2-estratégias de clonagem para sequenciamento

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11-May-14 
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Genômica e Proteômica 
Clayton L. Borges 
clayton@icb.ufg.br 
clbluiz2@gmail.com 
TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE 
 
À partir do conhecimento da molécula de DNA, os cientistas agora querem 
administrar essa fábrica de proteínas!! 
 
DNA – molécula relativamente simples e muito regular; varia só nas 4 bases (com 
caract. químicas muito semelhantes) e são macromoléculas com as mesmas 
propriedades químicas. 
 ↓ 
pelo comportamento químico é impossível separar uma molécula de DNA 
 ↓ 
TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE 
 ↓ 
O DNA é extraído da célula com o gene de interesse – cortado em fragmentos 
menores de modo controlado - cada fragmento é ligado em uma outra molécula de 
DNA – célula hospedeira 
 ↓ 
célula com a molécula híbrida, passa a copiá-la, duplicando-a em cada divisão 
celular – com grande quantidade da molécula é possível localizar o gene. 
 
Isolar o gene – multiplicá-lo e obter grande quantidade da proteína 
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 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO (endonucleases) 
 
 
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2. Introdução à Engenharia Genética 
 
 Utilizando as enzimas de restrição 
bacterianas, tornou-se possível cortar dois DNAs 
diferentes e, pela ação de enzimas ligases, unir os 
segmentos resultantes e formar um DNA 
recombinante - Tecnologia do DNA Recombinante – 
início da Engenharia Genética. 
 
 Assim, os cientistas têm desenvolvido técnicas 
que possibilitam transferir os genes de um tipo celular 
para outro (por exemplo, de plantas e animais para as 
bactérias). 
 
 
 
 Aplicações comerciais: o futuro da 
engenharia genética é considerado muito amplo, 
sendo que já resolveu alguns dos maiores problemas 
de pesquisa. Por exemplo, genes que codificam a 
produção de compostos importantes, com produção 
reduzida em seu tecido normal, podem ser 
retirados de células animais ou vegetais e inseridos 
na célula bacteriana- esta sintetiza em 
quantidades ilimitadas os produtos codificados pelos 
genes. Muitos exemplos de sua aplicação são 
observados na medicina. 
 
 Outra aplicação importante é a 
transformação de plantas, animais e microrganismos 
para a obtenção de Transgênicos (OGM). 
 
 
 
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3. Importância dos Microrganismos e das Enzimas na 
Engenharia Genética 
 
 As células animais e vegetais usualmente não podem 
ser cultivadas para produção de compostos específicos – 
estas perdem a habilidade de síntese quando são isoladas e 
cultivadas em laboratório. Também , o cultivo de células de 
tecido em laboratório é dispendioso e requer meios 
complexos altamente enriquecidos. 
 
 Uso de microrganismos – medicina: altamente 
empregado, pois evita muitos dos problemas associados com 
a obtenção de compostos importantes (insulina, interferom, 
hormônios, etc.). As bactérias que carregam os genes para 
os mais diversos compostos, podem ser cultivadas 
indefinidamente. 
 
 
 
 
 Por meio da introdução de genes estranhos em 
microrganismos, é possível desenvolver cepas que oferecem novas 
soluções para problemas diversos, como poluição, escassez de 
alimento e energia , controle de doenças e até mesmo terapia 
gênica. 
 
ENZIMAS: fundamental para a tecnologia do DNA 
recombinante. 
 
•Endonucleases de restrição: apresentam papel fundamental, 
clivando o DNA em seqüências específicas, gerando um 
conjunto de fragmentos menores. 
•DNA ligase: os fragmentos separados para serem clonados 
podem ser unidos a um vetor de clonagem apropriado usando 
a DNA ligase. 
 
 Assim, o vetor recombinante é introduzido numa célula 
hospedeira que o “clona”, a medida que a célula realiza muitas 
gerações de divisões celulares. 
 
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 Vetores de Clonagem 
 
 Plasmídios – bacteriófagos – cosmídios - E. coli. 
 
Plasmídios : moléculas de DNA circulares que se 
replicam separadamente do cromossomo 
hospedeiro. 
-Plasmídios bacterianos naturais – 5.000 
a 400.000 pares de bases. 
-Plasmídios introduzidos nas células por 
técnicas de transformação 
 
Utilizados para clonar segmentos de DNA até 
15.000 pares de bases. 
 
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 Construção de uma Bactéria pela Engenharia 
Genética 
 
•Obtenção do gene do organismo doador ou, em 
alguns casos, pode ser sintetizados em 
laboratório pôr nucleotídeos artificiais. 
•DNA plasmidial (ou outro vetor de clonagem) é 
isolado para servir como carreador de 
determinado gene. 
•O DNA doador e o plasmidial são tratados 
com a mesma enzima, uma endonuclease de 
restrição, que cliva o DNA, formando fitas 
simples com terminais complementares 
(“terminais coesivos”). Esses são capazes de 
ligar-se a outros fragmentos de DNA que 
apresentam o mesmo terminal complementar 
das fitas simples. 
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•O terminal coesivo de um fragmento de 
DNA doador liga-se com o terminal coesivo 
do DNA plamidial através da DNA ligase 
→ plasmídio com o fragmento do DNA 
doador. 
•O plasmídio é adicionado a uma suspensão 
de bactérias receptoras  
transformação. 
•As bactérias geneticamente construídas 
são propagadas em grande quantidade e o 
produto (proteína) codificado pelo gene 
transferido é extraído da cultura e 
purificado. Ou outro caminho é colocar 
esta bactéria transformada com outro 
tecido e fazer a transferência do gene. 
 
 
Isolamento e amplificação 
de plasmídios 
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Bacteriófago λ : clonagem de segmentos de 
DNA maiores. Bacteriófago λ – 48.502 pares 
de bases. 
Clonagem do DNA no Bacteriófago λ é baseado 
em duas carcaterísticas-chave do genoma do 
genoma do λ: a) um terço do genoma não é 
essencial e pode ser substituído pelo DNA 
estranho b) o DNA será empacotado em 
partículas do fago infecciosas, apenas se 
possuírem entre 40.000 e 50.000 pares de 
bases de comprimento. 
 
Utilizados para clonar fragmentos de DNA até 
23.000 pares de bases. 
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Cosmídios : plasmídios recombinantes com 
características úteis tanto dos plasmídios 
quanto do bacteriófago λ. 
Cosmídios – são moléculas de DNA circulares 
pequenas (5.000 a 7.000 pares de bases), 
que contém: 
 
a) uma origem plasmidial de replicação; 
b) um ou mais marcadores de seleção; c) um 
certo número de sítios únicos de restrição 
onde o DNA estranho pode ser inserido e; 
d) um sítio cos (seqüência de DNA do 
bacteriófago λ). 
 
Utilizados para clonar fragmentos de DNA 
até 45.000 pares de bases. 
 
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PORQUE CONSTRUIR UMA MOLÉCULA DE DNA 
RECOMBINANTE? 
- ESTUDO DA ESTRUTURA DOS GENES 
- DIAGNÓSTICO CLÍNICO 
- TERAPIA GÊNICA 
- MELHORAMENTO ANIMAL E VEGETAL 
- OBTENÇÃO DE GRANDES QUANTIDADES 
DE PROTEÍNAS RARAS. 
- CONSTRUÇÃO DE BIBLIOTECAS DE 
GENES 
 
Vetores de clonagem 
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Isolamento de um gene 
específico 
Como exemplo – gene humano 
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C-DNA – um auxílio na 
identificação de genes 
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 Quanto maior o número de fragmentos ou clones 
produzidos, mais difícil será encontrar o clone com o 
gene de interesse. 
 
 
 
 BANCOS GENÔMICOS DE ORGANISMOS 
COMPLEXOS (P. EX. HOMEM), DEVEM SER 
CONSTRUÍDOS COM FRAGMENTOS DE DNA 
NÃO MUITO PEQUENOS. 
 
 BANCO CROMOSSÔMICO - Banco genômico para 
cada cromossomo. 
 
 CROMOSSOMOS - são isolados por fluorescência.