metabólicos ricos em energia como o ATP, energia bem disponível. As células são ricas em ATPase que é a enzima capaz de quebrar a ligação de fosfato do ATP e liberar sua energia armazenada. A degradação da glicose libera 690 kcal/mol de energia, C6H12O6 + 6 O2 = 6 CO2 + 6 H2O + calor (em calorias). O processo de degradação de glicose celular é brando, compatível com a vida. O processo de oxidação gradual de moléculas de energia nas células é chamado de respiração celular. Existem 2 mecanismos de obtenção de energia, a glicólise anaeróbica, que ocorre na ausência de oxigênio e é uma degradação parcial da glicose e fosforilação 30 oxidativa, que inclui o ciclo de Krebs e a cadeia respiratória e depende da presença da mitocôndria para ocorrer. A fosforilação oxidativa leva a glicose até CO2 e H2O. GLICÓLISE É o processo de degradação anaeróbica da glicose, ocorre no citoplasma de todas as células e é a primeira etapa da degradação da glicose. Este processo depende de várias enzimas (10) e leva a formação de ácido pirúvico (ou piruvato) e ATP. 31 A glicose tem a formação de 4 moléculas de ATP, mas consome duas em sua etapa inicial, portanto ocorre uma produção real de 2 ATP. Além do ATP são produzidas duas moléculas de NADH e duas de piruvato. Fermentação alcoólica e fermentação lática A fermentação é um processo que ocorre quando as células não têm oxigênio disponível ou não possuem mitocôndrias. No caso do levedo de cerveja, a levedura Saccharomyces cerevisae, a fermentação tem como produto final o etanol, o piruvato é convertido a 2 moléculas de etanol + 2 CO2. Nas células musculares e em alguns microrganismos, como nas bactérias láticas, o piruvato pode ser transformado por ação de uma enzima chamada lactato desidrogenase, a ácido lático. O aproveitamento energético desta via é baixo, em relação ao potencial energético da glicose. A glicose libera apenas 5,2% do total da energia armazenada. Células mais evoluídas têm um método mais eficiente de degradação da glicose, e este método dependeu do aparecimento do oxigênio. Glicose2 piruvato + 2 NADH + 2 ATP2 Etanol + CO2 Fermentação alcoólica Glicolise álcool desidrogenase Glicose2 piruvato + 2 NADH + 2 ATP2 ácido lático Fermentação lática Glicolise lactato desidrogenase Em ambos os processos a energia do NADH formado é utilizada para a formação do etanol ou do ácido lático. FOSFORILAÇÃO OXIDATIVA CICLO DE KREBS OU CICLO DO ÁCIDO CÍTRICO O aparecimento da fosforilação oxidativa dependeu do aparecimento de oxigênio na atmosfera. As enzimas envolvidas no processo de fosforilação oxidativa são capazes de metabolizar o piruvato à CO2 e água, com alto rendimento em obtenção de energia. Este processo ocorre na mitocôndria e cada etapa tem seu lugar específico na mitocôndria para ocorrer. Este processo tem três etapas: A primeira etapa é a produção de acetil-CoA, que ocorre na matriz mitocondrial onde ocorre a transformação do piruvato em acetil CoA. Esta etapa é realizada pelas enzimas do complexo piruvato desidrogenase. Este complexo gera acetato que vai ser ligado a CoA, formando o acetil-CoA que vai entrar no ciclo de Krebs. O produto final do complexo piruvato desidrogenase é acetil-CoA, NADH e CO2, sendo que cada molécula de glicose forma 2 Acetil-CoA, 2 NADH e 2 CO2 ao passar por esta etapa. A segunda etapa é o ciclo de Krebs, ou ciclo do ácido cítrico ou ciclo dos ácidos tricarboxílicos e ocorre também na matriz mitocondrial. Nesta etapa o acetil-CoA formado vai se condensar com o oxaloacetato (ou ácido oxaloacético) formando o ácido cítrico. Esta metabólito é o primeiro do ciclo de Krebs. Ocorre então uma série de reações enzimáticas mediadas por desidrogenases que vão formar 2 GTP (que podem se transformar em ATP), 6 moléculas de NADH, 2 de FADH2 e 4 CO2. O NADH e o FADH2 (reduzidos) formados no ciclo de Krebs a partir de uma molécula de glicose vão então para a cadeia transportadora de elétrons, onde será formada a maioria do ATP celular. 32 33 Cadeia respiratória é um processo onde um conjunto de enzimas e citocromos –B, C1, C, A A3, que se localizam na membrana interna da mitocôndria, mediam a passagem de prótons entre a matriz mitocondrial e o espaço intermembranar, permitindo o acúmulo destes prótons no espaço intermembranar. O retorno destes prótons para a matriz mitocondrial é feita através da enzima ATPase e durante este processo é feita a síntese de ATP numa reação ADP + Pi ATP. No processo de transporte de elétrons na cadeia respiratória estão envolvidos três tipos de complexos enzimáticos, a NADH- Q- redutase, o QH2-citocromo c- redutase e Citocromo c oxidase. Na cadeia respiratória ocorre o consumo de O2 durante as reações de oxi- redução. Este O2 se combina com os prótons com o auxílio da citocromo oxidase e vai formar água. Na mitocôndria, o consumo de oxigênio está relacionado com a formação de ATP, sendo então chamado de fosforilação oxidativa. A mitocôndria é, então uma máquina geradorade energia muito eficiente. Cerca de 50% da energia da glicose fica na forma de moléculas energéticas (ATP e NADH), outra metade libera calor para manter temperatura do corpo. 34 MITOCÔNDRIAS As mitocôndrias são organelas com tamanho variando de 0,5 a 1m de diâmetro e de 0,5 a 10m de comprimento e sua forma e posição não são fixas. Sua posição vai depender do citoesqueleto e também de locais onde a célula possa precisar de mais energia disponível. As células que precisam de maior consumo de energia possuem maior número de mitocôndrias, por exemplo as, células musculares. Pode-se estabelecer uma relação entre o peso do tecido e a massa mitocondrial e se fazer uma correlação deste fator com a demanda de energia deste tecido. Provavelmente as mitocôndrias têm origem a partir de células primitivas, bactérias aeróbicas, capazes de produzir energia e que foram incorporadas às células eucarióticas, passando a viver dentro destas células num processo chamado de endossimbiose. Estrutura da mitocôndria A mitocôndria é formada por duas membranas, uma externa e uma interna, sendo seu interior chamado de matriz mitocondrial. A membrana externa é bem permeável, com proteínas intercaladas, as porinas. Ela é rica em colesterol, e é capaz de controlar a entrada e saída de moléculas como o ADP, ATP, aminoácidos, ácidos graxos, e outras substâncias metabolizadas na mitocôndria. Sua membrana interna apresenta composição química similar a membrana de bactérias, o que consiste num forte indício da origem das mitocôndrias. Entre as duas membranas existe um espaço chamado de espaço intermembranar, que serve de reservatório de íons e tem grande importância no processo de fosforilação oxidativa. A membrana interna é rica em enzimas e também é capaz de modular a entrada e saída de moléculas na matriz mitocondrial. A diferença de composição química entre a membrana interna e membrana externa da mitocôndria, é que a interna é rica em 35 cardiolipina (um fosfolipídio com 4 ácidos graxos), a presença deste fosfolipídio está relacionada com a passagem de íons por esta membrana. Ela possui uma série de invaginações em forma de prateleiras, que aumentam sua superfície, e são chamadas de cristas mitocondriais. Associados à superfície da membrana interna (voltada para a matriz mitocondrial) observa-se os corpúsculos elementares que são estruturas protéicas com cerca de 10nm de diâmetro, com atividade de ATP sintetase, que auxiliam no acoplamento do transporte de prótons que culmina com a síntese de ATP. A membrana interna possui mais de 60 proteínas, tais como, proteínas da cadeia respiratória, os corpúsculos elementares e proteínas do sistema de transporte ativo para a matriz mitocondrial. A matriz mitocondrial pode possuir grânulos elétrons-densos que contém cálcio (sem ainda função muito definida). Ela possui ainda as enzimas do complexo piruvato desidrogenase, as enzimas do ciclo de Krebs, as enzimas responsáveis pela oxidação dos ácidos graxos e de aminoácidos, além de DNA e ribossomos. Os procariontes não possuem mitocôndria, mas tem sua maquinaria de obtenção e metabolismo de energia acoplada a membrana das células. GENOMA MITOCONDRIAL As mitocôndrias possuem genoma próprio, mas incompleto, isto é, não contém todas as informações necessárias para a produção de uma mitocôndria totalmente ativa. Seu código genético é diferente do universal, já que possui bases nitrogenadas diferentes daquelas encontradas no núcleo. O DNA das mitocôndrias tem origem essencialmente materna, já que o óvulo humano possui milhares de moléculas de DNA mitocondrial, enquanto o espermatozóide possui apenas centenas delas, contribuindo pouco para a definição do genótipo da mitocôndria. O DNA mitocondrial se arranja em anéis de cadeia dupla, existindo várias cópias por mitocôndria. A maioria das proteínas mitocondriais é sintetizada no citoplasma celular, migrando depois para a mitocôndria. O genoma das mitocôndrias é pequeno, possuindo 37 genes codificantes de ATP-sintetase, citocromo bc1, citocromo oxidase. As mitocôndrias são consideradas unidades auto-reprodutivas, sendo este mais um forte indício de sua origem. Foi observado que as mitocôndrias quando colocadas isoladas em meio ideal são capazes de se duplicarem “in vitro”. 36 MÓDULO TEÓRICO 5 - ENDOMEMBRANAS, SECREÇÃO E DIGESTÃO CELULAR 37 38 As endomembranas da célula são: a membrana nuclear, o retículo endoplasmático liso (REL) e rugoso (RER), complexo de Golgi e também os lisossomos, peroxissomos e glioxissomos. Estas outras organelas celulares têm origem da membrana plasmática e também podem ser derivadas umas das outras. Todas elas são envoltas de uma membrana fosfolipídica e cada uma delas tem uma função específica nas células. O sistema de endomembranas está envolvido em processos como: segregação, associação de sistemas enzimáticos, manutenção de gradientes iônicos, diferenças de pH no citoplasma, síntese protéica e modificação de proteínas. O envoltório nuclear ou membrana nuclear ou carioteca: Esta estrutura originou-se de invaginações da membrana plasmática e envolveu o DNA das células, isolando-o do resto do citoplasma. O envoltório nuclear é formado de uma membrana dupla com uma face em contato com a cromatina e a outra com o citoplasma. O envoltório nuclear é interrompido por poros nucleares que são complexos protéicos inseridos na membrana do envoltório, que controlam a entrada e saída de substâncias do núcleo. O retículo endoplasmático: Esta estrutura está intimamente associada ao envoltório nuclear e varia de forma e tamanho dependendo do tipo e função celular. Ele é escasso e pouco denso em células não diferenciadas ou embrionárias e bem desenvolvido em células onde a síntese protéica é bem ativa. O retículo endoplasmático está dividido em dois tipos, o retículo endoplasmático rugoso e o retículo endoplasmático liso. O retículo endoplasmático rugoso contém uma série de ribossomos em sua superfície, que dão aspecto rugoso a esta estrutura quando observada em microscópio eletrônico. Os ribossomos são ricos em RNA, formando no citoplasma regiões basófilas, chamadas de ergastoplasma, esta região basófila é identificada como sendo um sítio de síntese protéica. Os ribossomos estão unidos ao RE pela subunidade maior (60S), a partir de interações eletrostásticas. Esta interação depende da ação de duas proteínas, as riboforinas I e II. O RER é um dos principais responsáveis pela síntese protéica das células, estando envolvida na biossíntese de proteínas encontradas em membranas celulares. Direcionamento da síntese protéica para o RER 39 As proteínas podem ser produzidas em dois locais da célula: nos ribossomos livres do citoplasma e no RER pelos seus ribossomos associados. As proteínas produzidas nos ribossomos livres são direcionadas para 4 lugares nas células: mitocôndrias, cloroplastos, núcleo ou peroxissomos. Já as proteínas produzidas no RER vão para a membrana plasmática, podem ser secretadas ou vão para os lisossomos. As proteínas a serem produzidas no RER, contêm um códon de sinalização que codifica para um peptídeo sinal, que fica localizado logo após ocódon de inicialização (AUG). A síntese protéica, de qualquer proteína, sempre se inicia a partir da ligação do RNAm com um ribossomo livre que inicia a leitura deste e a formação da proteína. A primeira seqüência peptídica formada é uma chamada de peptídeo sinal. Este peptídeo de sinalização é composto de 20 a 30 aminoácidos, e tem como função o reconhecimento das proteínas a serem sintetizadas no RER. Além do peptídeo sinal, existe uma proteína no citoplasma chamada de proteína de reconhecimento do sinal (PRS), que se acopla ao peptídeo sinal e paralisa a síntese protéica. Esta proteína leva o ribossomo e o RNAm para a membrana do RER. Após este reconhecimento a proteína reconhecedora de sinal é liberada e volta para o citoplasma. A síntese protéica recomeça com a proteína sendo sintetizada para dentro do lúmen do RER. Após esta síntese o peptídeo sinal é retirado por uma enzima do RER chamada de sinal peptidase. Funções do REL O retículo endoplasmático liso é formado por vesículas que provém da evaginação do RER. Eles não possuem ribossomos associados e contém proteínas produzidas no RER. Existe grande quantidade de REL em células ricas em glicogênio (ex: fígado), nestas células algumas vesículas do REL contém enzimas como a glicose-6- fosfatase que auxiliam na degradação do glicogênio. As vesículas do REL podem estar relacionadas com a manutenção de gradientes iônicos intracelulares, como o observado no retículo sarcoplasmático (nas fibras musculares), onde armazenam cálcio. Elas também estão envolvidas no transporte de substâncias no interior das células (a partir da circulação das vesículas), este sistema pode transportar partículas, íons, no interior das células e para fora das células, levando proteínas do RER para outros lugares das células. As vesículas do REL podem também participar do processo de detoxificação quando, por exemplo, grandes quantidades de drogas são administradas a um animal, há um aumento de produção de enzimas detoxificantes e observa-se uma hipertrofia do REL. O retículo liso está diretamente relacionado com a síntese de lipídios das células. Microssomos: A partir de processos da lise celular e centrifugação diferencial, pode-se obter uma fração celular que contém as vesículas do retículo endoplasmático, que são chamadas de microssomos. Estes microssomos podem ser diferenciados pela presença ou não de ribossomos associados (as densidades são diferentes e eles têm um coeficiente de precipitação diferente). Os microssomos constituem cerca de 15 a 20% da massa total da célula hepática, estes microssomos hepáticos contém cerca de 50% do RNA celular. Foi observado que os microssomos contém enzimas de síntese de triglicerídios, fosfolipídios e colesterol. O citocromo P-450 está presente no REL de células hepáticas e é utilizado para detoxificar ou inativar substâncias. 40 O complexo de Golgi O aparelho (ou complexo) de Golgi está localizado entre o REL e a membrana plasmática, e participa ativamente do transporte de substâncias que são produzidas no RER e liberadas ou não para fora da célula. Ele é formado de unidades chamadas de dictiossomos (ou golgiossomos), que são grupos de sistemas discóides empilhadas e achatadas. Ele possui também uma série de vesículas menores que chegam aos dictiossomos pela face cis e de vesículas maiores que saem do complexo por sua face trans. O complexo de Golgi é constituído por três elementos: sáculos ou cisternas achatados (golgiossomos ou dictiossomos), um grupo de túbulos ou vesículas menores e os vacúolos maiores, que são preenchidos por uma substância amorfa e agranular. As cisternas do complexo se dispõe em pilhas paralelas, com um espaço entre elas de cerca de 20 a 30 nm. Cada uma das pilhas possui uma face cis e uma trans. A face cis (face pré-golgiana), que é convexa e está localizada próxima ao envoltório nuclear ou ao REL e a face de maturação ou face trans (pós-golgiana), côncava, que libera as vesículas secretórias grandes. Este tipo de arranjo espacial é chamado de eixo cis-trans. No aparelho de Golgi existem proteínas características que estão relacionadas com a transferência de oligossacarídios às proteínas para a formação de glicoproteínas. Estas proteínas são enzimas chamadas de glicosiltransferases. Existem também proteínas relacionadas com a sulfatação dos glicosaminoglicanos dos proteoglicanos e com a fosfatação de proteínas. O aparelho de Golgi teria, então, como funções principais mediar o trânsito entre as proteínas sintetizadas no RER e ser o sítio de modificação destas durante este transporte, até sua secreção da célula. 41 Controles de secreção celular Os processos de secreção celular estão intimamente ligados com as atividades do RE e do aparelho de Golgi. A produção e secreção de proteínas pelas células podem ser feitas de modo contínuo, o produto é secretado logo após sua produção, ou pode ser feita de modo descontínuo, onde os grânulos com o material produzido pela célula são armazenados em seu citoplasma. O destino final das proteínas sintetizadas no RER e modificadas no aparelho de Golgi pode ser: para o exterior das células, incorporação nos compartimentos intracelulares (lisossomos) ou aderirem ou serem incorporadas as membranas plasmáticas. 42 As proteínas sintetizadas no RER passam por várias etapas desde sua produção até sua secreção pela célula: ribossômica, cisternal, de transporte, acúmulo intracelular e exocitose. Ribossômica e cisternal Ocorre a síntese pelos ribossomos no RER. No caso proteínas a serem secretadas atravessam a membrana e crescem para a luz do RER, que pode formar vesículas de transporte do REL. Transporte destas proteínas do RE para o aparelho de Golgi As proteínas a serem secretadas se difundem pelo RER, entram nos elementos de transição nos limites entre o RER e o aparelho de Golgi. Estas vesículas se fundem com as cisternas maiores do aparelho de Golgi, situadas na face de maturação ou face cis. Acúmulo intracelular e exocitose Ocorre o acúmulo dos produtos de secreção nos chamados grânulos secretores, que serão liberados quando de um estímulo externo (ação de um hormônio ou neurotransmissor). Esta liberação de grânulo pela célula é chamada de exocitose e requer energia, na forma de ATP, para se processar. Após a exocitose a membrana das vesículas secretoras é prontamente recuperada por um processo de reciclagem. Neste processo a membrana volta para a região do aparelho de Golgi (no caso de membranas recobertas com clatrina) ou podem ser internalizadas e transferidas para os lisossomos, neste caso a exocitose está correlacionada com o processo de endocitose. Lisossomos Os lisossomos são vesículas localizadas no citoplasma que contém enzimas digestivas, chamadas de hidrolases ácidas. Cada lisossomo é envolvido por uma unidade de membrana. Os lisossomos existem em todas as células eucariontes. A sua constituição enzimática é variável e vai depender da especialidade da célula. Na membrana dos lisossomos existe uma proteína que bombeia prótons (H + ) para seu interior, a fim de manter o pH dos lisossomos ideal para a atividade enzimática, pH em torno de 5. As principais enzimas dos lisossomos são a DNAse, a RNAse, a lipase, a fosfolipase, as proteases e as glicosidases. Os lisossomoscom restos de material hidrolisado são chamados de corpos residuais. Estes corpos residuais podem ou não ser exocitados pelas células. Em células de vida longa se acumulam no citoplasma. Em células que não se duplicam estes corpos residuais se acumulam e formam os grânulos de lipofuscina. Alguns defeitos genéticos podem levar a um acúmulo de corpos residuais (lisossomos sem glicosidase por exemplo) nas células. Funções dos lisossomos: As principais funções dos lisossomos são a autofagia e a digestão intracelular. A autofagia é a degradação de parte do citoplasma, ou de organelas das células como as mitocôndrias pelas enzimas do lisossomo. Neste processo são formados os vacúolos autofágicos ou autofagossomas. Este processo é importante para a remoção de organelas de vida curta (menor que a da célula) e está também relacionado com a renovação celular no processo de morte celular programada ou apoptose. 43 Os lisossomos participam também do processo de digestão intracelular, onde as vesículas contendo partículas endocitadas (fagocitadas ou pinocitadas) se associam aos lisossomos para terem seu conteúdo digerido. Os lisossomos podem se unir à membrana plasmática e liberar seu conteúdo para o meio externo, num processo chamado de exocitose, que pode ser também chamado de clasmocitose. Peroxissomos: Os peroxissomos são vesículas formadas a partir do REL. Estas vesículas contêm, além de proteínas produzidas no RER, proteínas que foram produzidas nos ribossomos livres das células. Eles contêm uma série de enzimas chamadas de oxidases, tais como a urato-oxidase, a d-aminoácido oxidase. Estas vesículas estão também envolvidas no processo de detoxificação das células e no metabolismo de lipídios. Sua principal enzima componente é a peroxidase ou catalase, que quebra o peróxido de hidrogênio (água oxigenada), formada pela oxidação das moléculas pelas enzimas dos peroxissomos em água mais oxigênio. Glioxissomos: São vesículas com a mesma origem dos peroxissomos, que contêm enzimas do tipo oxidases, mas são exclusivos das células vegetais. Estas vesículas participam do ciclo do glioxilato, onde os vegetais metabolizam lipídios para formar açúcares. Este ciclo não ocorre nas células animais. 44 MÓDULO TEÓRICO 6 - CITOESQUELETO E OS MOVIMENTOS CELULARES As células têm formato irregular e são capazes de assumir as mais diversas formas de acordo com a função que desempenham no organismo. Como por exemplo: os neurônios ou células nervosas que possuem longos prolongamentos. As organelas celulares têm também posição definida no citoplasma de acordo com o tipo celular, sendo esta associação mantida por interações entre as organelas celulares e o citoesqueleto. O citoesqueleto seria a estrutura capaz de desempenhar um papel mecânico de sustentação da forma celular e da posição das suas organelas componentes. Este citoesqueleto teria capacidade de se modificar permitindo os movimentos celulares, permitindo não só os movimentos celulares externos, emissão de pseudópodos, como o também de organelas no interior das células. Os principais componentes celulares do citoesqueleto são proteínas que foram agrupadas em 3 grupos, os microtúbulos, os microfilamentos e os filamentos intermediários. Os microtúbulos 45 Os microtúbulos estão presentes no citoplasma de todas as células eucariontes. São moléculas com cerca de 25 nm de diâmetro, de comprimento variável, sendo uma molécula retilínea. Eles são formados pela proteína tubulina. Esta proteína é um heterodímero composto de - e -tubulina. Estes polipeptídeos são muito semelhantes quimicamente, e estão fortemente unidos entre si. A tubulina é, então, um dímero de alfa e beta tubulina com tamanho de cerca de 120000 Daltons. Os microtúbulos são arranjados a partir de dímeros de tubulina, sendo este um processo coordenado por enzimas e controlado de acordo com as necessidades celulares do momento. O tamanho dos microtúbulos é controlado por uma polimerização local dos dímeros de tubulina. A extremidade onde estes dímeros são acrescentados é chamada de extremidade positiva e onde eles são retirados por um processo de despolimerização, de extremidade negativa. O citoplasma da célula contém dímeros de tubulina livres que podem ser acrescentados ao microtúbulo, sem necessidade de uma síntese proteica concomitante. A polimerização dos dímeros de tubulina é dependente da concentração de íons cálcio no citoplasma da célula, a polimerização provocada por estes íons é chamada de resposta rápida e é de curta duração. Esta polimerização é dependente de GTP, e consome energia para se formar, hidrolizando o GTP a GDP. Além do controle pelos níveis de cálcio, a polimerização da tubulina pode também ser controlada pelas chamadas proteinas associadas aos microtúbulos ou MAPs (Microtubes Associated Proteins). As MAPs são proteínas de alto peso molecular que interferem na formação de microtúbulos. Elas estão relacionadas a processos de polimerização mais estáveis ou duradouros dos microtúbulos. Os componentes dos cílios e flagelos são muito estáveis, os do fuso acromático são transientes, e os do citoplasma celular têm vida muito mais curta. Origem dos microtúbulos As células possuem os centríolos e os corpúsculos basais a partir de onde o processo de polimerização dos microtúbulos parece ser orientado. Cada célula possui um par de centríolos, que se localiza próximo ao núcleo e ao aparelho de Golgi, numa região chamada de centrossoma ou centro celular. O centrossoma é um MTOC (Microtubes Organizer Center), ou seja, centro organizador de microtúbulos. Estudos com inibidores do crescimento de microtúbulos demonstram que estes são formados a partir da proximidade do núcleo, em pontos focais correspondentes as regiões dos centrossomas ou centrosferas (lugar onde está contido o centríolo). Proteínas motoras associadas aos microtúbulos: Foram descobertos em diversos tipos celulares, proteínas motoras, com 2 componentes, os adaptadores que se unem à molécula a ser carreada e os componentes motores, que se prendem a uma extremidade dos adaptadores. Estes motores podem 46 deslizar pelos microtúbulos carregando a partícula ao longo destas estruturas, este transporte de estruturas é dependente da energia do ATP. Foram descritas 2 proteínas motoras, as dineínas que vão da extremidade + para a – dos microtúbulos e as cinesinas que movimentam as partículas em direção oposta (- para +). Drogas que interferem na formação do microtúbulos A primeira droga utilizada foi a colchicina, ela foi estudada na paralisação da mitose na metáfase. Esta droga se liga aos dímeros de tubulina e causa o desaparecimento dos chamados microtúbulos menos estáveis, principalmente os formadores do fuso acromático ou mitótico. Ela age formando um complexo colchicina- tubulina, que quando é adicionado ao microtúbulo, impede a adição de novos dímeros na extremidade positiva. Esta droga impede apenas a polimerização, não bloqueando a despolimerização fazendo com que o microtúbulo se desintegre. A colchicina não atua nos microtúbulos de cílios e flagelos, talvez devido a presença das proteínas MAPs neste tipo de microtúbulos. Outra droga utilizada é o Taxol. Ele tem feito contrário da colchicina, estabilizando a formação dos microtúbulos, impedindo sua despolimerização. A tubulina livre do citoplasma é toda incorporada nos microtúbulos. O taxol vem sendo empregado no tratamento
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