Relatório biomol

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS
CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI 
ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS E BIOTECNOLOGIA
DOCENTE: RAIMUNDO WAGNER..
EXTRAÇÃO DE DNA
Brenda Rodrigues Fernandes
Estefânia Andrade
Laryssa Marinho
Layanne Amanda
Rafael Batista
Thaís Rosa
GURUPI – TO
SETEMBRO - 2014
Brenda Rodrigues Fernandes; Estefânia Andrade; Laryssa Marinho; Layanne Amanda; Rafael Batista; Thaís Rosa
RELATÓRIO PRÁTICO DE BIOLOGIA MOLECULAR
 Extração de DNA
Trabalho apresentado à disciplina de Biologia Molecular na graduação de Engenharia dee Bioprocessos e Biotecnologia da Universidade Federal do Tocantins, como parte das exigências avaliativas da disciplina sob orientação do Profº Raimndo Wagner de Souza Aguiar.
	
GURUPI – TO
SETEMBRO DE 2014
1. INTRODUÇÃO
A base da Biologia Molecular é o DNA e suas interações intracelulares. O DNA consiste em uma molécula que carrega a informação genética através de sequências de nucleotídeos, e está organizado em cromossomos. Pode, também, ser encontrado em algumas organelas que possuem material genético próprio, como as mitocôndrias (mtDNA) e os cloroplastos (ctDNA). Conter a informação gênica não é apenas armazená-la, mas também, expressá-la, ou seja, servir de molde para a síntese de outra cadeia polinucleotídica e codificar proteínas e enzimas, que é o que torna o DNA uma molécula funcional. (ZAHA et. al, 2003; ALBERTS et al, 2010; ALBERTS et al, 2006).
A composição do DNA é dada por fita dupla de nucleotídeos, onde as fitas são complementares, os nucleotídeos podem ser adenina (A), guanina (G), timina (T) e citosina (C). As fitas são unidas por pontes de hidrogênio devido ao pareamento dos nucleotídeos, que é dado pela interação dos mesmos, onde A se liga a T e G se liga a C. Os nucleotídeos são formados por um grupamento fosfato, uma base nitrogenada (púricas - A e G - e pirimídicas - T e C), e uma pentose, açúcar, que para o DNA é o desoxirribonucleico. E para que seja formado um filamento de DNA é necessária a ligação entre os nucleotídeos, através da ligação fosfodiéster, onde o fosfato está ligado entre os carbonos 5’ e 3’ da pentose (ZAHA et. al, 2003; ALBERTS et al, 2010; ALBERTS et al, 2006).
As bases nitrogenadas apresentam característica hidrofóbica, por este motivo encontram-se no centro da hélice, já os resíduos de desoxirribose e o ácido fosfórico são hidrofílicos, estando assim situados na periferia da molécula (ZAHA et. al, 2003; ALBERTS et al, 2010; ALBERTS et al, 2006).
Quando as pontes de hidrogênio são rompidas, as cadeias polinucleotídicas sofrem desnaturação, ou seja, são separadas, contudo, o DNA tem capacidade de se renaturar após tal processo, retornando a sua forma nativa e desempenhando suas funções anteriores. A renaturação é mais passível de ocorrer a baixas temperaturas. A duplicação do DNA é dita semiconservativa, pois é usada uma das fitas da molécula original como molde para que uma fita complementar seja sintetizada, sempre no sentido 5’→3’, e, assim, a informação genética é duplicada (ZAHA et. al, 2003; ALBERTS et al, 2010; ALBERTS et al, 2006).
Existem dois tipos de células, as procarióticas e as eucarióticas, sendo as ultimas muito mais complexas do que as primeiras. Nas eucarióticas, o DNA está separado em uma região denominada núcleo e nas células procarióticas o DNA está na forma de fita dupla circular, em um único cromossomo, não está posicionado em um lugar determinado da célula, e sim em uma região denominada nucleóide (ZAHA et. al, 2003; ALBERTS et al, 2010; ALBERTS et al, 2006).
A extração de DNA é um procedimento básico e extremamente importante para a clonagem molecular e os processos utilizados visam primeiramente, a quebra da parede celular, desnaturando a molécula e separando-a dos demais componentes celulares (proteína e organelas), de forma a purificar essa molécula. Desta forma, a purificação do material genético consiste na separação do DNA a partir dos restos celulares e das proteínas, principalmente as DNases, que degradam a molécula de DNA tanto em eucariotos como em procariotos. Existem várias técnicas para a extração de ácidos nucleicos, mas são diferentes quando aplicados para células animais e vegetais, em suma, consiste, primeiramente na quebra da parece celular, tanto para procariotos quanto para células vegetais, porém, este passo não é válido para células animais. Assim, todos os procedimentos de extração fornecem amostras que variam em peso molecular (LIMA, 2008; CORDEIRO, 2003).
A técnica de PCR permite a amplificação de segmentos de DNA (aproximadamente 100-500 pb) ou cDNA milhares e milhões de vezes (EMBRAPA, 2007; ZAHA, 2003). Para isso, é necessário que se misturem: o DNA com a sequência-alvo a ser amplificada, uma DNA-polimerase termoestável, dois oligonucleotídeos iniciadores, desoxirribonucleotídeos iniciadores (dNTPs), tampão de reação e concentração adequada de MgCl2. Depois de misturados todos os componentes, a amostra será colocada em um termociclador aparelho que aquecerá e resfriará rapidamente a amostra. A temperatura máxima será de ≈95 °C que possibilitará a desnaturação do DNA-alvo, a redução da temperatura para 45-65 °C provocará o anelamento dos iniciadores e a temperatura de ≈68 °C levará a extensão da cadeia de DNA, essas mudanças de temperatura se repetiram por pelo menos 20 a 30 ciclos (ZAHA,2003).
É possível analisar o material genético através da técnica de eletroforese, este método é utilizado para a separação de proteínas e fragmentos de DNA e RNA através da diferença de peso molecular das moléculas, onde a movimentação é dada pela submissão das mesmas a um campo elétrico, é uma técnica que necessita de um substrato para a “corrida” das moléculas, podendo ser gel, de agarose ou poliacrilamida, e papel. A Eletroforese em gel de Agarose é uma técnica que permite a visualização de moléculas de acordo com seu tamanho e carga elétrica (SANDOVAL, 2009). A agarose funciona como um filtro molecular, onde sua porosidade é inversamente proporcional à quantidade da substância no gel. Durante a eletroforese as moléculas de DNA se posicionam paralelamente ao campo elétrico gerado e migram do polo positivo para o negativo, devido às características do DNA, sendo que as moléculas de menor tamanho correm mais rapidamente do que aquelas de maior tamanho e, consequentemente, maior peso molecular, o que gera um padrão de bandeamento no gel, que pode ser visualizado através da coloração do gel com brometo de etídio e posterior submissão do complexo à luz ultravioleta (UV). (MAGALHÃES et al, 2005; CORRÊA; POSSIK, SD; COSTA-PINTO, SD; LIMA, 2008). Por ser uma técnica simples, rápida e de grande precisão, está atualmente muito infundida dentre as técnicas de análise molecular. 
2. OBJETIVO
Analisar, através de técnicas de extração de DNA e eletroforese, o material genético do organismo em estudo.
3. MATERIAIS E REAGENTES
Meio de cultura LB;
BT cry 2;
BT cry 4;
Solução GET; 
Tampão de lise (NaOH 0,2 M; SDS 1%);
Solução KACF;
Solução fenol:clorofórmio;
Isopropanol absoluto;
Álcool 80%;
H2O Milli-Q.;
Gelo;
Tubos eppendorf;
Ponteiras
Pipetas
4. MÉTODOS EXPERIMENTAIS
	
	Inoculou-se 100 𝜇L da suspensão bacteriana em 20 ml do meio de cultura LB que foi mantido em incubadora a 28° sob agitação de 180 rpm por aproximadamente 12h (overnight).
	Foram retiradas alíquotas de 600 𝜇L e lançadas em três tubos eppendorf que foram centrifugadas durante 5 min. A 4000 x g.
	O sobrenadante foi descartado e as células suspendidas em 150 𝜇L da solução GET.
Adicionou-se 150 𝜇L do tampão de lise (NaOH 0,2 M; SDS 1%). Homogeneizou-se suavemente por inversão, que foi deixada em repouso por 5 minutos em temperatura ambiente.
Foram acrescentadas 150 𝜇L de solução KACF e agitado bem (Vortex). Colocou-se em gelo por 5 min. 
Adicionou-se 100 𝜇L da solução fenol: clorofórmio e misturou-se por inversão.
As amostras foram centrifugadaspor 7 minutos a 4000 x g. 
O sobrenadante foi transferido para tubos novos e adicionou-se o mesmo volume de isopropanol absoluto, onde se misturou levemente e a suspensão foi mantida em freezer (2 a 4 horas). 
Passado esse período as amostras foram centrifugadas por 20 min. Feito isso, o sobrenadante foi descartado.
O DNA foi lavado com 1 mL de álcool 80%. Centrifugou-se a 5 min. a 4000 x g e o sobrenadante foi descartado. As amostras foram secadas completamente e suspendidas em 20 mL de H2O Milli-Q. 
Guardou-se as amostras de DNA em freezer (-20°C).
O gel de Agarose foi preparado de acordo com o seguinte protocolo:
Pesou-se 0,8g de águar, a qual foi dissolvida em 20 ml de água destilada;
A solução foi aquecida por 30 segundos no forno micro-ondas, sendo, em seguida, resfriada e colocada na cuba para solidificação. Nos sulcos formados no gel de agarose, foram adicionados o DNA, 1,0 µl do tampão de corrida e 5,0 µl do corante, sendo, em seguida, ligado em voltagem 110 V por cerca de 40 minutos.
O gel, após a corrida do DNA, foi imerso em Brometo de Etídeo por 20 minutos e, após este tempo, colocado dentro da cuba para visualização fotográfica dos resultados.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados obtidos após a visualização fotográfica na cuba para a Eletroforese em gel de Agarose do DNA da bactéria Bt estão representados na figura 
 	
 
Visualizando a figura, é possível perceber que os sulcos onde haviam sido colocados os DNA apresentaram sedimentação da molécula de DNA, ou seja, o DNA correu. 
CONCLUSÃO
A partir dos resultados obtidos, conclui-se que a extração de DNA é um processo que exige muito cuidado e seriedade em suas etapas, visto que algum erro inerente a todos os procedimentos e execução dos mesmos resultou em uma não visualização da corrida do DNA, quando no gel de Agarose. 
REFERÊNCIAS
ALBERTS, B.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.;WALTER, P. Biologia molecular da célula. 5 ed. Porto Alegre: Artmed, 2010, p. 197, 199 e 201.
ALBERTS, B.; BRAY, D.; HOPKIN, K.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.;WALTER, P. Fundamentos da biologiacelular. 2 ed. Porto Alegre: Artmed, 2006, p. 169, 170, 171 e 177.
LIMA, L. M. Conceitos Básicos de Técnicas em Biologia Molecular. Campina Grande: EMBRAPA, 2008.
CORRÊA, Elisete M.; POSSIK, Patrícia A. A análise de DNA por eletroforese.Disponível em: <http://www.ciencianews.com.br/siteDNA/testesgeneticos.pdf> Acesso em: 25 de setembro de 2014
COSTA, R. J. Técnica de Biologia Molecular: PCR (Reação em Cadeia da Polimerase). 2010.Disponível em: <http://www.portaleducacao.com.br/farmacia/artigos/8577/tecnica-de-biologia-molecular-pcr-reacao-em-cadeia-da-polimerase>. Acesso em 25 de setembro de 2014.
MAGALHÃES, Vanda D.,et al. Eletroforese em campo pulsante em bacteriologia – uma revisão técnica. Disponível em: <ses.sp.bvs.br/local/File/1033.pdf> Acesso em: 25 de setembro de 2014.
SANDOVAL, M. et. al.Extração do DNA e Eletroforese. Bacharelado em Medicina – Universidade Católica de Brasília, 2009. Disponível em: <http://www.slideshare.net/sousamarina/relatrio-extrao-de-dna-e-eletroforese>. Acesso em25 de setembro de 2014.
FERREIRA, H.B. Organização gênica de procariotos. In: ZAHA, A. ; FERREIRA, H.B; PASSAGLIA, L.M.P. (Org.) Biologia Molecular Básica. 3ed. Porto Alegre: Mercado Aberto, 2003.