experimento 10 - determinação de parametros cineticos de reações catalisadas por enzimas

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Universidade Federal de Santa Catarina
Experimento 10: DETERMINAÇÃO DE PARÂMETROS CINÉTICOS DE REAÇÕES CATALISADAS POR ENZIMAS
Departamento de Química
QMC 5453 – Laboratório de Físico-Químico Experimental
Professor: Nito Angelo Debacher
Turma: 03102 C
Grupo: Guilherme Nicácio, Isadora Freitas, Elza de Souza.
Florianópolis, 6 de novembro de 2018
INTRODUÇÃO
 Enzimas são moléculas orgânicas de natureza proteica que agem nas reações químicas das células como catalisadoras, ou seja, aceleram a velocidade dos processos sem alterá-los, geralmente são os catalisadores mais eficazes, por sua alta especificidade.
 Uma das explicações para a eficiência das enzimas é que estas formam com o reagente (substrato) um complexo (ES) com uma conformação bem próxima à do estado de transição da reação, reduzindo desta forma a energia de ativação do processo. A região da molécula onde a enzima e o substrato interagem é denominada de centro ativo. Outra característica importante da enzima é a sua especificidade. Cada enzima combina-se com um substrato bem específico ou com uns poucos bem semelhantes em estrutura, sugerindo que enzima e substrato encaixam-se num sistema chave-fechadura.
 Neste experimento, foi possível utilizar as enzimas presentes na batata para determinar os parâmetros cinéticos de reação por enzimas por espectrofotometria.
OBJETIVOS
 Acompanhar um processo reacional por espectrofotometria e determinar os parâmetros cinéticos de reações catalisadas por enzimas.
 
MATERIAIS UTILIZADOS
Reagentes:
 ¼ de batata crua, solução aquosa 0,05 mol L-1 de catecol;
Água deionizada;
Peróxido de hidrogênio ~10%;
Cubos de gelo.
Vidrarias: 
 1 balão volumétrico de 100 mL;
 4 cubetas de 3 mL para espectrofotômetro;
 1 béquer de 100 mL;
 1 pipeta graduada de 1 mL
 1 pipeta graduada de 2 mL;
 1 pipeta graduada de 5 mL;
Equipamentos: 
Cronômetro;
Termômetro;
Espectrofotômetro UV-Visível e cubetas;
Balança;
Outros: 
1 ralador/amassador de batatas;
1 faca para legumes;
1 recipiente para banho de gelo;
Frascos lavadores com água deionizada.
METODOLOGIA
Reservamos 100 mL de catecol 0,05 mol L-1 que já se encontrava na bancada do experimento.
Ralou-se ¼ de uma batata e em seguida a espremeu, recolhendo o líquido num béquer pequeno(cerca de 1,0 mL), colocando o mesmo em um banho de gelo para retardar a oxidação. Ligou-se o espectrofotômetro e regulou o zero de absorbância no comprimento de onda máximo de absorção da quinona ( max = 458 nm). 
Foram feitos 4 experimentos variando os volumes de catecol 0,05 molL-1( 0,5 mL, 0,75 mL, 1.0 mL e 1.5 mL) completando o volume na cubeta para 3 mL com água e em seguida adicionando uma gota de H2O2 10 % em volume.
PROCEDIMENTO
 Foram adicionados 0,5 mL de catecol 0,05 mol L-1 + 2,5 mL de água na cubeta, adicionou-se uma gota de H2O2 10 % em volume ( volume final na cubeta: 3,0 mL), feito isso, a cubeta foi colocada no suporte de amostra do aparelho (espectrofotômetro) e “acertado” o zero da absorbância. Anotamos o valor indicado. Retirando a cubeta do aparelho, foi adicionado uma gota do extrato de batata e agindo com rapidez agitou-se vigorosamente a solução e em seguida, colocou-se no aparelho novamente e o fechou. Com isso, foi efetuada a primeira leitura de absorbância disparando simultaneamente o cronômetro( esta operação foi feita rapidamente, pois a reação se inicia ao adicionar o extrato de batata no catecol). Foram feitas leituras de 20 em 20 segundos até aproximadamente 6 min, anotando os valores na tabela 1 que se encontra abaixo.
Repetiu-se os procedimentos acima variando as quantidades de catecol, conforme tabela, sempre completando o volume final na cubeta com água até 3,0 mL.
 Com o produto final foi feito um espectro da reação variando o comprimento de onda de 400nm a 530 nm, anotando o valor da absorbância a cada 10 nm ( tabela 2).
Tabela l: relação do tempo em segundos para absorbância em diferentes concentrações de catecol.
	 
	0,5 mL de catecol 0,05 molL-1 
+ 2,5 mL de água
	0,75 mL de catecol 0,05 mol L-1
+ 2,25 mL de água
	1,0 mL de catecol 0,05 mol L-1
+ 2,0 mL de água
	1,5 mL de catecol 0,05 mol L-1
+ 1,5 mL de água
	Tempo (s)
	Abs
	Abs
	Abs
	Abs
	0
	0,172
	0,291
	0,282
	0,221
	20
	0,291
	0,484
	0,379
	0,321
	40
	0,313
	0,616
	0,461
	0,372
	60
	0,370
	0,724
	0,525
	0,401
	80
	0,419
	0,816
	0,579
	0,433
	100
	0,439
	0,890
	0,623
	0,455
	120
	0,494
	0,946
	0,650
	0,473
	140
	0,524
	0,991
	0,677
	0,485
	160
	0,549
	1,030
	0,695
	0,497
	180
	0,571
	1,043
	0,712
	0,501
	200
	0,589
	1,090
	0,724
	0,509
	220
	0,604
	1,110
	0,733
	0,513
	240
	0,617
	1,127
	0,747
	0,519
	260
	0,630
	1,144
	0,749
	0,521
	280
	0,639
	1,155
	0,755
	0,525
	300
	0,649
	1,164
	0,761
	0,526
	320
	0,655
	1,166
	0,765
	0,531
	340
	0,663
	1,176
	0,769
	0,534
	360
	0,669
	
	0,773
	0,539
Tabela ll: comprimento de onda para a absorbância no término do experimento.
	Comprimento de onda (nm)
	Abs
	400
	1,003
	410
	0,871
	420
	0,769
	430
	0,763
	440
	0,855
	450
	0,899
	460
	0,792
	470
	0,681
	480
	0,595
	490
	0,495
	500
	0,399
	510
	0,333
	520
	0,315
	530
	0,345
Com base nos dados apresentados na tabela I, foi possível calcular as diferentes concentrações de catecol ao final dos experimentos.
4. Cálculos
Concentração do catecol: 0,05 mol/LFórmula utilizada: 
Solução Experimento 1: 0.05x0.5
Solução Experimento 2: 0,05x 0,75
 			
Solução Experimento 3: 0,05x 1
Solução Experimento 4: 
2. Gráficos no papel milimetrado em anexo
Para a segunda solução: 
Para a terceira: 
Para a quarta: 
Para a primeira: 
3. A constante de Michaelis-Manten (Km) é caracterizada onde a concentração para a qual a velocidade da reação enzimática é a metade de Vmáx. Como a constante é a formação do produto, pelo tempo decorrido tem-se a unidade mol/s. Devido aos erros experimentais e de medidas, fica nítido que o valor teórico e o experimental se divergem um pouco. Devido à possíveis erros experimentais, houveram dois valores que não ficaram lineares. Esses valores foram excluídos para fins de descobrir Km e Vmax.
Km = 
4. Gráfico em anexo.
Na elaboração do gráfico é possível perceber o comprimento de onda em que há uma melhor absorção para a amostra, que seria o mais adequado para as análises.
5. Questionário
5.1. Defina as enzimas? O que é substrato?
Enzimas são catalisadores biológicos, são proteínas com alta especificidade. Elas atuam baixando a energia de ativação de uma reação, fazendo com que a sua velocidade aumente, mas não interferindo no processo. 
Substrato é o reagente da enzima, o alvo que será realizado 
5.2. Que fatores podem explicar a alta eficiência das enzimas como catalisadores?
Uma das explicações para a alta eficiência da enzima é como o complexo enzima substrato apresenta uma conformação bem próxima do estado de transição da reação, reduzindo desta forma a energia de ativação.
5.3. Defina Km e Vmax e discuta seu significado (Veja Equação 2). Quais as unidades de Km e Vmax.
Vmax é a velocidade máxima atingida quando são alcançados valores altos para a concentração do substrato. A velocidade se mantém constante e passa a ser independente da concentração; sua unidade é dada por [unidade de concentração/s].
Km é a concentração do substrato necessária para que a velocidade da reação catalisada pela enzima seja metade da velocidade máxima possível. Quanto maior o valor dessa concentração, menor a afinidade entre a enzima e o substrato; as unidades de Km são g/L e mol/L.
5.4. O que é inibidor enzimático e quais os principais fatores que diminuem a atividade de uma enzima para atuar como catalisador?
Inibidores enzimáticos são substâncias que podem diminuir a velocidade de uma reação catalisada por uma enzima. A atividadede uma enzima pode ser diminuída pelo aumento da temperatura e pH que desnaturam as proteínas enzimáticas, diminuindo suas concentrações, pela diminuição da concentração do substrato, além da própria atividade dos inibidores que se ligam à enzima, diminuindo sua afinidade pelo substrato.
5.5. O que acontece se você mudar o pH ou a temperatura do meio reacional e mantiver a concentração de enzima e substrato constantes? Explique.
pH: a concentração de H- afeta a velocidade de reação, o processo catalítico geralmente requer que a enzima e o substrato tenham determinados grupos químicos em um estado ionizado ou não ionizado para interagirem. Além disso alterações bruscas no pH podem levar à desnaturação da proteína, que depende do caráter iônico das cadeias laterais dos aminoácidos. 
Temperatura: com o aumento da temperatura, aumenta também a velocidade da reação até um certo pico de velocidade devido ao aumento do número de moléculas com energia suficiente para atravessar a barreira de energia e formar os produtos da reação; um aumento excessivo da temperatura também pode levar à desnaturação da proteína enzimática, causando a diminuição da velocidade da reação.
5.6. Cite dois exemplos de enzimas que atuam em sistemas biológicos e explique a sua atuação. 
Enzima fosforofrutoquinase-1: atua na regulação da glicose, catalisando as reações de fosforilação da frutose-6-fosfato para frutose-1-6-difosfato.
Enzima citrato sintetase: atua no Ciclo de Krebs catalisando a reação de transferência do grupo acetil, proveniente da Acetil-CoA, para o oxaloacetato, formando o ácido cítrico e liberando a Coenzima A.
5.7. Que tipos de resíduos químicos foram gerados neste experimento, e como foram tratados? Explique.
Foram gerados soluções de catecol, H2O2, H2O, resíduos da batata ralada e o próprio líquido extraído da batata. A batata ralada pode ser descartada no lixo orgânico, uma vez que não causa danos ao ambiente. O extrato de batata não utilizado pode ser descartado na pia, assim como as soluções geradas ao final do experimento.
5.8 Assista ao vídeo e discuta sobre as reações do processo de escurecimento enzimático de frutas.
O escurecimento enzimático é causado pelas enzimas polifenolxidases, encontradas nas frutas e vegetais. Essa reação auxilia na proteção interna das frutas (já que quem faz essa função na parte externa é a casca) e induz na cor, sabor e perdas nutricionais do alimento.
Quando a fruta é danificada, as enzimas presentes nos plastos entram em contato com seu substrato, devido à exposição do oxigênio. Lembrando que isso não sugere que a fruta esteja imprópria para o consumo.
O substrato utilizado é o que decidirá qual enzima será acionada, podendo ser ela: tirosinase, creolase, polifenolase, catecol oxidase, catecolase e fenolase.
5.9 Quais as enzimas do grupo das Polifenoloxidase?
As enzimas que compõem o grupo das polifenoloxidases são: tirosinase, creolase, polifenolase, catecol oxidase, catecolase, fenolase.
6. Conclusão
Ao realizar o experimento, foram analisados aspectos cinéticos catalisados por enzimas, por meio de diferentes concentrações de substrato. A eficácia da enzima é devido, principalmente, ao avançado grau de especificidade da mesma pelo substrato. 
A concentração do substrato também é um fator importante para a velocidade da reação enzimática. A equação de Michaelis-Menten representa a atuação enzimática em relação à concentração do substrato.
Notou-se ainda que a absorbância aumentou bruscamente até 80 segundos do experimento, e após esse instante foi aumentando gradativamente, alcançando aos poucos uma leve estabilidade. Além disso, nas maiores concentrações, a absorbância tende a se manter constante mais rápido.
7. Bibliografia
6.1. LEHNINGER, A.L., Princípios de Bioquímica, Editora Sarvier, SP, 1991.
6.2. FLORENCE, A.T, ATTWOOD, D., Princípios Físico-Químicos em Farmácia, São Paulo, USP, 2003
6.3 CHANG, R., Physical-Chemistry with Applications to Biological Systems. Macmillan Publishing Co. New York, 1981.
6.4. TINOCO, I. JR., SAUER, K.,WONG, J. C., Physical Chemistry. Principles and Applications in Biological Sciences. Prentice-Hall, London. 1982.
6.5. ATKINS, P.W., Physical-Chemistry, Oxford, 5a Edição, 1994.