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Resumo p2 Micro – Dads Aula 7 - MÉTODOS QUÍMICOS DE CONTROLE - AGENTE QUÍMICO IDEAL: atividade antimicrobiana em baixas concentrações; solubilidade, estabilidade, homogeneidade; não tóxico; inativação mínima por material estranho; atividade ideal em temperatura ambiente ou corpórea; poder de penetração; não ser corrosivo ou tintorial; poder desodorizante; capacidade detergente; ser disponível e ter baixo custo; *não existe um agente químico ideal, e poucos são esterelizantes. - Esterelização é mais fácil por agente físico (calor) e desinfecção por agente químico. - os microrganismos, dos menos aos mais resistentes a biocidas químicos são: vírus com envelopes lipídicos; bactéria gram +, vírus sem envelope; fungos e a maioria de seus esporos; bactérias gram -; protozoários vegetativos e seus cistos; micobacterias; endósporos de bactérias, e por fim, príons. - Ação dos agentes químicos antimicrobianos contra endósporos e Mycobacteria: Mercúrio, disphenol e compostos de amônio são inativos (ambos); Fenólicos: pobre atividade, boa atividade; Clorados: moderada (ambos); iodo: pobre; boa; álcoois: pobre, boa; glutaraldeido: moderada, boa; clorexidina: não ativo, moderada. AGENTES E SUAS AÇÕES: -FENOL E FENÓLICOS: -- FENOL: disrupção da membrana plasmática, desnaturação de enzimas; uso raro, como método de comparação; raro uso como desinfetante ou antisséptico, pelo odor e irritabilidade. -- FENOLICOS: msm do fenol; uso em superfícies no ambiente, instrumentos, pele e mucosas; são reativos msm em presença de matéria orgânica, ex: lusol e creolina. Ex: TRICLOSAN (Bifenol): o excesso em cosméticos e brinquedos tem aumentado as bactérias resistentes; linhagens de Pseudomonas já são resistentes; existentem plasmideos responsáveis pela tolerância do triclosan, metais e outros antissépticos; Hexaclorofeno é bacteriostático de gram+, mas foi suspenso por ser toxico. - Clorexidina: disrupção da mem plasmática; uso em desinfecção da pele e roupas cirúrgicas; bactericida (gram + e -), não toxico e persistente. - HALOGENIOS: -- IODO: inibe fç da proteína (combina com tirosina), forte oxidante; uso antisséptico; mat orgânica afeta desempenho; pd agir sozinho ou com compostos orgânicos. -- CLORO: hidrolisa em agua, formando oxigênio nascente (oxidante); altera/destrói componentes celulares, e pd se ligar a proteínas; uso do gas ou hipoclorido para desinfetar agua, utensílios de alimentação e domésticos pd agir sozinho ou com comp orgânicos (cloraminas). Ex: HALAZONE: pastilha de purificar agua (potável) em ½ a 1h; uso por soldados em acampamentos. Ex: CLORO: mecanismo de ação para purificar água: gas (Cl2): Cl2 + H2O -> HCl + HClO; liquido (hipocloritos de Na ou Ca geram HClO); HClO-> HCl + O (oxigênio nascente = oxidante); cloro reagindo com mat orgânica geral trihalometano (câncer). -ÁLCOOIS: desnaturação proteica e dissolução de lipídeos – acao detergente; isp em termômetros e outros instrumentos de pele; bactericida e funficida; não eficiente contra endósporos e vírus sem envelope; maior uso: etanol e isopropanol. Ex: qto maior a cadeia de carbono, maior o poder bactericida; metanol não é antimicrobiano e é toxico; agua deve estar diluída (ideal 70%), pq atua na penetração do álcool no protoplasma, onde atua; em baixa % de agua, pode ser só bacteriostático (desidrata, não destrói). - METAIS PESADOS E SEUS COMPOSTOS: desnaturação de enzimas e prot essenciais; nitrato de prata: previne infecções gonacocais em recém nascidos; mercurocromo: desinfecta pele e membranas; sulfato de cobre: algicida e fungicida; cloreto de zinco: fungicida; são germicidas e antissépticos. Ex: o cloreto de mercúrio era mt usado como desinfetante, mas é mt corrosivo e toxico; compostos orgânicos de mercúrio são menos tóxicos e mais antimicrobianos, como mercurocromo, timerosal (antigo mertiolate) - ACIDOS ORGANICOS: inibição metabolica em fungos filamentosos, não relacionada a acidez; propionato de cálcio: uso em paes; acido sorbico e benzoico: efetivos em baixo pH; amplo uso em cosmético e alimento, contra fungo filamentosos e bactérias; - ALDEIDOS: desnaturação proteica; glutaraldeido é menos irritante que formaldeido; uso para desinfecao de equipamentos médicos; bem efetivos (podem ser esterelizantes); mt reativos; - ESTERELIZANTES GASOSOS: desnaturação proteica; esterilizante, uso em objetos danificados pelo calor; mais comum: oxido de etileno; modo de ação: anel de oxido de etileno se rompa e forma uma cadeira, que se insere entre átomos de S e H do grupo sulfidrila da enzima, inativando-a; existem camaras de esterelizaçaõ que usam oxido de etileno. - SURFACTANTE: -- sabões: remoção mecânica; degemante de pele e remove partículas; vários sabões tem antimicrobiano (triclosan) -- detergente aniônico: envolve inativação enzimática ou disrupção; sanitizante em laticínios e industrias alimentares; amplo espectro de atividade; não toxico nem corrosivo; rápida acao. - detergente catiônicos (comp 4arios de amônio): inibe enzimas, desnaturação priteica e disrupcao de memb plasmática; antisséptico pra pele, utensílios, aparato borracha; bactericida, bacteriostático, fungi e virucida (envelopados), ex: cepacol. - AGENTES OXIDANTES: oxidação; uso em superfícies contaminadas, ferimentos profundos; peroxido de hidrogênio (bom desinfetante, antisséptico não bom); oxônio: tratamento da agua; acido peracetico: esterilização equipamentos médicos. - QUATS (Composto 4ario de amônio): sem cor, odor e gosto, estável, solúvel, atóxico; germicida e detergente. São fortes bactericidas e bacteriostático, em baixíssimas concentrações. USOS INDUSTRIAIS DE DESINFETANTES: Alimentos: dióxido de enxofre (SO2): desinfeta vinho; nitrato ou nitrito de sódio: evita esporos de Clostridium botulinum em carne e derivados; Papel: compostos mercuriais orgânicos e fenóis: impede crescimento microbiano na manufatura. Nuclear: cloro: impede crescimento de bactéria resistente a radiação nos reatores. Petroleo: mercúrio, fenóis e detergentes: impede cresc bacteriano na recuperação e armazenagem de petróleo e derivados. Metalurgica: detergente catiônico: impede crescimento bacteriano em emulsões aquosas de corte. Textil: metais pesados e fenóis: impede deterioração microbiana em tecidos expostos (toldos, tendas). Ar-condicionado: cloro, fenóis: impede crescimento de bactérias. Couro: metais pesados, fenóis: antimicrobiano no produto final. COMPARANDO EFETIVIDADE DE ANTI-SEPTICOS: o mais potente foi tintura de iodo (mata 100% das bactérias em 90 segundos); depois álcool 70% (100% em 120 segundos), seguido de tintura de cloreto benzalcônio, mistura de etanol e acetona, cloreto de benzalcônio 1:1000 e agua e sabão. TESTES PARA AVALIAR O PODER ANTIMICROBIANO EM DESINFETANTE E ANTI-SEPTICO: técnicas que usam organismos específicos (organismos teste): Staphylococcus aureus (gram+) e Salmonella typhi (gram-).: técnicas: da diluição em tubo (dilui o agente e inocula alça após tantos minutos agindo); inoculação em placa (liquidos – uso de discos impregnados; pomadas: direto na placa); diluição do composto no meio de cultura (dilui diferentes concentrações, em diferentes placas, e compara); Técnica do coeficiente fenólico (tubos com diluições do desinfetante e do fenol; inoculo bactéria; transfiro alça depois de 5, 10 e 15 min para meio de cultura; incubo. Obtendo o coeficiente fenólico: o fator de diluição da maior diluição do desinfetante que matar o organismo-teste em 10 minutos, mas não em 5, é dividido pelo fator de diluição da maior diluição do fenol que tiver o mesmo resultado – portanto: qt menor o coef pior o desinf (e qt maior, melhor); se o coef for menor q 1 é menos efetivo q o fenol e se for maior q 1, é mais. - Melhor desinfetante é o que mata na menor concentração e no menor tempo. - muitos testes de efetividade antimicrobiana não são realísticos (não determinam a real potencia), pq não consideram interações com outras bactérias, e nem a matéria orgânica no ambiente, pH, temperatura, etc. E existem testes maisrealísticos (“in use testing”). AULA 8: ANTIBIOTICOTERAPIA: Termos importantes: -Agente/droga quimioterápica: qlqr substancia química usada na medicina, para tratar doenças; -Agente antimicrobiano: grupo de agentes quimioterápicos usados para tratar doenças causadas por microrganismos. -Antibiose: “contra a vida”. - Antibiotico: substrancia química produzida por um microrganismo capaz de inibir ou destruir outro microrganismo em solução diluída. - Drogas sintéticas: agente quimioterápico produzido em laboratório. - droga semi-sintética: agente quimioterápico produzido parte em laboratório e parte por microrganismos. -HISTORICO: egípcios (esfregavam bolor de pão em ferimentos); quinino (retirado de casca de uma arvore – uso malária); Paul Ehrlich (introduziu o termo “quimioterapia” – descobriu corante “trypan red” (contra tryopanossoma da doença do sono), e Salvarsan (sífilis)); Gerhard Domagk (1930 – descobriu as sulfas – só contra bactéria (afeta síntese de acido fólico – Nobel 1939); Prontosil (corante vermelho – atividade contra estreptococos e estafilococos patogênicos). Alexander Fleming: descobriu lisozima (antibacteriano na lagrima); descobriu que substancia produzida pelo Penicilium notatum inibia bactéria; Florey & Chain purificaram para penicilina, a partir da linhagem de Fleming. 1940 – importância da penicilina na 2ª guerra. Selman Waksman: 1944: antibiotico estreptomicina produzido por Streptomuces griseus – 1º tratamento efetivo contra tuberculose (Nobel 1952). USOS DOS ANTIMICROBIANOS/ANTIBIÓTICOS: tratamento ou prevenção de doenças em humanos ou animais; pesquisas microbiológicas (ex: evitar bactéria qd se quer estudar fungo); uso em pesquisas ou tratamento de câncer. CARACTERISTICAS DE DROGA ANTIMICROBIANA IDEAL: toxicidade seletiva (toxica ao microrg e não as cels hospedeiras); ação não alterada por interações (alimentos, outras drogas); microbicida em vez de microbiostatico; solúvel, e funcionar diluída nos fluidos corpóreos; estável (ficar ativa tempo suficiente e não degradar/excretar prematuramente); não sujeito a resistência microbiana; complementar a defesa do hospedeiro; ser levada rápida ao local de infecção; baixo custo; vida longa em prateleira e não sensível a luz ou calor; não afetar negativamente a vida do hospedeiro (alergia, predisposição a outra doença). PROPRIEDADES GERAIS DOS AGENTES ANTIMICROB USADOS EM QUIMIOTERAPIA: toxicidade seletiva (dano ao microrg e não a hosp.) – índice terapêutico: dose toxica ao hospedeiro/dose terapêutica (qt maior, melhor). Espectro da atividade: gama de microrganismos que o agente pode atuar; amplo ou pequeno espectro; pd ser classificado qt ao grupo q atua (antiviral, antibacteriano, etc) – amplo espectro: útil qd não se conhece o patógeno, destrói flora intestinal; pequeno espectro: melhor qd se conhece o patógeno, destrói menos a flora e diminui chance de superinfecção e resistência. - Como os quimioterápicos atuam nos tecidos: podem ser bactericidas (matam) ou bacteriostático (inibe reversivelmente o crescimento – qd o agente sai, volta a crescer – se tiver com resistência baixa, só o statico não resolve). MEDIDAS DE EFETIVIDADE DE ANTIMICROBIANO: concentração inibitória mínima (MIC ou CIM): menor concentração de uma droga que previne o crescimento de um patógeno particular; concentração letal mínima (MLC ou CLM ou CBM): menor concentração da droga que mata o patógeno. Para determinar CIM: diluo o antibiótico em tubos com caldo e inoculo o microrganismo; a menor diluição que não mostrar crescimento é a CIM. Para determinar CLM: dos tubos sem crescimento, repico para novo meio sem droga; a menor concentração que não crescer no novo tubo é a CLM (1º vejo quem parou de crescer com a droga; dps, vejo quem não volta a crescer (morre)). TESTES DE DIFUSÃO EM DISCO: simples, rápido, gasta menos meio; impregno disco de papel com a droga, em diferentes concentrações ou tipos) e coloco em placa com agar já inoculado a bactéria-teste e incubo; o agente se difunde no agar; qt maior a zona de inibição, mais efetivo é o agente; o diâmetro do halo de inibição classifica o grau de resistência; esse teste revela só CIM (técnica do dispenser múltiplo de antibiótico – método Kirby-Bauer (maquina coloca vários discos na placa, uniformemente). TESTE “E” – Teste de difusão usando fitas com concentrações diferentes de antimicrobiano: parece uma flor; a tira plástica é colocada na superfície do agar inoculado com a bacteira-teste, e tem gradiente crescente de concentração do antibiótico; estima CIM = é bem visível (logo onde para de crescer). DROGAS ANTIBACTERIANAS: Mecanismos de ação: Inibição da síntese da parede celular; Destruição da função da membrana celular; Inibição da síntese proteica; Inibição da síntese de ácidos nucleicos; Acao contra antimetabolitos (mimetismo molecular) – pode agir por inibição competitiva ou ser incorporada no lugar de moléculas importantes Sintese de lipídeos. MECANISMOS DE AÇÃO DOS PRINCIPAIS ANTIBACTERIANOS (alguns): - Síntese da parede celular: penicilinas, ciclosserina, vancomicina, baciltracina; - metabolismo de acido fólico: sulfonamidas - síntese proteica (inibidores de 30S): estreptomicina, gentamicina, nitrofurano, tetraciclina; Modo de ação de ANTIBIÓTICO B-LACTAMICO (PENICILINA) – inibidores da síntese da parede celular: os B lactamicos bloqueiam as peptidases que conectam as pontes entre os NAM (ligados por pontes peptídicas), e enfraquecem a rede da parede. Outro efeito dos B-lactamicos (ex: cefalosporina): enfraquece a parece, e leva a lise celular se exposta a meio hipotônico (perde a proteção). Modo de ação das SULFAS (ação como antimetabolito): as sulfas são análogas estruturalmente ao PABA, molécula necessária para síntese do acido fólico, em um dos passos, e irão se ligar ao sitio ativo dele, interrompendo a síntese. Síntese e função do ácido fólico: as sulfas inibem a 1ª etapa e o trimetoprim bloqueia a segunda. Juntos (no Bactrim), tem ação sinérgica e inibem toda a via de síntese de bases nitrogenadas e aminoácidos. QUIMIOTERAPIA ANTIFUNGICA: - poucas espécies de fungos causam doenças em humanos (se compararmos com a grande diversidade deles). Dermatomicoses (queratina: pele, unha, cabelo); sistêmicas (coccidiose, blastomicose, histoplasmose); subcutânea (esporotricose); mucocutanea (candidíase). Problemas: causam toxicidade em humanos; a maioria dos fungos tem sistema de detoxificação que modifica agentes antifúngicos. - Sitios de ação de antifúngicos (alvos específicos): - membrana celular: Polienos ligam-se ao ergosterol alterando permeabilidade da MC; ex: anfotericina b. Azóis: inibem biossíntese do ergosterol – amplo espectro: ex: miconazol e cetoconzazol. Alilaminas: inibem biossíntese do ergosterol – amplo espectro: ex: terbionofina (para resistentes aos azois). - parede celular (equinocandinas: inibem biossíntese de glucanas; ex: caspofungina; Polioxinas: interferem na síntese de quitina – uso só agricola; - síntese proteica (flucitocinas: pqno espectro: toxica para rins e medula; interrompem a síntese proteica, por incorporar ao DNA; - mitose: Griseofulvina (peniciluim): uso em infecções dermatofiticas, pq se liga seletivamente a queratina (bloqueia a montagem de microtubulos); - outros: ex: taxol, vincristina, vimblastina: antifúngicos e anti-neoplasicos. DROGAS ANTIVIRAIS: PROBLEMAS: drogas que bloqueariam a reprodução viral poderiam ser toxicas para o hospedeiro. Modo de ação de antivirais efetivos: são inibidoras de enzimas especificas de vírus e de certas etapas do ciclo vital. Ex: Aciclovir (herpes – inibe DNA polimerase de vírus); AZT (intefere a atividade da transcriptase reversa em retrovírus (HIV)). DROGAS ANTIPROTOZOARIOS: PROBLEMAS: céls protozoárias são eucarióticas; mtas das drogas não tem o mecanismo de ação completamente elucidado. Modo de ação de antiprotozoarios efetivos: ação no DNA do protozoário ou etapa metabólica, ou transportes de elétrons. EFEITOS COLATERAIS DAS DROGAS ANTIMICROBIANAS:toxicidade, alergia, destruição da microbiota normal; resistência aos antibióticos. Quando o tratamento não é feito até o final, ou não é efetivo, os organismos restantes (que iniciarão uma nova infecção) são altamente resistentes. Efeito de antimicrobiano na flora intestinal e superinfeçoes: uma infeção primaria na garganta é tratada com antibiobiotico de amplo espectro; a droga mata a biota intestinal, mas não os patógenos resistentes presentes ali; a infeção primaria é curada, mas o patógeno resistente se reproduz, e causa uma superinfecção intestinal. COMO AS BACTÉRIAS CRIAM RESISTÊNCIA AOS ANTIBIÓTICOS? - Geneticamente: modificações genéticas (mutações, troca de material cromossomal e extra, seguido de seleção natural); - não genéticas (os microrg não são resistentes, porém: se isolam em tecidos que não sofram ação do antibiótico (evasão); ou ficam temporariamente na forma L (sem parede celular), resistindo aos antibióticos). - Seleção natural e resistência: as populações podem ter alguns membros resistentes; a pressão ambiental (= presença da droga) seleciona o mutante q sobrevive; o mutante pode se tornar dominante na população. Transferencia de resistência entre bactérias: conjugação, transformação e transdução: MECANISMOS DE RESISTENCIA BACTERIANA (adquirida): - alteração nos alvos (modificação da proteína alvo ou ribossomos); - alteração na permeabilidade da membrana (no sist. de transporte – o agente não consegue mais cruzara a membrana); - desenvolvimento de enzimas que destroem certos antibióticos (bactérias q produzem enzima B lactamase, rompendo o anel B lactamico da penicilina – ex: estafilo, estrepto e gonococos produzem B lactamase; a capacidade de produção pode ser transmitida por plasmideos; cefalosprina tem um anel cíclico q deixa mais resistente ao efeito da enzima); - alteração de via metabólica, desprezando uma reação q seria inibida pelo agente (ex: bactérias podem usar ácido fólico do meio qd tem sua síntese inibida); - alteração de uma enzima, permitindo a ocorrência de reação que não ocorria antes; - capacidade de proteinas da membrana bombearem a droga para fora da célula. COMO IMPEDIR A RESISTENCIA BACTERIANA? -Administrar maiores doses de antibióticos, por tempo suficiente, de modo a garantir a morte total dos patógenos, incluindo mutantes resistentes; - Administrar dois antibióticos simultaneamente (sinergismo): ex1: penicilima+estreptomicima (o dano da parede celular aumenta a penetração da estreptomicina, inibindo a síntese proteica); ex2: Augmentin (ác. Clavucanico + penicilina = o acido se liga as B lactamases, impedindo a inativação da penicilina) – CUIDADO: algumas combinações podem resultar em inibição ou antagonismo (ex: tetraciclina+penicilina = uma tem ação bacteriostática, e outra necessita do crescimento delas para atuar) -Limitar o uso de antibióticos para o estritamente necessário: fazer teste de sensibilidade; não usar em resfriados ou doenças virais; cuidado com hospitais e rações animais (problemas devido ao uso excessivo – em ração, usa para tratamento, profilaxia e promover crescimento (cresce pq supre uma bactéria intestina, cujas toxinas retardam o crescimento do animal)). -Imunização para prevenção de doenças comuns. - Devido a evolução de resistência a determinada droga, é necessário o desenvolvimento de antibióticos mais potentes, como no caso do Staphylococcus (Penicilina (1946)- Methicilina (1961)- Vancomycina (1986)- Linezolida (1999)). - Com o passar dos anos, microrganismos que não apresentavam resistência a antibióticos conseguiram desenvolver linhagens resistentes. Ex: Pneumococcos: Penicilina: resistência rara (1989) e 30% resistente (2000); Eritromicina: 0, e 15%; Cephalosporina: 0, e 14%. Gonococcus: Penicilina: 10 (1990), e 70% (2000); Fluoroquinolona: 1,4 e 10%; Enterococcus: Vancomicina: raro e 50%; Campylobacter: raro (1995) e 10% (2000). MECANISMOS DE RESISTENCIA EM VIRUS: devido a alta incidência de mutações (em média, 1 mutação/geração), algumas podem conferir resistência; já foi encontrado resistência ao AZT, e por isso hj usa-se o coquetel para tratar AIDS – diminui chance do vírus criar resistência aos 3 simultaneamente. AULA 9 - MÉTODOS DE CLASSFICAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS - Classificação e identificação: feita pela taxonomia. O organismo é classificado qd é posicionado em sistema taxonômico organizado, baseando-se em suas características e semelhanças com outros organismos do sistema – grau de parentesco. - Identificação: descrição e inserção em um esquema de classificação pré-existente; o objetivo é confirmar a identidade do organismo estudado. Descreve e posiciona: se encaixar no sistema, confirma a espécie; se não, é espécie nova. - Ao isolarmos um organismo, para saber a identidade, buscamos metodologias e informações para saber a identificação. Como usar as informações para identificar e classificar: chaves dicotômicas (facilita busca – identificação (como os livrinhos da Ines) – ex: coloração gram e morfologia); cladogramas (mapas que mostram as relações evolutivas entre os organismos – classificação). - Como construir um cladograma: para microrganismos, uso RNAr (já que a maioria não deixa fosseis – exceção: alguns registros de cianobactérias, trombolitos (cianobactérias e carbonato de cálcio) e estromatólitos (fosseis de cianobactérias – pd ser até do proterozoico)); usando o RNAr: alinho 2 sequencias de RNA determinadas; calculo a porcentagem de similaridade dos nucleotídeos entre as sequencias; desenho o cladograma agrupando os organismos com maior similaridade (cada ramificação é um ancestral comum; comprimento da linha = % de similaridade). CLASSIFICAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTERIAS: - a morfologia diz pouco sobre a relação filogenética, mas é importante na identificação; - a maioria dos procariotos não distingue mt em morfologia e tamanho, então desenvolveu-se testes de reações metabólicas e outros para a distinção (coloração diferencial e testes bioquímicos). Os avanços tecnológicos permitiram a analise do RNA para identificação. -Taxonomia numérica: “qt maior o numero de características compartilhadas, maior é a relação evolutiva entre os organismos”; portanto, qt mais características forem levantadas, maior a precisão na identificação; usa ferramentas matemáticas e computacionais para identificar e classificar (mtos dados). Método: atribui-se valor de 1 a 0 (ausência ou presença), compara-se os padrões de semelhança; se 2 organismos compartilham 90% ou +, presume-se q são da msm sp. A taxonomia numérica (usava dados morfológicos e bioquímicos) foi substituída pela polifásica (combina carac fenotípicas, filogenéticas, genotípicas, etc). PROCEDIMENTOS AO ENCONTRAR UMA NOVA SP DE BACTERIA: - Qd uma sp não se encaixa dentre as conhecidas, chegamos a conclusão que é uma nova sp. - a descrição do organismo, as evidencias de sua classificação e o nome devem ser publicados em revista ciencifica: “International Journal of Systematic Bacteriology”; o reconhecimento é obtido pela incorporação no “Bergey’s Manual”. - A ESCOLHA DO NOME da Bacteria: deve ser baseado nas regras do Codigo Bacteriologico (elaborado por comissão internacional de sistemática bacteriológica); derivar do latim, grego ou ser latinizado com sufixo apropriado. - Para protozoários: Codigo Internacional de Nomenclatura Zoologica; para Fungos e Algas: Codigo Intern de Nomencl Botanica. Ex: Penicillium notatum – penicill: tufo, pincel; notatus: vento. TAXONOMIA BACTERIANA: atualmente existem +- 6250 sp (3000 estao descritas no Bergey’s); estima-se que na realidade existam milhões, porém a maioria não pode ser ou ainda não foi cultivada. HISTORICO E IMPORTANCIA DO MANUEL BERGEY: referencia internacional para taxonomia de bactérias; 1ª edição em 1923 tendo David H. Bergey como presidente do grupo editorial; 1936: Bergey criou fundo educacional; é uma publicação autoperpetuável, com várias edições desde então. No inicio existia só o Bergeys Manual of Determinative Bacteriology; em 1984separou em Bergeys Manual of Determinative Bacteriology e B. M. of Systematic Bacteriology (2 livros com objetivos diferentes). SLIDE falando o que tinha na 1ª e 2ª edição. - O Determinative classificava baseado em: composição da PC, morfologia, coloração diferencial, necessidade de O2 e testes bioquímicos; usado na identificação bacteriana, e separado em grupos/partes, pois não havia consenso sobre separação de ordens, famílias, etc. METODOS DE CLASSIFICAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTERIAS: 1- Morfologia (Microscopia): diferenças nas estruturas, como endósporos, flagelos, etc; pouco útil, pq são mt parecidas; 2- coloração diferencial (microscopia): a maioria delas é para a PC (não usada em bactérias sem PC ou Archaea (parede não usual); ex: gram + e -; acido resistentes; útil em medicina (ajuda a decidir o tipo de antibiótico). 3- Testes bioquímicos: diferenciação por atividade enzimática; ex: diferenciação de bactérias gram – entéricas: todas são oxidase-negativas, fermentam lactose ou não, produzem acetoina, etc.; chaves de identificação: meios diferenciais ou seletivos aceleram a identificação. Chave dicotômica (fermenta? sim, não; usa O2? Sim, não; etc) TABELA: TESTES BIOQUÍMICOS ESPECÍFICOS USADOS NA IDENTIFICAÇÃO E CLASSIFICAÇÃO: - Fermentação de açúcar: microrg inoculado em meio contendo açúcar especifico; observa-se crescimento e produto final da fermentação, incluindo gases; fermentações anaeróbicas (inoculação em agar em pé). - Liquefação de gelatina: microrg inoculado em meio solido com gelatina; a liquefação a temperatura ambiente ou incapacidade em ressolidificar no refrigerador = enzimas proteolíticas (degradam gelatina). - Hidrólise de amido: microrg inoculado em ágar contendo amido; põe pra crescer; coloca iodo, e as áreas claras em volta das colônias indicam enzimas q degradam o amido. - Leite tornassol: microrg inoculado em meio (agar leite?); analisa-se alteração de pH, desnaturação proteica da caseína (coagulação), e produção de gás para identificação. - Catalase: peroxido de hidrogênio (H2O2) é derramado sobre crescimento intenso de organismo em agar inclinado; liberação de bolhas de gás O2 indicam presença de catalase (quebra H2O2, liberando gás). - Outros testes (slide): oxidase, utilização de citrato, sulfeto de hidrogênio, produção de indol, redução do nitrato, vermelho de metila, Voges-Proskauer, Fenilalanina desaminase, uréase, nutriente especifico). 4-Sorologia: resposta imune usando um atiserum (isolado de paciente exposto a bactéria): - teste de aglutinação em lamina: coloca-se gotas da bactéria desconhecida em solução salina, e põe em contato com diferentes antiserum: se aglutinar, o resultado é positivo (é a bactéria do soro isolado). -ELISA: microplacas com anticorpos diferenctes, e a bactéria desconhecida é adicionada; ocorre reação colorida, e a leitura é feita no scanner, acoplado a um computador. Ex: teste de AIDS. -Western-blotting: processo complexo: soro do paciente, faz eletroforese, separa proteínas do paciente e bactéria, passa por filtro (separa proteínas), anticorpo é marcado com corante e lavado por filtro de celulose; se antígeno especifico (bactéria) estiver presente, ele se liga ao anticorpo marcado, formando banda colorida visível no filtro. Ex: doença de Lyme e AIDS. 5-Fagotipagem: determina por quais fagos uma bactéria é susceptível; “os fagos são altamente especializados, para determinada espécie ou msm linhagem em particular”. Método: placa com bactéria crescida em ágar, adiciona gotas de diferentes fagos em locais marcados – regiões claras indicam lise = susceptível a certo fago, da pra determinar. 6-Sequenciamento de Aminoacidos e perfil proteico: “a sequencia de aminoácidos de proteínas reflete a sequencia de bases de DNA q codificam a proteína”. Método indireto, de avaliação de DNA; compara-se a sequencia de 2 organismos – qto mais parecidos, mais relacionados; não é seguro (2 organismos podem evoluir independentemente encontrando a msm solução para o msm problema); técnica: eletroforese em gel de poliacrilamina (PAGE). 7-Perfil de ácidos graxos: “as bactérias sintetizam uma gde variedade de ácidos graxos e esses são cte para cd sp em particular”. É feita extração do material bacteriano, e análise por cromatografia em camada delgada (CCD) e/ou cromatografia gasosa (CG); compara-se o perfil dos ácidos graxos da bactéria com o da base de dados, no computador; precisa fzer testes bioquímicos em paralelo. 8-Citometria de fluxo: “uma cél passa por uma pqna abertura (capilar) iluminada com laser. Pela dispersão da luz causada por ela, da para definir tamanho, forma, densidade e superfície após analise no computador”; permite identificar sem cultivar a bactéria. 9-Composição de bases de DNA: % (guanina+citosina): revela grau de proximidade entre spp (diferença maior q 10% = spp não relacionadas); precisa de outras analises em conjunto. 10-DNA fingerprinting (impressão digital): por eletroforese, comparo fragmentos de sequencias de bases, cortadas por enzimas de restrição, de 2 microrg. Usada para detectar origem de infeções hospitalares. 11-Sequenciamento do RNA ribossomal: vantagens de usar RNAr: todas céls tem; organismos relacionados tem poucas bases diferentes; muda pouco com o tempo; não precisa cultivar a cél; método: uso PCR para amplificar a qtidade de DNA (qd não pd ser cultivado); é feita a eletroforese, e é sequenciado no sequenciador. 12-Hibridização do ácido nucleico: “se 2 spp são similares ou relacionadas, a maior parte das sequencias de seus ác nucleicos tb deve ser similar”. Testa a habilidade de uma fita de DNA de um organismo se ligar a de outro (qt maior a hibridização, maior o parentesco – se for 100%, é a msm sp); calor separa a fita e frio reúne. Ex: verificar contaminação de alimento por Salmonella (faço clones do DNA em E. coli.). CRITÉRIOS TAXONÔMICOS E MÉTODOS PARA CLASSIFICAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS: -caractersticas morfológicas: não (sim p cianobact); sim. -coloração diferencial: sim (para tipo de PC); sim. -testes bioquímico, sorologia, fagotipagem, perfil de ácidos graxos, citometria de fluxo: não; sim. -composição de bases do DNA; sequenciamento do RNAr: sim; não. -Fingterprinting de DNA; PCR: sim; sim. -Hibridização de ác nucleicos: sim; sim (sondas de DNA , chips de DNA). AULA 10 – DIVERSIDADE DE BACTÉRIAS - A “árvore da vida”: é definida pelo RNAr; divisão em Bacteria, Archaea e Eukarya. “Korarchaeota” é um filo de Archaea não reconhecido. - A “Rede da vida”: considera transferência horizontal de genes; Archaebacteria, Eukaryotes e Eubacteria. - Relação filogenética dos principais procariotos: Ancestral comum, bifurcando em ARCHAEA e BACTERIA. TABELA: DIFERENÇAS ENTRE EUBACTERIA E ARQUEOBACTERIAS: -numero de sequencia do RNAr compartilhadas com Eukaria: 1, 3; -Parede celular: Peptideoglicano (ác muramico+D-aminoácido), Pseudomureina (proteínas ou glicoproteínas/polissacarídeos); -fosfolipideos na MP: ác graxos de cadeia longa (ligações ester); fitanóis (ligações éter); -Síntese proteica (aminoácido q inicia cadeia proteica): formilmetionina, metionina; -produção de metano (CH4): não, sim; -Sensibilidade a antibióticos cloranfenicol, estreptomicina, canamicina: sim, não; -Sensibilidade ao antibiótico anisomicina: não, sim; -ambientes extremos: poucas, sim; -Subunidade 16S do RNAr: diferente; -RNA polimerase: 1 tipo simples, vários e complexos; -fotossíntese usando clorofila: sim, não; -espécies patogênicas: algumas, não se conhece. PRINCIPAIS GRUPOS DE BACTERIAS (Manual Bergey, 9ª ed): EUBACTERIA: PC presente: gram negativas: espiroquetas, bacilos encurvados aeróbios e microaerófilos, bacilos e cocos aeróbios, bacilos anaeróbios facultativos, bactérias anaeróbias, riquetisas e clamídias, fototroficos anoxigenicos, fototroficos oxigenicos, bactelias delizantes, bact. com bainha, bact germulante e/ou apendiculadas, quimiolitotroficos. Gram +: cocos, bact esporuladas, bacilos com forma regular e irregular, micobacterias, actinomicetos; PC ausente:micoplasmas. ARQUEOBACTERIA: produtores de metano, bact halofilicas extremas, arqueobacterias dependentes de enxofre, termoplasmas. EUBACTERIA: -PC ausente-micoplasmas: não possui PC; colônias tem aspecto de ovo frito. -DIFERENÇAS gram + e gram-: -reação de gram: violeta escuro, rosa; -camada de peptideoglicano: espessa, fina; -conteúdo de lipopolissacarideo: baixo, alto; -exigência nutricional: mais complexa; menos complexa; -ruptura da PC pela lisozima: alta, baixa; -susceptibilidade a penicilina e sulfanilamida: acentuada, menos acentuada; -susceptibilidade a detergentes aniônico e resistência a azida sódicas: acentuada, menos; -endósporos: alguns, não. PRINCIPAIS GRUPOS DE GRAM NEGATIVAS e características: - Espiroquetas: helicoidais, flexíveis, flagelo periplasmático; vários são patógenos humanos. Ex: Leptospira (L. interrogans: leptospirose: aeróbio estritro, hospedeiro roedor, cao, porco; humano: rins, sai pela urina; vacina só animal), Treponema (T. pallidium: sífilis; anaeróbio ou microaerofilico, comensal ou parasita; lesões (estágios): cancro, erupções generalizadas, infecção sistêmica, SNC); Borrelia burgdorferi (Doença de Lyme: transm. pelo carrapato; infecção sistêmica, artrite crônica), Spirochaeta. - Bacilos encurvados aeróbios ou microaerofilos: helicoidais em forma de vibrião ou anel, moveis com flagelo polar ou imóveis; alguns parasitam animais, e alguns são patógenos humanos. Ex: Aquaspirillum, Azospirillum, Flectobacillus; Spirillum volutans (grande, bioindicador de qualidade de água); Bdellovibrio (parasita - ciclo: rompe MC da cel hosp e entra, se alonga e divide, liberando novos (td em 20 min)); Thermus aquaticus (hipertemófila, isolada por Tomas Brock, fonte da Taq polimerase (uso no PCR)). -Cocos e bacilos aeróbios: bastonetes ou cocos, alguns patógenos humanos, de animais ou plantas; ex: Acetobacter, Agrobacterium, Azotobacter, Legionelia, Methylococcus; Bordetella pertussis (coqueluche, vacina tríplice (DTP – difteria, tétano, pertussis)); Neisseria (bactérias aderem a mucosa por fimbrias; N. gornorreheae: gonorreia; N. meningitidis: meningite meningocócica); - Bacilos anaeróbios facultativos: bastonetes retos ou vibriões; habitam intestino de homem ou animais, alguns patogênicos; Ex: Enterobacter, Escherichia, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella. - Bacterias anaeróbias: bastonetes retos, encurvados ou helicoidais e cocos, alguns vivem no trato intestinal e causam infecções; ex: Bacteroides, Fusobacterium, Megasphoera. - Riquétsias e clamídias: forma de bastonetes a cocoides, necessitam de hospedeiro vivo para desenvolver, mtos patogênicos; Ex: Chlamydia, Rickettsia (parasita intracel obrigatório – R. prowazekkiI (tifo epidêmico, fiolho); R. ricketisii (febre maculosa, carrapato), Rochalimaea. Ciclo de clamídia: ligação a céls hospedeira, entrada por fagocitose, conversão a corpos reticulares, reprodução dos corpos, condensação dos corpos reticulares formam corpos elementares, que são liberados por lise celular. -fototróficos anoxigenicos: anaeróbios, fazem fotossíntese (usam luz como fonte de energia) e não produzem O2 (pd usar enxofre ou não); bact verdes e purpuras; ambiente aquático, não patogênicas; Ex: Chlorobium, Chromatium, Rhodomicrobium. -fototroficos oxigenicos: usam luz como fonte de energia, produzem O2, são as cianobactérias, ambiente solo e agua, não patogênicas; ex: Anabaena, Gloeocapsa, Oscillatoria. - bactérias deslizantes-mixobactérias: bastonetes ou filamentos sem flagelos, q delizam através de superfícies úmidas; alguns tem ciclo de vida complexo; solo e água, não patog; ex: Chondromyces, Saprospira, Simonsiella, Stigmatella. Ciclo (Mixococcus xanthus): corpo de frutificação produz mixósporos, que germinam e crescem, num ciclo vegetativo (pd produzir mixósporo por indução química), e por expansão e agregação formam montículos de céls q formam o corpo de frutificação (mixósporo). - bactérias com bainha: bastonetes em cadeia ou filamentos envolvidos por bainha tubular; saprófitos aquáticos, não patog. Ex: Crenothrix, Leptothrix, Sphaerotilus natans (entope cano). -bacterias gemulantes e/ou apendiculadas: reprodução assimétrica, brotamento ou pedúnculos, saprofitas agua e solo, não patog; ex: Ancalomicrobium, Caulobacter. -quimiolitotroficos: obtem energia por oxidação da amônia; nitritos, compostos sulforador reduzidos, ferro ou manganês; mtos autotroficos, solo e agua, não patog; Ex: Nitrobacter, Nitrococcus, Siderocapsa, Thiospira, Nitrosomas (converte NH3 em nitrito NO2 (nitrificação), importância: disponibiliza formas móveis de N no solo). TABELA: comparação entre bactérias, clamídias, rickettsias e vírus: -ACÍDO NUCLEICO (DNA ou RNA): AMBOS, um ou outro; -CRESCE SÓ EM CÉLS: não, SIM; -MULTIPLICAÇÃO POR DIVISAO BINARIA SIMPLES: SIM, não; -PC COM ÁC URAMICO: sim, não, sim, não; -RIBOSSOMOS, ENZIMAS METABOLICAMENTE ATIVAS, INIBIÇÃO POR DROGAS ANTIBACTERIANAS: SIM, não; -SINTESE DE ATP COMO FONTE DE ENERGIA: sim, não, sim, não. PRINCIPAIS GRUPOS DE GRAM + e características: -cocos: aerobiso, anaeróbios facultativos ou anaeróbios; saprofitas ou parasitas, alguns resistentes a radiação, alguns patógenos humanos. Ex: Micrococcus, Sarcina, Staphylococcus (S. aureus: doenças: acne, furúnculo, pneumonia, meningite; vive no trato resp superior e pele), Streptococcus. -bacterias esporuladas: bastonetes ou cocos q formam endósporos resistentes ao calor, anaeróbios, anaer facultativos ou aeróbios; solo, agua, parasitas, alguns patógenos; ex: Bacillus, Clostridium (C. tetani), Sporosarcina. - bacilos regulares: aeróbios ou anaer facultativos; solo, agua, alimentos, alguns patógenos; ex: Lactobacillus, Listeria, Brocothrix. -bacilos irregulares: cels com saliências, forma Y ou V, ciclo coco-bacilo, aeróbios, anaer facult ou anaeróbios; alguns patogênicos; ex: Arthrobacter, Brevibacterium. -micobacterias: bastonetes aeróbios álcool-acido resistentes; saprofitas ou parasitas, alguns patogênicos; ex: Mycbacterium – M. leprae (lepra; nunca cultivado em meio artificial, cuasa lesões nodulares e rugosas); M. tuberculosis (tuberculose: diagnostico: teste da tuberculina (TB): avalia hipersensibilidade ao antígeno). -actinomicetos: bact. aeróbias de solo q formam micélio com hifas ramificadas; multiplicam-se por fragmentação ou conidiosporos ou esporangiosporos; alguns produzem antibióticos; ex: Actinoplanes, Micropolyspora, Streptomyces (comum, produz mais de matade dos antibióticos; produz geosmina (gás q da o odor característico ao solo). ARQUEOBACTÉRIAS: principais grupos: - Metanogenicas: anaeróbias estritas, ambiente rico em mat orgânica, como tratamento esgoto rumen, intestino mamífero, pantano; ex: Methanobactrium, Metanococcus, Methanomicrobium e Methanosarcina. -Halofílicas extremas: quimiorganotroficas aeróbicas, requerem NaCl (15% ou+) – habitats hipersalinos (lagos salinos, alimentos salgados, tanques de produção de sal); pd ter bacteriorrodopsina (usa luz pra produzir ATP); são neutrofilicas ou alcalofilicas e mesofilias ou ligeiramente termofilicas; coram-se gram-, não formam esporos e tem maiores plasmideos; ex: Halobacterium, Halococcus, Natronobacterium. -termofilicas dependentes de enxofre: termofilicas obrigatórias (ótimo 70-110°C); regiões termais (solo, agua, lama fervente, gdes profundidades) ; maioria acidofilica, reduzem S a H2S anaerobicamente, ou aeróbica oxida a H2SO4. Ex: Desulforococcus, Pyrodictium, Pyrococcus (P. furiosus: fonte Pfu DNA polimerase – PCR), Thermoproteus. -sem parede celular (termoplasmas): cels pleomorficas sem PC, termoacidofilas e quimiorganotroficas, anaeróbias facultativas; MP rica em manose e lipoglicano. Ex: Thermoplasma acidophilium e T.vulcanicum. Classificação de bact. pelo Bergey´s (2ª ed) (Manual de Bacteriologia Sistemática): 24 filos de Bacteria e 2 filos de Archaea (Crenarchaeota e Euriarchaeota). (FIGURA – slide 51, aula 10) FILO PROTEOBACTERIA: é o principal filo de Bacteria - “Proteo” – assume mtas formas; -bacterias gram- commorfologia e metabolismodiverso (foto, quimiolito ou quimiorganotroficas); gru´po com maior diversidade filogenética, com 5 subgrupos (classes): alfa, beta, gama, delta e épsilon. -alfa-Proteobacteria: crescem em ambientes nutricionalmente pobres, spp pedunculadas e reprodução por brotamento; spp parasitas intracel obrigatórios; patógenos de plantas e spp fixadoras de N2. Ex: Caulobacter, Rickettsia, Brucella, Nitrobacter e Rhizobium. -beta-Proteobacteria: alguns usam nutrientes de decomposição anaeróbia de matéria orgânica (H2, NH3, CH4); importantes spp patogênicas. Ex: Bordetella, Neisseria, NItrossomas, Spirillum. -gama-Proteobacteria: maior subgrupo de Bacteria; variedade de tipos fisiológicos; ex: Pseudomonadales, enterobacteriales. Ordem Pseudomonadales: Pseudomonas: bastonete com 1 ou + flagelos polares, aeróbico ou facultativo, comum no solo e outros ambientes; produzem enzimas e metabolizam vários substratos; P.aeruginosa: infecções hospitalares: crescem em anti-septicos e são resistentes a mtos antibióticos (bombeamento de efluxo eficiente); P.putida: degradam compostos aromáticos (derivados do petróleo, solventes orgânicos). Ordem Enterobacteriales: família Enterobacteriaceae: 41 generos: importantes: Escherichia, Salmonella, Shigella,Yersinia (patógenos do homem); Enterobacter, Klebsiella e Serratia (patógenos ocasionais), Proteus, Enterobacter, Citrobacter,. Importância sanitária e clínica; habitam trato intestinal de animais sangue quente, solos e agua; bastonetes curtos, anaeróbios facultativos, maioria fermentador de glicose. -delta-Proteobacteria: desulfovibrionales: redutoras de enxofre e sulfato, gerando H2S; sedimentos anaeróbios e intestino animal. Desulfovibrio desulfuricans: bact. anaeróbica – corroe tubulações, reduz metais tóxicos – biorremediação. - épsilon-Proteobacteria: Campylobacter (patógeno humano); Helicobacter pylori (patógeno humano e carcinogênico): espirilo microaerofilico, habita intestino humano, associado a gastrites agudas e crônicas, e ao câncer gástrico. BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS NÃO PROTEOBACTERIAS: -Cianobactéria: são fotossintéticas e oxigenicas; Chlorobi (bactéria verde sulforosa) e Chloroflexi (bact. verde não-sulforosa): são fotossintéticas e anoxigenicas. FILO FIRMICUTES: bactérias gram+ de baixo índice de G+C. Formas diversas, mtas formam esporos; habitat: agua, solo, microbiota normal de animasi (pele, trato digest); aeróbios, anaeróbios, microaerofilicos, ou facultativos; Generos mais conhecidos: Clostridium, Bacillus; Staphylococcus (alguns patógenos humanos); Enterococcus (patógenos oportunistas); Lactobacillus (prod ác láctico); Streptococcus (mtos patógenos humanos); Mycoplasma (não apresentam reação ao Gram; é colocada no filo pelo baixo conteúdo de G+C; não tem PC, são patógenos humanos). FILO ACTINOBACTERIA: alguns gêneros exibem plesiomorfia, podendo apresentar filamentos ramificados. Ex: Mycobacterium (álcool-acido resistentes, patógenos humanos); Streptomyces (filamentosos, ramificados, mtos produzem antibióticos). FILOS VARIADOS: SPIROCHAETES: Generos importantes: Borrelia, Leptospira, Treponema: todos pat DOMÍNIO ARCHAEA: gde diversidade fenotípica. - Crenarchaeota: hipertermofilicos; bons modelos par estudo da vida primitiva na Terra. - Euryarchaeota: ambientes extremos; halofilicos: maioria aeróbios obrigatórios; metanogenicos: anaeróbios obrigt; hipertermofilicos (Thermococcus, Pyrococcus); Thermoplasma: ausência de parede. -“Korarchaeota”: não reconhecido oficialmente pela taxonomia; identificados em um único local – Yellowstone Park; culturas laboratoriais mistas. Arvore filogenética de Archaea (Slide 72, aula 10) ARCHAEA HIPERTERMOFILICAS: Euriarchaeota: Thermococcus, Pyrococcus (“bola de fogo”), Methanopyrus: temperatura ótima ~100°C; Crenarchaeota: Sulfolobus, Pyrolobus, Desulforococcus: P. fumarii: temp ótima ~106°C, pH4-6,5, 3650m. ANEXOS: tabela 11.1: Procariotos selecionados no Bergeys Sistematic 2ª ed: ordens e gêneros importantes - Proteobacterias (alfa, beta, gama, delta e épsilon ). - Bacterias gram neativas não-proteobacterias: Cianobacterias, Chlorobi, Chloroflexi) - Firmicutes (bact. gram+ de baixo índice G+C); - Actinobacterias (bact. gram+ de alto índice G+C); - Filos variados discutidos na 5ª ed: Chlamydiae, Spirochaetes, Bacteroidetes, Fusobacteria. - Dominio Archaea: Crenarcheota (Gram negativas); e Euryarchaeota (gram+ para variáveis). TABELA II: Grupos de bactérias do Bergeys Determinative (9ª ed): 35 grupos (ver nos slides se precisar: aula 10, slide 79 e 80). TABELA III: Filos de procariotos do Bergeys Sistematic (2ª ed). 2 filos do Archaea e 24 do Bacteria (slide 81 e 82). AULA 11 - DIVERSIDADE DE FUNGOS: - micologia: estuda fungos. HISTÓRICO: -fermentação biológica bem antiga (vinho, pao, cerveja); Egipcios, Romanos, povos do Mexico e Guatemala (atribuíam fermentação e fungos a deuses ou raios); índios norte americanos (cogumelo-medicamento); Idade do Cobre (5300 anos – fungo antibiótico usava pra fazer fogo). -Fungos luminescentes: em pedaços de madeira em decomposição – marcar trilhas, identificar soldados (capacete); -Hooke e Leeuwenhoeck: começaram; Pier’Antonio Micheli: pai da micologia; 1729 publicou estudo; até 1969 os fungos eram considerados vegetais; Wittaker criou o Reino Fungi, e até hj seguem Codigo Internacional de Nomenclatura Botanica. FUNGOS: grupo mt grande. 1992 Hawkworth estimou 1,5 milhoes spp; 1996 Alexopoulos contabilizou 69.000 sp; atualmente 100.000 sp. Discrepância por amostragem insuficiente. Existe medo de se perder spp antes mesmo de serem descritas; importância: ecológica, fonte de produtos químicos, mtos fármacos, antibióticos, e uso biotecnológico (controle, biorremediação). IMPORTANCIA: processos de fermentação (pao, vinho, cerveja, tofu, reagentes químicos), uso direto como alimento (cogumelo e trufa); produção de fármaco (cortisona, ciclosporina, antibióticos); causadores de doenças (mais em plantas - 5.000 sp); importância ecológica: decompositores 1arios (uso de enzimas extracel); formigas, criam fungos para digerir plantas ou para nutrição direta; Neurospora é usado em estudo genético; leveduras tem plasmideos usados na engenharia genética: S. cerevisiae e Pichia pastoris (vacina hept B). TABELA: Classificações mais antigas: Reinos (2001 e 1995): FUNGI (ambos): Filos: -Deutetomycetes (fungos imperfeitos ou mitosporicos - Penicilium, Aspergilus, Candida, hifas septadas, sem esporo sexuado, causa dermatomicoses); Ciclo: conídios (esporos), germinam, formando hifas e se desenvolvendo (tem conidióforo, contendo conídios). -Basidiomycetes (champignons – Amanita, Agaricus, hifas septadas, esporo sexuado basidiósporo (contido no basídio), doença: carvão do milho, ferrugem de cereais); “corpo” formado por chapéu, que contem labelas, que são formadas por basídios com basidiósporos; existem vários comestíveis (Hydnum repandum, Craterellus cornucopioides, Lactarius deliciosus) -Ascomycetes (fungos de saco: Neurospora, Saccharomyces, Morchella; hifas septadas, esporo sexuado ascósporo (asco - saco que contem ascósporos; ascocarpos: corpos de frutificação que contem os ascos (3 tipos: apotécio, cleistotecio e peritécio)), doença apodrecimento de frutos, doença do olmo holandês; podem ser comestíveis: Morchella esculenta, Tuber brumale (trufa negra)); -Zygomycetes (fungos de pão – Mucor, Pilobolus, Rhizopus (R. stolonifer: bolor preto do pão): hifas cenocíticas, esporo sexual zigosporo, doença: podridão mole de plantas); - Chytridiomycetes (Allomyces; hifas cenoticas, esporo sexuado zoósporo monoflagelado; doença mancha marrom do milho; saprofitas, parasitas de plantas, animais e algas; Batrachochytrium dendrobatidis (causa infecção letal em anfíbio que dizima populações, podendo levar a extinções); Reino STRAMINIFILA (2001) ou CHROMISTA (1995): Filo Oomycetes (fungos aquáticos-zoosporicos – Saprolegnia; hifas cenocíticas; esporo sexuado zoósporo biflagelado; doenças em peixes; PC com celulose) – ciclo de vida (Saprolegnia): ciclo assexuado: noápice de hifa somática desenvolvem-se esporângios (n), que por mitose produzem zoósporos 1arios (n); eles se desenvolvem em cisto 1ario, que germina e forma o zoósporo 2ario; que se encista, e forma um cisto 2ario; esse cisto germina e desenvolve tubo germinativo para formar hifa somática, que desenvolverá um esporângio no ápice (retomando). O Ciclo sexuado ocorre por copulação gameta-gametangial (formação anterídio-oogonia em hifas somáticas). Reino PROTOZOA (2001) ou FUNGOS LIMOSOS (1995): Filos: Acrasiomycetes (fungos limosos celulares – Dictyostelium - ciclo de vida (o sinalizador químico AMPc atua na agregação): corpos de frutificação crescem e liberam esporos; cai e germina, formando amebas, que se agregam, num centro de agregação (formando pseudoplasmódio); o pseudoplasmodio migra, e formam lesmas, que se desenvolverão e formarão corpos de frutificação; e Myxomycetes (fungos limosos acelulares (plasmodiais) – Physarum; Hemitrichia, Stemonitis, Acyria denudata). FUNGOS PERFEITOS X IMPERFEITOS: -imperfeitos: sem estagio sexual conhecido (provisoriamente com Deuteromycetes); -perfeitos: tem todos estágios sexuais conhecidos. Outras denominações: Forma/fungo: anamórfico (denom 1977) ou mitospórico (denom 1993): só estagio assexuado; teleomorfico (77) ou meiospórico (93): estagio sexuado. Tipo morfológico: fungos limosos (sem hifas): Acrasiomycetes e Myxomycetes; Fungos inferiores (hifas cenocíticas): Chytridiomycetes, Oomycetes, e Zygomycetes; Fungos superiores (hifas septadas): Deuteromycetes, Ascomycetes, e Basidiomycetes. Fungos terrestres: divisão Zygomycota (zygomycetes); Ascomycota (sac fungi), Basidiomycota (clug fungi), Deuteromycota (fungo imperfeito). ARVORE FILOGENETICA DE EUKARYA baseada em analise RNAr 18S: oocycetos deixaram de ser considerados fungos, e Deuteromycetes deixou de ser reconhecido. -NOVA PROPOSTA DE CLASSIFICAÇÃO – 2005: proposta pela Sociedade Internacional de Protistologistas: não ter sistema hierariquico (classe, subclasse, etc) para evitar problemas com mudanças frequentes: Chytridiomycetes, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota, Urediniomycetes (patógenos de plantas e humanos – Uromyces); Ustilaginomycetes (parasitas de plantas – Ustilago) (Uredi e Ustilo antes eram Basidiomycota); Glomerocycota (endomicorrizas arbusculares, antes zygomycota – Glomus); * *Microsporidia (parasitas intracel obrigatorio em animais; possuem esporos pequenos (exósporo externo, quitina no endósporo e MP interna); sem mitocôndria, peroxissomo, kinetossomo, cílios e centríolos – Encephalitozoon cumiculi (causa encefalite e nefrite) – antes Protozoa). -CLASSIFICAÇÃO ATUAL: Hibbet DS et al (2007): baseada em analise molecular avançada, propõe 7 filos (grupo monofiletico): Neocallimastigomycota, Blastocladiomycota (antes com Chytridiomycetes), Basidiomycota, Ascomycota, Glomeromycota, Chytridiomycota, e Microsoporidia. CARACTERISTICAS GERAIS DOS FUNGOS: - tipo nutricional: quimioheterotrofo; - metabolismo: heterotrófico, aeróbico ou anaeróbico facultativo; - obtenção de alimento: absorção - reprodução: sexuada e assexuada - arranjo celular: unicel (leveduras), cenocíticos filamentosos (não septados), ou multicelulares filamentosos (septadas); principais tipos: leveduras, bolores e champignons - tipo celular: eucariotos - membrana celular com esteróis: único = esgosterol; - PC: quitina ou outras glucanas; não contem peptidioglicano e celulose só em alguns - armazenamento: glicogênio e lipídeos (raro) - sensibilidade a antibióticos: polienos, imidazois e griseofulvina. - patogenicidade geralmente em plantas; associação (mutualismo): plantas (Micorrizas e endofiticos) e algas (liquens). CARACTERISTICAS NUTRICIONAIS DOS FUNGOS: - preferem pH 5 (mais acido); - maioria dos bolores é aeróbia, e leveduras é anaeróbia facultativa; - maioria é mais resistente a pressão osmótica do q as bactérias, e podem crescer em alta concentração de sal e açúcar; - podem crescer em substratos com teores mto baixos de umidade (mais q bactérias); - necessitam de menos nitrogênio que as bactérias; - conseguem metabolizar carboidratos complexos, como lignina (maioria das bact. não); - crescem mais lentamente q bactérias (incubação 7-15 dias); é bom incorporar antibacteriano de amplo espectro (ex: cloranfenicol) para evitar bactérias; Cicloheximida diminui o crescimento de fungos saprofitas contaminantes de cultivos de fungos patogênicos; - em meios de cultivo, podem se desenvolver colônias de 2 tipos: leveduriformes (pastosas ou cremosas – unicel); e filamentosas (cotonosas, aveludades ou pulverulentas – hifas); - são heterotróficos: saprofíticos (nutrem-se de matéria orgânica (MO) morta); parasitários (MO viva); parasitas facultativos (MO morta e viva); mutualistas (liquens e micorrizas); FUNGOS FILAMENTOSOS – MORFOLOGIA - Hifas: filamentos q compõe o talo do fungo; podem ser septadas (Asco, Basidio e Deuteromycota; os septos tem poros que permitem passagem de citoplasma e núcleos) ou cenocíticas (Zygomycota). Elas crescem pelo alongamento das pontas (há movimento citoplasmático tendendo as pontas); as partes velhas se tornam vacuolizadas (qse sem citoplasma); - Corpos de Woronin: organelas em fungos septados com um único poro; qd a célula se danifica, a organela da cél adjacente se locomove até o poro, bloqueando-o. Ex; Ascomicetos. -Micélio: conjunto de hifas: micélio vegetativo (se desenvolve no interior do substrato, sustenta e absorve nutriente); micélio aéreo (se projeta na superfície e cresce acima do meio de cultivo); micélio reprodutivo (micélio aéreo se diferencia para sustentar corpos de frutificação ou propágulos); ** apesar o micélio vegetativo não ter fç de reprodução, alguns fragmentos da hifa podem se desprender e propagar (as cels fungicas são autônomas). CICLO alternando hifas vegetativas e reprodutivas: Hifa vegetativa produz hifa reprodutiva, que libera esporos, que germinam no substrato, desenvolvendo novas hifas vegetativas. -Pseudo-hifas: qd os brotos de organismos unicel não se destacam da cél mãe, foramando peqnas cadeiras (leveduras); LEVEDURAS – fungos não filamentosos: - fungos não filamentosos, unicelulares, reprodução por fissão binaria ou brotamento; - normalmente são ascomicetos, mas tb podem ser basídio ou deuteromicetos; - antibiótico efetivo: nistatinas; - pode ocorrer dimorfismos: ora unicelular, ora filamentoso; especialmente em spp patogênicas – o que define é a temperatura: 37°C – levedura; 25°C - hifas; - podem ser aeróbios (com O2 – respiração aeróbia: carboidrato,: CO2 + H2O. Ex: pao) ou anaeróbios facultativos (sem O2 – fermentação: carboidrato: etanol + CO2 – ex: vinho). IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS: - Leveduras: testes bioquímicos; - Outros fungos: aspecto físico: característica da colônia, tipo de micélio, corpos de frutificação (sexuais) e esporos reprodutivos (2 tipos: assexuais (ex: conidiosporo; mais frequente e resistente ao dessecamento) ou sexuais (menos frequente e menos resistente ao dessecamento, calor, congelamento e agentes químicos); ESQUEMA GERAL DE REPRODUÇÃO EM FUNGOS: (slide 43, aula 11): estágio haploide (n); ocorre fusão citoplasmática, iniciando estágio dicariótico (N+N), havendo fusão nuclear, formando o zigoto - estágio diploide (2n) – desenvolve-se; faz meiose, e retorna ao estagio haploide. *nem todas spp passam pelo estagio dicariótico. CICLOS DE VIDA: -CICLO DE VIDA DE UM CHYTRIDIOMYCETO (Allomyces arbuscula): esporícito maduro (2n) – os esporângios assexuadas tem paredes delicadas, e liberam zoósporos 2n, que germina, formando esporófito jovem, que matura em esporófito madura (CICLO ASSEXUADO); o esporócito maduro 2n também pode ter esporângios sexuados de resistência (2n), que, por meiose, liberam zoósporos haploides (n), que germinam, formando gametófito jovem, que se desenvolve, formando gametófito maduro (n), com gametângios masculino e feminino; eles produzem gametas, que se encontram, ocorrendo a fecundação, gerando zigoto 2n, gerando um esporófito jovem, que sedesenvolve em esporocito maduro (CICLO SEXUADO). -CICLO DE VIDA DE ZYGOMICETO (Rhizopus stolonifer): esporângio, libera esporangiósporos (n), do tipo + e -; o negativo pode formar rizoides, desenvolvendo novos esporângios (FASE ASSEXUADA); o esporângio + pode germinar, e irá se encontrar com um -, fformando um progametangio, que por Plasmogamia+Cariogamia forma um zigósporo 2n); o zigosporo sofre meiose e germina, se desenvolvendo em um esporângio (FASE SEXUADA). -CICLO DE VIDA DE ASCOMICETO LEVEDURIFORME (Saccharomyces cerevisiae): o estágio vegetativo haploide, por brotamento, pode gerar uma população vegetativa haploide (ASSEXUADA), ou pode formar, por plasmogamia e cariogamia, um estagio vegetativo haploide, que por brotamento, forma pop vegetativa diploide, e a celula vegetativa por meiose, formará ascósporos haploides (SEXUADA), que irão gerar o estágio vegetativo haploide, retomando o ciclo. -CICLO DE VIDA DE ASCOMICETO FILAMENTOSO: no fungo, em seu ascocarpo, existem croziers, em hifas ascógenas (n+n (2 tipos diferentes)), que por cariogamia formam asco jovem (2n), e ocorrem divisões meióticas formando ascósporos (n); o ascósporo germina, e se reproduz assexuadamente por esporos (conídios); isso gera um ascogonio e um anterídios, que formam um trigógine, e por plasmogamia formam hifas ascógenas (n+n), desenvolvendo o fungo em si, que contém tipos de hifas: estéreis (n) e ascógenas dicarióticas (n+n). -CICLO DE VIDA DE BASIDIOMICETO: o basidioma, contendo micélios 2arios e 3arios (n+n), por cariogamia formam basídio jovem (2n), que por divisões meióticas forma basidiósporos (n), que germinam e formam micélio 1ario monocariótico (n – 2 tipos); por plasmogamia, ele se juntam, formando um micélio 2ario dicariótico (n+n), gerando um basidioma jovem, que se desenvolve em basidioma, retomando o ciclo. LIQUENS: associações mutualísticas entre fungos e algas verdes OU cianobactérias. - o fotobionte (alga ou cianobact) fornece carboidrato, e o micobionte (fungo) fornece proteção (especialmente contra dessecamento); - 20.000 sp conhecidas; -maioria é de ascomicetos; alguns basídio e deuteromicetos; - 1as formas de vida q colonizam solo ou rocha recém expostos (ex: desastre natural), ´pois secretam ácidos orgânicos que lixiviam o substrato para absorverem os nutrientes; - crescimento mt lento: 1-2mm/ano. Talo do liquen: homônero ou heteromero (dividido em córtex (camada de hifa que cobre a superfície e as vzs a base), medula (hifa de fungo rodeando camada de alga), e rizina; 3 tipos de talos: folioso, crustoso e fruticoso). - talo composto ou dimorfico: combinação dos 3 tipos; o liquen começa o desenvolvimento com 1 tipo (primário) e depois desenvolve outros (2ario); o mais frequente é o crostoso-fruticoso, ou esquamuloso-fruticoso (fruticoso smpr 2ario) – chamados talos cladoniformes (típico da família Cladoniaceae); as hifas (micobionte) podem ser consideradas parasitas da fotobionte (aderem). REPRODUÇÃO DO TALO LIQUENICO: - Reprodução direta: se reproduz por meio de estruturas (sorédios ou isídios) que tem mico e fotobionte; - Reprodução indireta: pela produção de esporos sexuados ou conídios (assexuados) pelo micobionte; os conídios ou esporos sexuados devem encontrar a spp adequada do fotobionte na natureza e se associar por liquenização. Conidiomas: tecidos organizados do liquen que produzem conídios, que nascem no ápice das hifas modificadas, chamadas conidióforos.; o tipo mais comum é Picnídio. Ascomas: estruturas multinucleadas dos ascomycetos, os ascos, dentro dos quais ocorre rep sexuada (fusão nuclear e meiose); podem ser abertos (forma de xícara – Apotécio) ou fechados (esférico, forma de pera, com pqno poro por onde os ascósporos são liberados - Peritécio); linhas negras e sinuosas: Lirelas. Basidiomas: estrutura multinuclear dos basidiomicetos, contendo basídios (onde ocorre rep sex, com fusão nuclear e meiose). MICORRIZAS: - associação em fungos e raízes de plantas superiores. - fungos podem ser asco, basídio ou zigomicetos; ocorrem em 90% das plantas; - Podem ser Ectomicorrizas (ou micorriza asbuscular - maioria basídio – fungo forma camada do lado de fora da raiz – aumenta superfície; predominam zonas temperadas) ou endomicorrizas (maioria zigo – fungo penetra nas céls corticais, não perfurando a membrana celular – predominam zonas tropicais); ectendomicorriza (tipo intermediário). - Vantagem para as plantas: fungo transfere material (fosfato) de regiões mais distantes do solo para a planta; vantagem para o fungo: fotossintatos da planta são transferindo para o fungo (ectomicorrizos não decompõe celulose); * algumas orquideos não fotossintetizantes precisam de fungos micorrizicos que levem o carbono de outra planta fotossintética. AULA 12 – VIRUS Virus – “veneno”; Peter Medawar: “vírus é um pedaço de noticia ruim, embrulhado em proteína”. - vírus: são entidades infecciosas* diminutas não celulares, constituídas de DNA ou RNA envolvidas por capa proteica. Replicam-se somente em céls vivas, utilizando toda a maquinaria de biossíntese e de produção de energia da célula hosédeira para a síntese e transferência de copias de seu próprio genoma para dps invadir outras céls (parasitas obrigatórios). * nem sempre causam prejuízo, mas algum efeito no hospedeiro (ex: Tulipa) Tulip Breaking Virus (TBV): - é um Potyvirus, da família Potyviridae, q é dividida em 3 subgrupos: I: transmitidos por afídeos – Potyvirus; II: transmt por fungos – Bymovirus; III: transmt por ácaros – Rymovirus. - a infecção por esses vírus em plantas produz tulipas variadas (antes desejáveis, hoje indesejáveis (reduz tempo de vida, e deixa + frágil); IMPACTOS NAS POPULAÇÕES: doenças virais sempre tiveram grande impacto; epidemias de sarampo e varíola enfraqueceram império romano; varíola e outros dizimaram parte das populações locais durante as colonizações pelos europeus; a maior pandemia registrada por de gripe espanhola, 1918 (matou 50% da pop mundial); outras pandemias: Polio (1940-50); HIV (a partir 1980), gripe suína (2009-10); epidemias (Ebola (1970 e 90) e SARS (90). *varíola foi erradicada; pólio esta no caminho. HISTORICO DOS VIRUS: -1796 – Jenner vacinou criança contra varíola, mas não sabia qual era o agente da doença; -Pasteur atenuou vírus da raiva, criando a vacina; - Chamberland, associado de Pasteur, observou que agente da raiva não era retiro em filtro de bactéria; -1886: Adolf Mayer: doença do tabaco era transmissível; não conseguiu cultivar o agente infeccioso; -1887: Buist: observou corpúsculos de inclusão no citoplasma de cels próximas a lesões da varíola; -1892: Dimitri Iwanowski descobriu vírus da doença do tabaco; -1900: Walter Reed: descobriu q febre amarela era transmitida por mosquito; propôs o controle; -1915/17: Twort e d’Herelle descobriram vírus de bactérias (Bacteriófagos); -1935: Wendel Stanley (Nobel de química 1946): cristalizou vírus do mosaico do tabaco e descobriu natureza proteica dele; - Wimmer et al 1991 sintetizaram o vírus poliovirus “in vitro”. DIVERSIDADE DE VIRUS: podem infectar cels animais, vegetais ou microrganismos. - 2005: GenBank listou 3.142 sequencias diferentes de vírus; International Committee on Taxonomy od Viruses (2005) reconheceu e classificou 1.950; em 2012, 2.618. VIRUS – CARACTERISTICAS GERAIS: -tamanho: 10 a 100x menor que as cels bacterianas – de 0,02 a 0,3µm; filtráveis; observado só em microsc eletrônico; tamanho é influenciado pela qtidd de material genético; pequenos: parvovirus e picornavirus; grandes: poxvirus e herpesvirus. Mimivirus: vírus parasita da ameba Acanthamoeba polyphaga, foi confundido inicialmente com bactéria (0,4µm); Megavirus chilensis (2011, isolado no Chile – ainda não se sabe hospedeiro). - Constituição básica: cerne de acido nucleico envolto por capa proteica (capsídeo) = nucleocapsideo, que pode estar ou não envolvido por envelope lipoproteico = vírus envelopados e vírus nus. - Morfologia: poliédricos, esféricos, filamentosos ou complexos: resultado da simetriado capsídeo com presença ou não do envelope; 3 arranjos de capsídeo: helicoidal, icosaedrico e complexo. - Composição química: ácido nucleio (contem carboidratos (ribose ou desoxirribose), proteína do capsídeo e em alguns casos enzimas (penetrar na cel hospedeira e replicação (polimerases)); envelopes são lipoproteicos; glicoproteínas só em envelopes com espiculas. *Enzimas de virus: poucas enzimas próprias, relacionadas ao processo de infecção e replicação: lisozima (bacteriófagos); polimerases de ácidos nucleicos (transcrevem o acido nucleio viral em RNAm); neuraminidases (clivam ligações glicosídicas, auxiliam na liberação dos vírus da cel hospedeira). -parasitas obrigatórios; não tem maquinaria metabólica própria; controla o metabolismo do hospedeiro; SERES VIVOS? Eles encontram-se no limite entre o vivo e não-vivo – usa-se termos como “funcionalmente ativos” ou “inativos” (não vivo ou morto). - Virus complexo: cabeça icosaedrica ligada a cauda (formada por bainha contrátil, placa basal e dibras da cauda)- bacteriófago - Material genético viral: -quantidade: o grau de dependência do vírus com a cel hospedeira depende da qtid de material genético que possui; 3-4 genes (parvovirus (parvovirose de caes) e picornavirus (polipmielite, hepatite A)) e centenas de genes (herpes e poxvirus (varíola, vacinia, MCV)). -Tipos: os vírus possuem somente RNA ou DNA (exceção-citomegalovirus que tem DNA e um RNAm); podem ser DNAfu, DNAfd – linear ou circular; RNAfu*, RNAfd – linear (animais) ou circular (vegetais) (segmentado ou não). Virus de animais (encontramos tds os tipos de genoma); de plantas (RNAfu); de bactérias (DNAfd). *RNAfu+ (atua diretamente como RNAm, e pd sintetizar proteína assim q entra na cél) e RNAfu- (genoma complementar ao RNAm – molde direto para síntese RNAm) Virus de DNa: parvovirus, papovirus, adenovírus, herpesvirus, poxvirus; Virus de RNA: picornavirus, calicivirus, reovirus, flavivirus, ortomixovirus, rabdovirus; vírus de transcrição reversa (RNA-DNA): retrovírus (RNAfu) e Hepadnavirus (DNAfd) (tem RNA como mat genético; sintetiza DNA complementar ao seu RNA ao infectar a cel hospedeira, e usa o DNA como molde pra fabricar seu RNA (transcriptase reversa) – forma DNA fita dupla, que incorpora-se ao DNA da cel hospedeira, tornando-se hereditário nessa célula). REPLICAÇÃO VIRAL: Replicação: reprodução dos vírus, dentro da cel hospedeira – redirecionam os processos metabólicos da célula para sua reprodução. - Infecçao celular *: 1-ataques a sítios específicos da célula hospedeira; 2-penetração (vírus completo, nucleocapsideo, acido nucleico); 3-desnudamento (no caso de vírus completo); 4-Replicação e síntese de componentes virais; 5-Montagem e maturação (local é característico para o grupo); 6-liberação da progênie; * vírus de animais e plantas diferem de bacteriófagos nos mecanismos de penetração, síntese, montagem, maturação e liberação (devido a diferença entre cels pro e eucarióticas). BACTERIÓFAGOS: – HISTORICO: descoberto simultaneamente por Frederick W. Twort e Feliz d’Herelle: observaram de cultura de bactérias era degradada quando adicionado amostra de esgoto – o fator lítico foi batizado de bacteriófago. Fagoterapia: propuseram o uso dos bacteriófagos para eliminar bactérias patogênicas humanas – sem sucesso; pesquisas retomadas recentemente, devido a resistências com antibioticoterapia e melhor conhecimento sobre vírus. VANTAGENS da FAGOTERAPIA sobre a antibioticoterapia: ministrado em dose única (podem se replicar e não são diluídos pelos fluidos corporais); bacterias mutantes resistentes aos fagos são menos virulentas que as selvagens; velocidade das mutações em vírus é bem maior q de bactérias; fagos atingem somente os patógenos bacterianos (especificidade); em infecção intestinal, os fagos eliminamos junto com o material fecal auxiliam impedindo a disseminação da infeção. MORFOLOGIA E COMPOSIÇÃO QUIMICA DOS BACTERIÓFAGOS: - quimicamente idêntico aos outros vírus; maioria DNAfd; só um de RNAfd, nenhum RNAcircular. - 3 formas básicas: cabeça icosaedrica com cauda, cabeça icosaedrica sem cauda, filamentoso. - A cauda pode: ser curta ou 4x superior ao comprimento da cabeça; ser rígida ou flexível; ter placa basal (1 a 6 fibras). CLASSIFICAÇÃO E NOMENCLATURA – BACTERIOFAGOS: - nomes comuns – não tem regras (pd usar códigos); 1- comitê internac de táxon dos vírus agrupou as famílias com terminação viridae, segundo diferenças morfológicas e composição química. 2 Sistema de classificação segundo a replicação do genoma e síntese do RNAm (Baltimore em 1971) – Usado para TODOS OS VIRUS, não só bacteriófagos: agrupa vírus em 7 classes, com etapas replicativas semelhantes, independente de outras características. Classificação de Baltimore: Classes – descrição do genoma e estratégia de replicação; ex: vírus bacterianos; vírus de animais I – genoma DNA fita dupla (fd); ex: lambda, T4; Herpesvirus, poxvirus; II – genoma de DNA fita única (fu); ex: oX174; viru da anemia de galinhas; III – genoma de RNA fd; ex: o6; Reovirus; IV – genoma RNA fu, de sentido mais (+); ex: MS2; vírus da poliomielite; V – genoma de RNA fu, -; ex: Influenzavirus, vírus da raiva; VI – Genoma de RNA fu, cuja replicação envolve intermediário de DNA; ex: Retrovirus; VII – Genoma de DNA fd, cuja replicação envolve intermediário de RNA; ex: vírus da hepatite B. CICLO DE VIDA DOS BACTERIÓFAGOS: - 2 tipos de bacteriófagos: lítico ou virulento; e temperato ou avirulento. - fagos líticos: destroem a cél hospedeira após replicação - ciclo lítico: 1-adsorção (fixação) em céls e receptores específicos (reversível até fixação das fibras da cauda, irreversível qd pino é adsorvido), fagos filamentosos são adsorvidos pelo pelo F bacteriano; 2-Introdução do DNA após contração da bainha e penetração do tubo central, ou em sítios específicos, após rompimento da capa, liberando o acido nucleio que pentra na célula; 3- poucos minutos após a entrada do DNA, a cel perde a habilidade de se replicar ou transcrever o próprio DNA, e inicia fabricação de copias do DNA fagico; os fagos que tem RNA devem codificar suas próprias enzimas de replicação, pq as cels hospedeiras não tem enzimas que codifiquem RNA; 4-No fim do ciclo de replicação, os fagos sintetizam proteínas para montagem do virion, enzimas para maturação e liberação dos fagos; 5-agregacao das proteínas para formação da cauda e da cabeça separadamente; condensação do acido nucleico e entrada na cabeça e fixação da cauda na cabeça; 6-liberacao dos fagos pela endoslisina, e nos fagos filamentosos, a liberação é por dobras na PC (extrusão), sem causar lise. *TABELA: comparação das fases de bacteriofaso x vírus animal (slide 38, aula 12). - fagos temperados: não destroem a cel hospedeira, mas se integram ao seu genoma, e se replicam nas sucessivas gerações sem lise (ciclo lisogênico) – a lisogenia só ocorre em fagos de DNAfd; eventualmente pode ser tornar lítico em alguma geração. Ciclo lisogênico (DNAfd): rápida produção de RNAm, proteína supressora inibe fç lítica rapidamente, determinando se o ciclo sera lítico ou lisogênico. DNA do gado é inserido no cromossomo, em local determinado (só fago Um não tem local determinado); se em qualquer momento o repressor for inativado (ex: enzima protease ou UV), inicia-se o ciclo lítico; *algumas bactérias tem profagos (DNA viral insrido do cromoss bacteriano em ciclo lisogênico), produzindo toxinas (Clostridium botulinum e Corynebacterium diphteriaeI), como consequência da lisogenia. -Lisogenia não-integrativa (mais rara): após infecção, DNA viral circulariza-se e é reprimido, permanecendo livre no citoplasma (plasmídio); ele se divide sincronicamente com a cel bacteria CICLO LITICO E LISOGENICO: No LITICO, 1 e 2:adsorção e penetração, o DNA do gao se insere como um profago no cromossomo da bactérias, criando forma profagica; ela vai iniciar o ciclo LISOGENICO, replicando o fago com o DNA da bacrteria antes da divisão binaria, que se completa, e cada celula fica com o DNA do fago incorporado;voltando as forma profágica, ocorre 3:biossíntese, 4 maturação, montagem e por fim 5:liberação. (SLIDE 41, aula 12). TRANSDUÇÃO GENERALIZADA: consequência da infecção viral em bactérias: um fago infecta a cel bacteriana (cel doadora), fragmentando o cromossomo bacteriano; na montagem do fago, fragmentos de DNA bacteriano são empacotados no capsídeo do fago; ocorre lise e a cel doadora libera fagos contendo DNA bacteriano; esse novo fago infecta uma nova cel hospedeira, receptora; a recombinação pode ocorrer, produzindo celula recombinante com genótipo parte da cel doadora e parte da receptora. TRANSDUÇÃO ESPECIALIZADA: consequência da lisogenia: progafo existe em uma cel bacteriana hospedeira que usa galactose (ex: tem o gene gal); o genoma do fago é removido, e o fago é eliminado por lise, levando o gene gal com ele; o fago infecta uma nova celula, incapaz de produzir galactose (sem gene gal); o heme gal se integra ao DNA do novo hospedeiro, juntamente com o profago. VIRUS DE ANIMAIS: -sistema de classificação diferente pra animal e vegetal. -existe interação especifica vírus-celula mais importante em vírus animais; em plantas, os vírus parecem não requerer receptor especifico pra se fixar na cel. -penetração e desnudamento de diversas formas: fusão da membrana com envelope viral; englobamento dos vírus envelopados por vacúolos (capsídeo digerido por enzimas lisossomais e ácido nucleico liberado no citoplasma); ou nos não envelopados, a parede do vaúola pode ser reabsorvida ni interior da cél pelo complexo de Golgi (endocitose). - penetração dos vírus em planta é dificultada pela parede celular – forma mais comum é infecção por insetos ou por poros na PC. TABELA: principais grupos taxonômicos de vírus animais. EFEITOS dos vírus em CÉLULAS ANIMAIS: transformação de céls normais em tumorais; morte celular por lise, em infecção lítica; infecção persistente, com liberação lenta dos vírus, sem morte celular; infecção latente, com presença dos vírus sem causar dano celular (posteriormente desenvolve infecção lítica). VIRUS DE PLANTAS: tipo mat genetico; família; Genero; Método de transmissão: - DNAfd não envelopado; Papovaviridae; Virus do mosaico da couve-flor; afídios. - RNAfu+, não envelopado; Picornaviridae; Virus do mosaico do feijão; Pólen. - RNAfu+, não envelopado; Tetraviridae; Tobavirus; Lesões; - RNAfu-, envelopado; Rhabdoviridae; Virus d nanismo amarelo da batata; Cigarras e afidios; - RNAfd, não-envelopado; Reovirus; Wound tumor vírus; Cigarras. INFECÇÃO: as plasntas são infectadas por virs pelas paredes celulares (poros) e passam para as outras células pelos plasmodesmos; CULTIVO DE VIRUS: CULTIVO DE BACTERIÓFAGOS: - podem ser isolados e cultivados em culturas de bactérias jovens, em meio liquido ou solido; no solido, a lise bacteriana é evidenciada por zonas claras ou placas sobre camada opada de cels (tapete); considera q cd placa foi formada por um vírus, e conta-se o numero de placas no tapete para estimar o numero de fago (UFP –unid formadora de placas) = ensaio em placa; - o melhor local para isolar fagos é seu habitat. Ex: colífagos – agua de esgoto; após a coleta, o material é filtrado ou centrifugado para remover material particulado, e add clorofórmio pra matar as bactérias; inocula-se o vírus ao hospedeiro e espalha-se em meio solido. CULTIVO DE VIRUS ANIMAIS: para estudos e produção de vacinas; 3 tipos: - cultivo em animais vivos: método caro, trabalhoso, pd ter contaminação; em alguns casos (hepat B) é o único meio de cultivo; importante pra ver resposta imune do hospedeiro ; animais: camundongos, colehos, primatas. - em ovos embrionados de galinha: método econômico; conveninete para uma variedade de vírus animais por terem vários tipos de cels e tecidos; -em cultura de células: mais usado; causam alteração visível na cultura quando a invadem (efetio citoático ECP); estima densidade semelhante a de bacteriófagos (ensaio em placa). CULTIRVO DE VIRUS DE PLANTAS: - suspensão viral, obtida de plantas infectadas, é introduzida por seringa ou escarificações na planta; o efeito pode ser local ou generalizado; uso de protoplastos (cels vegetais com PC removidas); culturas em monocamadas de cels de inseto transmissores de doenças de plantas. AGENTES INFECCIOSOS SEMELHANTE A VIRUS (VIRUSLIKE): VIROIDES: os menores agentes infecciosos conehcidos; só em plantas (ex: doença da fruta pálida do pepino); tem RNAfu circular ou RNAfd linear (sem capa proteica) e não codificam proteínas, se localizando no núcleo (usa RNA polimerase do hospedeiro pra replicação); não se sabe ao certo como causam as doenças, mas parece que silenciam alguns genes importantes do hospedeiro. PRÍONS: Proteinaceus infectius particle: partículas proteicas infecciosas, que não tem ácidos nucleios, e são capazes de se reproduzir dentro das cels; todas as doenças causadas são neurológicas (ex: Kuru ou doença de Creutzfeldt-Jacob; “scrapie” de ovelhas, mal da vafa louca, e suspeita-se do mal de Alzheimer); doenças transmissíveis e de evolução lente (medida em anos, não em dias ou horas, como os virus); eles são proteínas que se enreolam incorretamente e se agregam; ex: PrPc (proteína príon celular normal) se transforma em PrPsc (proteína príons associada a scrapie) – leva a reação em cascata. A doença da vaca louca causa lesões espongiformes no tecido cerebral, formando furos, espaços vazios. COMPARAÇÃO DE VIRUS, VIROIDES E PRIONS: -Acido nucleico: DNAfs, DNAfd, RNAfs, RNAfd; RNAfs; não tem. -Presença de capsieo ou envelope: sim, não, não. -presença de proteína: sim, não, sim. -necessidade de vírus auxiliares: alguns precisam; não, não. -observado por: microscopia eletrônica; identif da seq de nucleotídeos, danos na cel hosp. -afetado pelo calor e subst desnaturadora: sim, não, não. - afetado por radiação e enzimas q digerem DNA e RNA: sim, sim, não. -hospedeiro: bactérias, animais ou vegetais; vegetais; mamíferos. VIRUDÓIDES: antes chamados de vírus de RNA satélites. - similares aos viroides (RNAfu), mas são circulares e codificam 1 ou+ produtos genéticos, e precisam de vírus ajudante pra infectar a cel hosp.; vírus ajudante fornece produtos de genes e outros materiais para o vírusoide completar o ciclo de replicação; + estudado: vírus da Hepatite D humana, que usa o vírus da hept B como ajudante. VIRUS E CANCER: reconhecidos + de 100 tipos de câncer distintos. 1908: 1ª evidencia de que alguns canceres eram causados por vírus (lecemia de galinha podia ser transferida por soro sanguíneo); no homem, a maioria é vírus de DNAfd e retrovírus (HTLVI e II: ligados a leucemias); vírus da hepatite B e C, vírus Epstein-Barr (mononucleose); herpesvirus humano 8, e papiloma vírus humanos (linhagens). Os vírus causador de câncer são oncogenicos, pois transformam as céls, p ex, p perda da inibição por contato; o genoma viral integra-se ao DNA da cel hospedeira, e a cel não sofre lise. ESTERELIZAÇÃO E METODOS DE CONTROLE DE VIRUS: inativação: perda permanente da infecciosidade, pra esterilizar ou manter as propriedades virais (importante pra produção de vacinas; tb pode usar vírus atenuado); grau de inativação depende da exposição dos virions aos agentes inativantes (tempo X intensidade X concentração); agentes inativantes: nucleotropicos, proteotropicos, lipotropicos ou universais. AGENTES usado na INATIVAÇÂO: calor (desnatura proteína – efeito limitado); luz UV (age nos ácidos nucleicos, danos podem ser reparados); formaldeído (age em proteínas e ac nucleicos – usado na produção de vacinas inativadas); oxido de etileno (age nos ácidos nucleicos – eficaz para todos os vírus); solventes de lipídeos (éter ou clorofórmio – age no envelope – usado pra distinguir vírus nus e não); enzimas proteolíticas (inativam facilmente outras enzimas). VIRUS X SANEAMENTO: vírus problemáticos transmitidos pela agua: gastroenterite, hepatite A e E. Gastroentericos são mais persistentes em ambientes naturais e mais resistentes ao tratamento (não afetado pelo Cl – como detectar?PCR, e testes em placa para bacteriófagos de bactérias entéricas, como indicador de vírus entéricos. VIRUS X ECOLOGIA X INDUSTRIA: - em ambientes aquáticos, os vírus são importantes pra controlar populações naturais de bactérias e entéricas, fungos, protozoários, algas e cianoprocariotos; importantes controladores d “blooms” algais; toxicidade de algumas linhagens de cianobactéria pode ser por infecção viral; fagos causam prejuízo em indústria de lacticínios, produtoras de antibióticos e de aminoácidos. GLOSSÁRIO: -corpusculos de inclusão: agregados ou “colônias” de virusem multiplicação no citoplasma ou núcleo de cles hospedeiras; em algumas doenças permitem o diagnostico (ex: raiva); -capsideos: capa proteica que envolve o material genético. -protomeros: proteínas virais. -capsômeros: grupos de protomeros visíveis ao microscópio eletrônico, e seu numero no capsídeo é cartacteristico para cada grupo de vírus. -nucleocapsideo: capsídeo+acido nucleico (enovelado). -virion: estrutura viral completa. -envelope: camada membranosa lipoproteica que envolve o nucleocapsideo -espículas: projeções de glicoproteínas que podem estar presentes no envelope e serem importantes na fixação do virion. -virion nu: sem envelope. -DNAfd: DNA fita dupla; DNAfu: DNA fita única; RNAfd; RNAfu. -bacteriófagos: vírus que infectam bactérias (“comedor de bactérias”). -colífagos: bacteriófagos que infectam a bactéria E. coli
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