Genética molecular RESUMÃO

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João Marcos de Oliveira
Genética molecular
3 experimentos clássicos que demonstram que o DNA é o material genético:
 Grifith: utilizando uma bactéria letal para camundongos, mostrou que uma variante não patogênica da bactéria poderia tornar-se patogênica se entrasse em contato com uma variante patogênica morta pelo calor. Portanto, as bactérias mortas liberam algum fator no meio capaz de transformar uma bactéria não patogênica em uma bactéria patogênica. O experimento de Grifith não demonstrou qual componente é responsável por transformar a patogenicidade da bactéria, mas evidenciou a possibilidade de Transformação.
 Avery: demonstrou que a capacidade transformante das bactérias seria perdida caso o DNA estivesse destruído (por enzimas DNases). Pode-se concluir com esse experimento que o DNA é o agente responsável pelo desenvolvimento da capa de polissacarídeo que protege a bactéria e pela patogenicidade da mesma. 
 Hersey e Chase: trabalhando com o fago T2, demonstraram o papel do DNA na produção de novos fagos durante o processo infeccioso. Os pesquisadores marcaram radioativamente os componentes proteicos. Tal experimento confirmou o que foi dito por Avery e também demonstrou que nos vírus, é o DNA e não as proteínas que são o material genético.
Porque as proteínas não podem ser o material genético?
O DNA é mais instável e se auto replica; as estruturas das proteínas são muito complexas; é necessário uma maquinaria muito grande para sintetizar as proteínas; aminoácidos são muito parecidos estruturalmente.
O que é DNA?
Polímero linear de nucleotídeos mantidos unidos por ligações fosfodiester. O DNA e o RNA armazenam informações e devem estar de acordo com as seguintes contribuições: as informações devem ser estável por um longo período; deve ser decodificada: transcrição e posteriormente a tradução; devem ser acessível a proteínas que alteram sua função; a progenia deve conter o mesmo conjunto de instruções da célula original.
 Erwin Chargaff mostrou que a quantidade das bases nucleotidicas são variadas nos diferentes organismos e que as quantidades de bases estão relacionadas. Concluiu-se que: a composição das bases varia de acordo com a espécie; tipos de DNA de tecidos isolados da mesma espécie possuem a mesma composição de bases; a composição das bases não se altera com a idade, mudança ambiental ou estado nutricional; Adenina = Timina e Citosina = Guanina. Entre Adenina e timina formam se 2 pontes de hidrogênio e entre Citosina e Guanina formam se 3.
Em 1953, Watson e Crick postularam um modelo tridimensional para a estrutura do DNA: duas cadeias helicoidais de DNA que se enrolam ao redor do mesmo eixo formando um dupla hélice que gira no sentido da mão direita. As duas cadeias de fitas são antiparalelas, suas ligações fosfodiester 5’3’ correm em direções opostas. As duas fitas da cadeia não são idênticas nem na composição nem no número de bases, elas são complementares entre si.
REPLICAÇÃO DO DNA
O processo de replicação do DNA (fazer uma cópia da fita) começa pela separação das duas fitas e posteriormente a síntese de uma fita complementar para cada uma. Existem algumas formas espaciais na qual a estrutura do DNA pode se arranjar, na qual a forma “B” é a mais estável. Algumas variações dependentes das sequências de bases nitrogenadas foram detectadas e podem ter funções importantes locais no metabolismo do DNA. Por exemplo, algumas estruturas causam curvatura na hélice do DNA, como a estrutura Grampo.
Existem enzimas importantes que degradam ao invés de sintetizar o DNA, pois esta degradação é importante para todos os processos. Estas enzimas são as nucleases ou DNases. Elas são divididas em duas grandes categorias: as exonucleases, que degradam DNA a partir de uma extremidade da molécula (a partir da extremidade 5’>3’ ou da extremidade 3’>5’) e as endonucleases, que agem no interior dos ácidos nucleicos, reduzindo-os em fragmentos menores.
A replicação do DNA é governada por um conjunto de regras fundamentais. A replicação é semiconservativa, ou seja, cada fita servira de molde para uma nova fita, resultando em duas novas moléculas de DNA, cada uma com uma fita nova e uma fita velha. Essa hipótese foi provada pro experimentos por Matthew Meselson e Franklin Stahl.
A síntese de DNA prossegue na direção 5’>3’ e é sem descontínua. Isso se dá pelo fato de que as duas fitas de DNA são antiparalelas e a fita que atua como molde está sendo lida sua extremidade 3’>5’
Se a síntese prossegue sempre na direção 5’>3’, como podem duas fitas serem sintetizadas simultaneamente? Esse problema foi resolvido por Reiji Okazaki nos anos 60. Okazaki descobriu que uma das novas fitas de DNA é sintetizada em pedações curtos, agora chamados de Fragmentos de Okazaki, e esse trabalho concluiu que uma fita é sintetizada continuamente e outra fita é sintetizada descontinuamente. A fita continua (ou líder) é aquela onde a síntese prossegue na direção 5’>3’ na mesma direção do movimento da forquilha de replicação. A fita descontinua (ou atrasada) é aquela onde a síntese 5’>3’ prossegue na direção oposta a direção do movimento da forquilha.
O DNA É SINTETIZADO PELA DNA POLIMERASE
Artur Kornberg iniciou uma procura para encontrar uma enzima sintetizadora de DNA em 1995, que resultou no descobrimento da cadeia polipeptídica única, que tardiamente seria denominada DNA polimerase I. Ao encontrarem tal enzima, os pesquisadores estabeleceram os requisitos necessários para que tal enzima pudesse realizar suas funções: primeiro, é necessário uma fita molde, para que as reações de polimerização possam ser feitas, seguindo as regras de pareamento já estabelecidas por Watson e Crick. Após isso, um Iniciador (fragmento de fita nova complementar ao molde) é requerido. Tal iniciador possui um grupo hidroxila na extremidade 3’ na qual os nucleotídeos podem ser adicionados. A extremidade 3’ é chamada de terminal do iniciador. Ou seja, a parte nova da fita deve estar no lugar, a polimerase pode apenas adicionar nucleotídeos a uma fita preexistente. Depois que um nucleotídeo for adicionado a uma fita crescente de DNA, a DNA polimerase deve se dissociar ou se mover ao longo do molde e adicionar outro nucleotídeo.
Um movimento essencial a todas as polimerases é uma atividade denominada “atividade exonucleasica 3’5’” Essa atividade permite a enzima remover um nucleotídeo recém adicionado e é altamente especifica. Se um nucleotídeo errado for adicionado, a translocação da polimerase para a posição onde o nucleotídeo seguinte deve ser adicionado é inibida. A atividade exconucleasica 3’5’ remove o nucleotídeo despareado e a polimerase ocorre novamente.
Além da polimerase I, descobriu-se em E.coli outras duas polimerases: polimerase II que é muito mais completa e tem função de reparo de DNA, e a polimerase III, que é a enzima primaria na replicação em E.coli.
Para ganhar acesso as fitas de DNA que vão funcionar como moldes, as duas fitas tem que ser separadas, e isso ocorre devido as enzimas Helicases, que se movem ao longo das fitas separando-as utilizando a energia dos ATPs. Essa separação das fitas cria um estresse topológico na estrutura do DNA, tal estresse é aliviado pela enzima Topoisomerases. Os iniciadores devem estar presentes ou sintetizados antes que o DNA polimerases possa sintetizar o DNA. Os iniciadores são depositados por enzimas chamadas Iniciases.
A síntese de DNA pode ser dividia em 3 etapas: Iniciação, Alongamento e Terminação. 
Iniciação: a origem da replicação em E.coli, chamado de OriC, consiste em 245 pares de bases. As sequências chaves para essa discussão são duas serie de repetições curtas, três repetições de 13 pares de bases e quatro repetições de uma sequência de 9 pares de bases. Pelo menos 8 enzimas ou proteínas diferentes participam na fase de iniciação da replicação. Elas abrem a hélice do DNA na origem e estabelecem um complexo pré iniciação que consolida a etapa para as reações sequentes. O componente chave no processo de iniciação é a proteína DNaA.A proteína DNaB então se liga a uma região numa reação que requer a proteína DNaC. A DNaB é uma helicase que desenrola o DNA bidireccionalmente criando duas forquilhas de replicação potenciais. A replicação do DNA deve ser precisamente regulada de forma que ocorra apenas uma vez a cada ciclo celular. A iniciação é a única fase da replicação que é regulada.
Alongamento: essa fase consiste em dois partes que são aparentemente semelhantes que são mecanicamente bem diferentes: a síntese da fita líder e a síntese da fita atrasada. 
Síntese da fita líder: a síntese da fita líder começa com a iniciase (enzima que deposita os iniciadores) de um RNA iniciador curto na origem da replicação. Desoxirribonucleotídeos são então adicionados a este iniciador pela DNA polimerase III. Assim começada, a síntese da fita líder prossegue continuamente mantendo ritmo com a forquilha de replicação.
Síntese da fita atrasada: a síntese da fita atrasada, deve ser realizada por fragmentos curtos (fragmentos de Okazaki), sintetizadas na direção oposta ao movimento da forquilha, é um problema mais intrincado. Ele é resolvido por uma maquinaria proteica que incorpora várias proteínas especializadas, além da polimerase III. Cada fragmento deve ter o seu RNA iniciador próprio, sintetizado pela iniciase. O aparato regulatório responsável pela síntese da fita atrasada é chamado de Iniciossomo. O iniciossomo move-se ao longo do molde da fita atrasada na direção 5’>3’. A medida que se move, o iniciossomo força a iniciase a sintetizar um RNA iniciador curto de 10 a 60 residuos ao qual é então adicionado DNA pela DNA polimerase III. Quando o novo fragmento de Okazaki estiver completo o RNA iniciador é removido pela DNA polimerase I, usando a atividade exonucleasica 5’>3’ e é substituída com DNA pela mesma enzima. Ao final, o corte remanescente é selado pela DNA ligase.
Terminação: pouco sabe-se sobre essa etapa, mas sabe-se que a topoisomerase IV parece ser bastante necessária para a separação final das duas moléculas de DNA circulares completas.
Replicação em Eucariotos
O mecanismo de replicação em eucariotos é o mesmo, o que muda são algumas enzimas e processos.
Telomero e Telomerase
A estrutura linear do cromossomo eucarionte permite uma maior rapidez na recombinação e ação que no cromossomo circular do procarionte, promovendo benefícios para a geração da diversidade biológica. O telômero é uma importante estrutura presente nas extremidades de todos os cromossomos humanos, mais especificamente na proliferação das células. O DNA telomerico consiste de 100 a 1000 repetições e tendem a sequência especifica TTAGGG. A enzima DNA polimerase, responsável pela replicação do DNA eucariótico é incapaz de incorporar o trecho final de DNA linear, com isso a cada divisão são perdidos aprox. 100 pares de bases. Não somente os telômeros protegem o material genético da perda durante a divisão celular como também servem como um “relógio mitótico”, dizendo para as células a hora de parar a divisão. 
O encurtamento telomerico e o consequente envelhecimento celular é evitado na presença de uma enzima chamada Telomerase. Seu papel nas células é adicionar bases aos terminais 3’ do DNA molde. Esse prolongamento do filamento molde permite a síntese ininterrupta do DNA do filamento descontinuo pela atividade normal do complexo.
Quando a telomerase atua sobre a extremidade 3' do telômero, ela estende apenas essa extremidade do cromossomo. Como é estendida a extremidade 5'? A resposta é: pela maquinaria de replicação do DNA da fita tardia. Ao produzir uma extensão na extremidade 3', a telomerase fornece um molde adicional para a atuação da maquinaria de replicação da fita tardia, a qual pode, então, estender a extremidade 5' do DNA.
Processamento de RNA
A sequência codificante de um gene é uma serie de códons compostos por 3 nucleotídeos (trincas) que especifica a sequência linear dos aminoácidos no produto polipeptidico. Até aqui, consideramos que a sequência codificante é continua: o códon correspondente a um aminoácido está imediatamente adjacente ao códon do aminoácido seguinte, na cadeia polipeptídica. Entretanto, nem sempre é verdade para os genes eucarióticos. Nesses casos, a sequência codificante é periodicamente interrompida por segmentos com sequências não codificantes.
Muitos genes eucariontes são compostos por blocos com sequências codificantes separados por blocos com sequencias não codificantes. As sequências codificantes são chamadas Éxons e as sequências não codificantes são chamadas Introns.
A partir do promotor, gera o pré-mRNA, que contém todos os éxons e introns.
Os introns são retirados do pré-mRNA por meio de um processo chamado processamento de RNA (SPLICING) unindo assim os éxons, e formando o mRNA maduro, que continua a ser modificado e é exportado para o núcleo, onde pode ser traduzido em um produto proteico.
A química do processamento é realizado através de duas reações sucessivas de transesterificação, nas quais as ligações fosfodiester do pré-mRNA são elevadas, e novas ligações são formadas. A primeira reação é desencadeada pela 2’-OH da adenina conservado sitio de ramificação, que ataca o fosfato do resíduo G conservado no sítio de processamento. Na segunda reação, o éxon 5’ reverte seu papel e se torna um nucleofilico que ataca o grupo fosfato no sitio de processamento 3’.
O que garante que o processamento vá na direção correta? *A reação pra frente envolve um aumento da entropia – uma molécula de pré-mRNA é separada em duas moléculas. O mRNA e o laço liberado. *O intron removido é degradado logo após sua exclusão, não está disponível para participar da reação reversa.
A maquinaria do Spliciossomo
As reações de transesterificação são promovidas por uma grande “máquina” molecular chamada Spliciossomo. Este complexo compreende cerca de 150 proteinas e 5 RNAs. Para realizar o processamento, mesmo que apenas uma reação, o spliciossomo hidrolisa várias moléculas de ATP. Muitas das funções do spliciossomo são realizadas pelo RNAs que compõem e não pelas proteinas. São esses RNAs que localizam os elementos nas fronteiras entre introns e éxons, e provavelmente participam da catálise da reação de processamento. Os 5 RNAs (U1,U2,U3,U4 e U5) são chamados de RNAs nucleares pequenos (snRNAs), e cada um deles possuem entre 100 a 300 nucleotideos e esta complexado a varia proteinas. Esses snRNAs desempenham 3 funções no processamento: eles reconhecem o sitio de processamento 5’ e o sitio de ramificação; unem esses sítios quando necessários e catalisam a clivagem do RNA e as reações de religação.
RNA mensageiro (mRNA) - codifica a sequência de aminoácidos de um ou mais polipeptídios especificados por um gene ou conjunto de genes.
RNA transportador (RNAt) – lê a informação contida no mRNA e transfere o aminoácido apropriado para um peptídeo que está sendo sintetizado durante a síntese proteica. É estável.
RNA ribossomal (RNAr) – são constituintes dos ribossomos, a complexa maquinaria onde as proteinas são sintetizadas. É estável e o mais abundante na célula.
TRANSCRIÇÃO
A transcrição é a síntese de RNA a partir do DNA, sendo assim chamada de síntese DNA-dependente. É mais seletiva que a replicação por meio dos house-keeping, genes e inducible genes. Para a célula, é mais importante ter uma precisão maior na replicação do que na transcrição. O DNA é a molécula que armazena o material genético e a replicação do DNA é o processo de transmissão desse material genético. Qualquer erro durante esse processo poderá ser catastrófico.
RNA POLIMERASE
As RNAs polimerases são compostas por subunidades. Nas bactérias, são encontradas apenas uma RNA polimerase, enquanto que nas células eucarióticas são encontradas 3: RNA polimerase I, II e III. A principal e mais estudada é a RNA polimerase II, porque ela é a responsável pela transcrição na maioria do gene. 
O RNA sintetizado tem de ser antiparalelo a fita molde de DNA.
A polimerase abre as fitas de DNA rompendo as ligações de hidrogênio, e após a transcrição,fecha as duas fitas. O RNA, durante sua síntese, fica em contato com 8 a 10 bases do DNA molde. Os nucleotideos são ligados na extremidade 3’ do RNA, na região do sitio catalítico do RNA polimerase. A fita molde portanto, é sempre a fita 3’>5’.
TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTOS
Para que possa ocorrer o início da síntese, é preciso que se encontre a região promotora (região de início) no gene, O reconhecimento dessa região nos procariontes depende uma proteína de transcrição específica denominada fator sigma. A região promotora desses genes apresenta duas sequências para o reconhecimento que se localizam a -10 e -35 nucleotídeos contados a partir do ponto inicial da transcrição. Nos procariontes (bactérias e arqueobacterias) existe somente um tipo de RNA polimerase (ao contrário dos eucariontes), que podem ser encontradas de duas formas: apoenzima e holoenzima. A holoenzima é dotada de fator sigma, enquanto a apoenzima não o possui.
O fator sigma permite que a holoenzima RNA polimerase reconheça a região promotora dos genes que serão transcritos e estabeleça uma forte ligação à molécula de DNA. No entanto, esse fator, embora auxilie no reconhecimento do promotor, torna mais difícil a atividade da enzima, por isso, depois que a região promotora é reconhecida e a ligação com o DNA é dada, a holoenzima se separa do fator sigma, transformando-se em apoenzima, que, por sua vez, é capaz de desenvolver a síntese normalmente. Sendo assim, a holoenzima reconhece os genes que passarão pelos mecanismos da transcrição e estabelece uma ligação com o DNA, enquanto a apoenzima se responsabiliza pela síntese do RNA.
COMO E ONDE A RNA POLIMERASE INICIA A TRANSCRIÇÃO DE UM GENE?
 A transcrição se inicia em pontos específicos chamados promotores. Estes dão a orientação para a síntese ocorrer. A região -10 do DNA é rica em timinas e adeninas, conhecidas por TATA Box sendo mais facilmente aberta em comparação com as ligações de guaninas com citosinas.
A região entre -35 e -10 interfere na “força” do promotor, devido a sua sequência de bases. Isso ocorre porque a região é a que se liga a RNA polimerase. A região +1 é conhecida como ponto de início e o códon AUG, como Start códon.
Assim que a polimerase reconhece a região promotora, ela abre a bola de transcrição, não sendo necessário um primer. Após o reconhecimento, o fator sigma se desprende da polimerase, por não possuir afinidade por sítios comuns.
A bactéria E.coli usa fatores Sigma alternativos para responder as mudanças ambientais (variação do produto na transcrição e consequentemente, da tradução de proteinas). A transcrição e a tradução em procariontes são acopladas, pois não há compartimentos.
COMO E ONDE A RNA POLIMERASE TERMINA A TRANSCRIÇÃO DE UM GENE?
A maioria das terminações independentes possuem duas características distintas: a 1° é uma região cujo transcrito de RNA possui sequencias auto complementares, permitindo a formação de um grampo. A 2° é um colar curto de Adenilatos na fita molde, que é transcrito em uridilatos na extremidade 3’ do RNA. Quando a polimerase chega a um sitio de terminação com essa estrutura, ela faz uma pausa. A formação da estrutura grampo na RNA pode romper interações importantes entre o RNA e a RNA polimerase, facilitando a dissociação do transcrito. A estrutura grampo só atua como um terminador eficiente quando for seguido por um segmento de pares de bases A:U, pois a ligação entre eles é mais fraca e serão mais facilmente rompidos pela RNA polimerase.
Transcrição em Eucariotos
O processo de transcrição é idêntico. Existem, porém, algumas diferenças na maquinaria usada em cada caso. Uma delas é a diferença em relação ao número de polimerases, sendo que em procarióticos há só a polimerase I, enquanto em eucariotos há as polimerases I, II e III. Além disso, enquanto as bactérias necessitam apenas do fator sigma para o início da transcrição, os eucariotos necessitam de vários fatores, chamados de Fatores Gerais da Transcrição, que são requeridos na síntese de qualquer mRNA e formam o complexo basal de transcrição. 
Completo Basal de Transcrição – O fator de transcrição da RNA polimerase II é o TFIId, sendo o primeiro que liga-se ao DNA na região do TATA box. É um conjunto de TBP (tata binding proteins) e TAFs (TBB associated proteins).
TFIId – reconhece o TATA box e recruta TFIIa e TFIIb
TFIIb – estabiliza a ligação de TBP e recruta a RNA polimerase II. 
TFIIa – estabiliza a ligação TBP e TAFs. Nem todo gene possui esta proteína.
TFIIf – traz consigo RNA polimerase, facilita o reconhecimento do promotor e estimula a elongação.
TFIIh – tem função de helicase e fosforila a RNA polimerase. Também funciona como reparador. É ATP dependente.
TFIIe – RECRUTA TFIIh, estimula sua atividade helicase e ativa o melting do promotor.
Questões
Como é reconhecido o ponto exato do início da transcrição em procariotos? Como é esta região?
O ponto exato do início da transcrição são chamados promotores. Estes dão a orientação para a síntese ocorrer. A subunidade sigma da polimerase é a que reconhece as regiões promotoras do DNA. Esta região -10 do DNA é rica em timinas e adeninas, conhecida por TATA box, sendo mais facilmente aberta em comparação com as ligações de guanina e citosina. A região -35 também é um consenso.
Como é a RNA polimerase bacteriana e qual o papel das diferentes subunidades?
 As subunidades Alfa são responsáveis pela manutenção da estrutura da enzima.
A subunidade Beta é responsável pela síntese da fita de RNA.
A subunidade Beta’ também é responsável pela síntese da fita de RNA.
A subunidade ômega possui função desconhecida.
A subunidade sigma (sigma 70) possui função de reconhecer o promotor.
A RNA polimerase pode corrigir erros? Tão bem quanto uma DNA polimerase? Como ocorre a possível correção?
A RNA polimerase não apresenta ou apresenta pouca capacidade de correção, sendo portanto bem menos eficiente que a DNA polimerase. Entretanto, os erros da RNA polimerase não são tão efetivos quanto os da DNA polimerase. Mesmo que o erro seja efetivo, o mRNA portador do erro será logo destruído ou, ainda que seja transcrito em uma proteína defeituosa, ela também será logo destruída, enquanto que outras moléculas de mRNA estão sendo sintetizadas pelo DNA.
Quais as possíveis maneiras de terminação da transcrição em bactérias?
A RNA polimerase é uma enzima com alta processividade. Se não fosse assim, a enzima poderia desligar-se antes de concluir a transcrição de um RNA. Para que a transcrição termine, portanto, é necessário que haja um sinal para que a RNA polimerase pare a transcrição. Esse sinal é dado por uma sequência de DNA denominado sequencia terminadora. Em E.coli, há dois tipos de sinais terminadores, sendo que um deles envolve um fator proteico p e outro não.
Os terminadores que não precisam de p possuem duas características: uma região com uma sequência que provoca auto complementariedade do RNA sintetizado, que forma um grampo; outra característica é uma região com 3 adeninas (AAA).
Os terminadores que dependem de p não possuem a sequência repetida de adeninas na fita molde, mas contém uma sequência rica em citosina e adenina, chamada de elemento rUT.
Qual o papel dos Enhancers?
O papel dos enhancers é aumentar a afinidade da maquinaria da transcrição por um certo promotor. Enhancers ou acentuadores são sequencias de DNA.
REGULAÇÃO GENICA EM PROCARIOTOS
A expressão genica é controlada por proteínas reguladoras. Os genes são controlados por sinais extracelulares – no caso das bactérias esses são moléculas presentes no meio de cultura. Esses sinais são comunicados aos genes pelas proteínas reguladoras, que são de dois tipos: ativadores (reguladores positivos) ou repressores (reguladores negativos). Um ativador aumenta a transcrição do gene que regula e os repressores reduzem ou anulam a transcrição. 
Fatores Sigma alternativos
Vírus e bactérias podem exercer certo controle sobre quais genes serão expressos ao produzirem diferentes subunidades sigma, que irá direcionara RNA polimerase para genes diferentes. Os diferentes fatores sigma bacterianos reconhecem sequencias especificas no DNA, permitindo a transcrição diferencial do conjunto de genes que respondem a estímulos fisiológicos ou ambientais específicos.
Reforçadores
Reforçadores são sequencias que podem ser ligados por proteínas denominadas fatores de transcrição. Certos genes de E.coli apresentam sequencias acima da região promotora estendida. Os genes para a produção de RNA ribossômico possuem 3 sitios acima denominados sitios Fis, por serem sitios de ligação para a proteína denominada fis.
Óperons
Nos procariotos, os genes que codificam as enzimas de determinadas vias metabólicas são em geral, controlados como um grupo, com os genes que codificam as proteinas dessa via mantidos juntos e sob o controle de um promotor em comum. Esse grupo de genes é denominado óperon. Geralmente, os genes não são transcritos todo o tempo. Em vez disso, a produção dessas proteinas pode ser desencadeada pela presença de uma substancia adequada, chamada indutor. Esse fenômeno é denominado indução. Ex: lactose induz a expressão dos genes lac que estão envolvidos no metabolismo da lactose. 
Como um ativador pode ser ligado no DNA procariótico para ativar um gene?
Um ativador é uma proteína regulatória do controle positivo, que estimula a transcrição. O ativador utiliza a superfície para ligar-se a um sitio de DNA próximo do promotor e com uma outra superfície ele interage simultaneamente com a RNA polimerase, trazendo a enzima para o promotor. Esse mecanismo, chamado de recrutamento é um exemplo de ligação cooperativa de proteína de DNA. As interações entre o ativador, a polimerase e o DNA tem função adesiva: a enzima está ativa e o ativador simplesmente o traz para junto do promotor. Ali ela sofre isomerização para abrir o complexo e inicia a transcrição.
Como um repressor pode ser desligado do DNA procariótico para liberar a expressão de um gene?
A RNA polimerase liga-se ao promotor formando um complexo fechado, na qual as duas fitas de DNA permanecem unidas. A seguir, o complexo polimerase-promotor sofre transição para o complexo aberto, quando o DNA desenrola-se e a polimerase inicia o transcrição. Após isso a polimerase deixa o promotor e começa a transcrever o gene.
O repressor se liga a operadores. Quando ligado a RNA polimerase não consegue se ligar ao DNA, então á a necessidade de uma molécula se ligar ao repressor e permitir a transcrição. Isso ocorre porque quando a molécula se liga ao repressor essa sofre mudança conformacional, fazendo com que ele se desligue do DNA.
A estrutura do operon lac, incluindo genes estruturais (“z”,”y” e “a”) e sitios para ligação de moléculas reguladoras
Os três genes lac (lac Z, lac Y e lac A) estão dispostos de forma continua no genoma da E.coli e formam o operon lac.
O promotor lac localizado na extremidade 5’ do lac Z comanda a transcrição dos 3 genes, com um mRNA único. Este mRNAs é traduzido originando três produtos proteicos. O gene lac Z codifica a enzima B-galactosidase, que cliva o açúcar lactose em galactose e glicose. O gene lac Y codifica lactose perneasse, uma proteína que se insere na membrana celular e transporta a lactose para dentro da célula. O gene lac A codifica a tiogaladosideos tóxicos que também são transportados para dentro da célula pelo lac Y.
Esses genes se expressam apenas quando a lactose está disponível, e a glicose ausente.
Qual o papel e como funciona o repressor lac? Que gene codifica? É constitutiva? Como é retirado? 
O repressor lac é codificado pelo gene lacY e promove o sinal da lactose. Esse sistema regulador funciona da seguinte forma: o repressor lac só pode se ligar ao DNA e reprimir a transcrição na ausência da lactose. Em presença desse açúcar, o repressor está inativo e esses genes não estão reprimidos. O CAP pode se ligar ao DNA e ativar os genes lac apenas na ausência da glicose. Portanto, o efeito combinado desses 2 reguladores garante que os genes sejam expressos em níveis significativos somente quando a lactose estiver presente e a glicose ausente.
Qual o papel da CRP (OU CAP) na regulação do operon lac e como funciona?
O nome CAP provem de proteína ativadora de catabólito, mas esse ativador também é conhecido como CRP (proteína receptora de cAMP). O gene que codifica CAP localiza-se em uma outra região de cromossomos bacterianos que não está relacionada aos genes lac. O CAP e o repressor lac são proteínas de ligação ao DNA e cada um se liga a um sitio especifico no promotor lac ou próximo dele. A CAP auxilia a RNA polimerase a se ligar ao DNA e funcionar a baixos níveis de glicose e muito cAMP.
A CAP é regulada pela ação da glicose sendo esta a qual reduz a concentração da molécula CAMP, que é efetora halostérica de CAP. O CAP apenas se liga ao DNA se estiver complexado com o cAMP. Para isso acontecer é necessário baixos níveis de glicose e altos níveis de cAMP.
Em eucariotos, como é a estrutura e como funciona uma proteína ativadora da transcrição? Como ela atua e distância? Onde se liga?
Os ativadores em eucariontes possuem regiões separadas para a ligação do DNA e a ativação. Eles podem interagir com uma outra maquinaria e recrutam a RNA polimerase ou elas recrutam modificadores de nucleossomos que não alteram a cromatina nas proximidades de gene e facilita a ligação da polimerase. Quando estão distantes do sitio de ligação, os ativadores se associam a reforçadores que promovem o dobramento do DNA para que a molécula ativadora atue na transcrição.
Qual a relação entre metilação do DNA e expressão genica?
Quando DNA está metilado, há expressão genica. Quando ocorre a metilação na calda das histonas, a cromatina se condensa mais e os genes nesse região param de ser expressos.
Quais os domínios mais comumente encontrados em proteínas ativadoras de transcrição?
Os domínios de lição possuem 3 motivos de ligação: hélice volta hélice, dedo de zinco e homeodominios. Os domínios de ativação: zíper de lucina e hélice básica alça hélice.
O que são enzimas de restrição?
São enzimas que cortam o DNA em pontos específicos e são produzidos por bactérias.
Posso clivar um DNA humano com uma enzima “x” e ligar um plasmídeo clivado com uma enzima “y”?
Sim, é possível que isso ocorra. Somente se essas duas enzimas forem enzimas Blunt, pois tais enzimas são pouco seletivas e permitem que o fragmento cortado se ligue a outro fragmento diferente.
O que é PCR?
PCR é o processo de amplificação do DNA. Primeiramente, é escolhida a sequência a ser clonada. Em seguida, o DNA precisa ser aquecido em 95° para que ocorra a desnaturação das fitas. No início das fitas são adicionados primers que pareiam com a sequência de interesse. Após isso é necessário baixar a temperatura para que os primers possam se ligar. 
Caso haja diferenças nas temperaturas necessária de cada primer para a ligação, é escolhido a temperatura do primer que necessitar menor temperatura. Em seguido é adicionado o tampão de cloreto de magnésio juntamente com a DNA polimerase e nucleotídeos. Para a enzima atuar, é exigido uma temperatura de aproximadamente 72°. O processo de PCR é útil para a clonagem de um gene de fragmentação, diagnósticos de alterações genética, estudos populacionais, identificação de transgeneros e investigação de paternidade.
TRADUÇÃO – SINTESE DE PROTEINAS
A informação genética é muito importante por causa das proteínas que ela codifica, pois estas desempenham a maioria dos papeis funcionais nas células. O processo de síntese de proteínas é chamado de tradução. 
A tradução é um processo conceitualmente mais complexo do que a replicação e a transcrição. Condizente com a sua posição de ligação de linguagens dos ácidos nucleicos e proteínas depende tanto dos fatores proteicos quanto dos ácidos nucleicos. A síntese de proteínas ocorre nos ribossomos, que são complexos enormes que contem estas grandes moléculas de RNA e mais de 50 proteínas.
Moléculas de RNA transportador (RNAt), RNA mensageiro e muitas proteínas participam da síntesede proteínas juntamente com os ribossomos. O elo entre aminoácido e ácido nucleico é feito inicialmente por enzimas chamadas de aminoacil-RNAt sintetase. Ligando especificamente um determinado aminoácido a cada RNA transportador, estas enzimas implementam o código genético.
A síntese de proteínas requer a tradução das sequências de nucleotídeos para sequência de aminoácidos
A base das sínteses de proteínas é a mesma em todas as formas de vida. Uma proteína é sintetizada no sentido da amina para a carboxila terminal, pela adição sequencial de aminoácidos à ponta carboxila da cadeia peptídica em crescimento.
 Os aminoácidos chegam na cadeia em crescimento na forma ativada de aminoacil-tRNA, criados pela ligação da carboxila de um aminoácido a ponta 3’ de uma molécula de tRNA. A ligação de um aminoacido a seu tRNA correspondente é catalisada por uma aminoacil-tRNA sintetase. Para cada aminoacido há geralmente uma enzima ativadora e pelo menos um tipo de tRNA.
 A tradução das sequencias de bases de uma molécula de mRNA para uma sequência de aminoácidos é similar a traduzir a página de um livro para outro idioma. Tradução é um processo complexo que envolve muita etapas e uma dúzia de moléculas. Existe o potencial de erro em cada etapa. A complexibilidade de tradução cria um conflito entre duas necessidades: o processo tem que não só ser preciso, mas também rápido o suficiente para atender as necessidades da célula.
Qual a função, importância e reações, papel das enzimas aminoacil-tRNA sintetases?
As aminoacil-tRNa sintetases são enzimas indispensáveis ao carregamento de TRNA transportadores descarregados, assim como sua correta coleta de aminoácidos. O carregamento do tRNA só é possível com o auxílio desta enzima. Esse processo é dividido em duas etapas bioquímicas: 1) adenilação, a qual o DNA reage com uma molécula de ATP para ser adenilado. 2) carregamento: a qual o aminoacido adenilado reage com a extremidade 3’ – OH do tRNA.
O RIBOSSOMO
O ribossomo é a maquinaria molecular que promove a síntese proteica. Assim como a tradução de um código genético de ácidos nucleicos em um código de aminoácidos apresenta desafios adicionais em relação a transcrição e replicação, o ribossomo é também o maior e mais complexo do que a maquinaria mínima necessária para a síntese do DNA ou do RNA.
Nos procariotos, as maquinarias de transcrição e tradução estão localizadas no mesmo compartimento, assim o ribossomo pode começar a tradução do mRNA logo que este emerge da RNA polimerase. Essa situação permite que o ribossomo vá avançando juntamente com a RNA polimerase a medida que esta vai alongando o transcrito.
O ribossomo é composto por dois subconjuntos de RNA e proteínas, conhecidos como subunidades maior e menor. A subunidade maior contém o centro da peptidil-transferase, responsável pela formação da ligação peptídica. A subunidade menor contém o centro de decodificação, no qual os tRNAs carregados decodificam os códons do mRNA.
O ribossomo possui 3 sítios de ligação com o tRNA: para realizar a reação de transferência peptídica, o ribossomo deve ser capaz de ligar-se pelo menos dois tRNAs simultaneamente. Na verdade, o ribossomo possui 3 sitios de ligação com o tRNA, chamados A, P e E (o sitio A é o sitio de ligação para o aminoacil-tRNA, o sitio P é o sitio de ligação para o peptidil-tRNA e o sitio E é o sitio de saída, onde o tRNA é liberado. Exit)
Tradução em procariotos
O processo de tradução também é dividido em 3 etapas: iniciação, elongação e terminação.
Nos procariontes, a iniciação da tradução ocorre: quando a subunidade menor do ribossomo se pareia com a sequência Shine-delgarno do mRNA (shine-delgarno: AUG). O ribossomo possui 3 sitios de ligação: E (exit) A (aminoacil) e P (peptidil). Existem 3 fatores de iniciação da tradução que regulam o processo: o IF1 se liga ao sitio A da subunidade menor do ribossomo impedindo o pareamento de qualquer tRNA carregado; o IF3 impedindo o novo acoplamento das subunidades e também impede que o tRNA inicial se ligue nesse sitio e saia antes do início da síntese. O último fator a entrar no complexo é o IF2, que é uma GTP-ase, que interage com o IF3 (a subunidade menor do ribossomo) e o tRNA-iniciador, e tem como função facilitar a associação do tRNA iniciador do ribossomo e impedir que outro tRNA entrem antes do iniciador.
Assim está formado o pré-complexo da síntese.
Recapitulando: a subunidade menor do ribossomo se pareia com a sequência shine-delgarno do mRNA; os fatores de iniciação regulam o processo, sendo que
IF1: se liga ao sitio A da subunidade menor do ribossomo impedindo o pareamento de qualquer tRNA carregado. Impede também que o tRNA se ligue ao sitio A, pois seu sitio especifico é o sitio P.
IF3: se liga ao sitio E, impedindo o desacoplamento das subunidades. Impede que o tRNA inicial se ligue neste sitio e saia antes do início da síntese.
IF2: último fator a entrar no complexo, que é uma GTP-ase que interage com o IF3, a subunidade menor do ribossomo.
Para que o tRNA-iniciador entre no sitio P com seu aminoacido especifico é necessário que ocorra uma acetilaçao em uma ATP. Posteriormente o aminoacido acetilado é acoplado ao tRNA. Todo esse processo é intermediado pela enzima aminoacil-tRNA sintetase.
A etapa de Elongação é a parte mais rápida do processo de tradução. O ciclo de elongamento começa com um tRNA iniciador e uma metionina associada no sitio P e com um sitio A pronto para aceitar um complexo ternário. Existem dois fatores necessários nessa etapa: EF-Tu e EF-G.
O fator de elongação EF-tu mantem se associado ao ribossomo somente no processo de entrada do tRNA. Quando o tRNA se posiciona, EF-tu hidrolisa GTP em GDP e é liberado para atuar e, outro tRNA. O fator EG-G parece se ajustar ao sitio A. Sua entrada nesse sitio muda os tRNA nos sitios A e P para os sitios P e E, e o mRNA move-se pelo ribossomo de modo que o códon seguinte é posicionado no sitio A.
A etapa de Terminação inicia-se quando: o ciclo continua até o códon no sitio A ser um dos 3 códons de fim (UGA, UAA ou UAG). É importante ressaltar que nenhum tRNA reconhece os códons de terminação, isso é feito por proteínas chamadas fatores de liberação. (Realising factors – RF). Possuem2 classes de fatores de liberação: classe 1, que reconhece o códon UAG; e a classe 2, que reconhece o códon UGA.
*UAA é reconhecido por ambos.