Sequenciamento de sanger

Prévia do material em texto

Sequenciamento de sanger 
Clayton L. Borges 
SEQUENCIAMENTO 
Sequenciamento de Sanger 
Eletroforese em Gel de Poliacrilamida 
C 
G 
T 
A 
C 
G 
C A T G 
__ 
 __ 
 __ 
 __ 
__ 
 __ 
3’ 
 
 
 
 
5’ 
Os fragmentos perto da base do gel (curtos, migram mais rápido) 
representam as posições dos nucleotídeos mais próximas ao 
primer (extremidade 5’) e a seqüência é lida na direção 5’  3’, 
a partir da base até o topo. 
Sequenciamento Automático: Eletroforese Capilar 
G 
C 
T 
A 
+ 
_ 
C 
G 
T 
A 
C 
G 
3’ 
 
 
 
 
5’ 
Laser Detector 
Feixe de 
Laser 
Sequência da fita 
complementar 
Eletroferograma 
5’ 3’ 
Cromatograma – Resultado gerado pelo computador 
depois que as bandas (segmentos de DNA) migraram 
pelo detector. 
G C A T G C 
Sequenciador Automático 
Placa de 96 poços (amostra), à esquerda, na qual entram 96 tubos 
capilares de vidro cobertos com plástico marrom. A eletroforese do DNA 
ocorre nesses tubos, preenchidos com matrix, da esquerda para a 
direita. 
Fonte de Laser, ao centro, que emite raios laser através de uma 
pequena seção dos tubos capilares, onde não há a cobertura de 
plástico. O laser excita os fluoróforos e a luz emitida por cada base (4 
cores distintas) é detectada por um fotomultiplicador. 
Tela do computador conectado ao sequenciador, mostrando a imagem 
da “corrida”. Eletroferograma mostrado na parte inferior da foto. 
VÍDEO: Cycle Seq 
AATGCCGGCTGTCCATTGAGCGAGTGTA 
37 37 37 37 37 40 40 45 50 42 42 42 42 42 42 42 50 
Phred software 
Seq 
Qual 
PHRED – lê o cromatograma e nomeia as bases. Cada base nomeada recebe 
uma pontuação correspondente à qualidade, de acordo com a fórmula: Q = -
10 log p. Um valor de PHRED igual a 20 significa que a base apresenta 1 
chance em 100 de estar errada. 
Montagem das Sequências 
CAP3 – forma contigs (agrupamentos com mais de uma sequência) e 
singlets (sequências únicas). 
CAGGTATATCGATGCGTAGCATGCAA 
CAGGTATATCGATGCGTAGCATGCAA 
GGTACAGGTATATCGATGCGTAGCATGCAAGAAAAAAAAAAAGTTCC 
GenBank 
Mutações Humanas 
Hemofilia 
Banco de dados: Esclerose amiotrófica 
26 
Grato pela Atenção! 
clbluiz2@gmail.com 
clayton@icb.ufg.br