Relatorio - Técnicas de semeadura e contagem de colônias

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PIAUÍ
CURSO DE NUTRIÇÃO
DISCIPLINA: MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
CLÁUDIA LORENA RIBEIRO LOPES
LARISSA LIMA EMERITO
TÉCNICAS BÁSICAS DE SEMEADURA EM PLACAS POUR PLATE E SPREAD PLATE E CONTAGEM DE COLÔNIAS EM PLACAS (PCA) E CÁLCULOS DOS RESULTADOS
PROFESSORA: MSC CLÉLIA DE MOURA FÉ CAMPOS
TERESINA
2014
CLÁUDIA LORENA RIBEIRO LOPES
LARISSA LIMA EMERITO
TÉCNICAS BÁSICAS DE SEMEADURA EM PLACAS POUR PLATE E SPREAD PLATE E CONTAGEM DE COLÔNIAS EM PLACAS (PCA) E CÁLCULOS DOS RESULTADOS
Relatório nº 4 apresentado à disciplina de Microbiologia de Alimentos como registro de atividade de Prática.
Profa. JULIANA MARIA LIBÓRIO EULÁLIO
TERESINA 
2014
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO	3
2 METODOLOGIA	5
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO	6
4 CONCLUSÃO	8
REFERÊNCIAS............................................................................................................9
1 INTRODUÇÃO
O método de contagem de microrganismos em placas é um método geral, que pode ser utilizado tanto para contagem de grandes grupos microbianos, como os aeróbios mesófilos, os aeróbios psicotrófilos, os bolores e leveduras e os clostrídius sulfitos redutores, como também para contagem de gêneros e espécies. Essa versatilidade é decorrente do princípio do método que se baseia na premissa de que cada célula microbiana presente em uma amostra irá formar, quando fixada em um meio de cultura sólido adequado, uma colônia variada e isolada (SILVA, JUNQUEIRA e SILVEIRA, 1997).
A análise dos alimentos para se verificar quais e quantos microrganismos estão presentes é fundamental para se conhecer as condições de higiene em que esse alimento foi preparado, seus riscos para os consumidores e sua vida útil. A análise microbiológica de um produto alimentício pode ser conduzida para investigar a presença ou a ausência de microrganismos nesse produto, quantificá-los e identificar as espécies presentes (FRANCO e LANDGRAF, 2008).	
Aycicek; Oguz; Karci (2006) consideram que a contagem em placas de bactérias aeróbias mesófilas é um dos indicadores microbiológicos para a qualidade do alimento. Os organismos aeróbios mesófilos refletem a exposição da amostra a qualquer contaminação (TORTORA, 2000). 
Atualmente biscoitos são produtos que podem ser obtidos após diversos processos, e constituem um dos alimentos mais populares e de maior consumo em todo mundo. É definido como um produto obtido por amassamento e cozimento conveniente de massas preparadas com farinhas, amidos, fécula fermentadas ou não e outras substâncias alimentícias. O Produto é designado Biscoito ou bolacha seguido da substância que o caracteriza ou por nomes consagrados pelo uso (BRASIL, 1978).
Alterações na qualidade de biscoitos envolvem mudanças físico-químicas, microbiológicas e sensoriais geralmente relacionadas ao tipo de embalagem utilizada, ao teor de umidade inicial entre outros fatores. As alterações sensoriais afetam a cor, sabor e consistência de biscoitos. Enquanto as microbiológicas ao crescimento de bolores e leveduras principais deteriorantes desse tipo de produto Essas mudanças podem ocorrer nos alimentos durante o processamento e a estocagem, quando estes são expostos a diferentes condições ambientais, as quaispodem desencadear uma série de reações que podem levar a sua degradação e consequente rejeição pelos consumidores (SINGH, 1994).
O objetivo do estudo foi conhecer as técnicas de semeadura mais utilizadas para a contagem de microrganismos em placas e compreender os métodos de contagem em placas de microrganismos e cálculo dos resultados.
2 METODOLOGIA
O estudo foi desenvolvido no Laboratório de Microbiologia de Alimentos do Departamento de Nutrição, na Universidade Federal do Piauí, na cidade de Teresina, no ano de 2014. Para realização utilizou-se materiais placa de petri, tubos de cultura com solução salina, pipetas, alça de Drigalski, pinças, tesoura, bico de busen, água peptonada em erlenmeyer, ágar padrão para contagem, álcool 70%, algodão e como amostra foi utilizado biscoito salgado.
Primeiramente identificou-se todos as placas que foram inoculadas, com o código da amostra e a sigla do meio de cultura contida. Primeiramente foi realizado plaqueamento em profundidade (Pour Plate), onde fundiu-se o meio de cultura em banho com água fervente, mantendo a fervura apenas o tempo necessário para a fusão do Agar, resfriou-se o meio em água fria e manteve-se a temperatura em torno de 44 a 46ºC até o momento do uso. Foi pesado na balança semi-analítica 25g do biscoito e foi colocado em erlenmeyer com 225 mL de água peptonada previamente esterilizada e homogeneizada (10-1). Dessa diluição (10-1), retirou-se 1,0 mL e transferiu-se para um tubo com 9,0 mL de solução salina peptonada (10-2). Já da diluição (10-2), retirou-se 1,0 mL e transferiu-se para um tubo com 9,0 mL de solução salina peptonada (10-3). 
Também foi retirado de cada diluição alíquotas de 1mL da amostra, com auxílio de uma pipeta e colocou-se no interior da placa, sendo utilizado as mesmas pipetas. Depois adicionou-se o meio de cultura PCA, em uma quantidade de 15 a 20mL no meio das placas e foi misturado o meio com o inoculo, movimentando suavemente as placas, numa superfície plana, em movimentos circulares no sentido horário e anti-horário. Posteriormente incubou-se as placas invertidas em estufas a 35ºC por 72 horas. 
No plaqueamento em superfície (spread plate) foi realizado o mesmo procedimento com as diluições (10-1) e (10-2), e com auxílio de uma alça de Drigalski, espalhou-se o inoculo por toda a superfície do meio até que o excesso de líquido seja absorvido. Por fim também incubou-se as placas invertidas em estufas a 35ºC por 72 horas.
Finalizando com a contagem de unidades formadoras de colônias (UFC), após essas 72 horas.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O plaqueamento, método convencional de contagem de microrganismos, pode ser feito por semeadura na superfície do meio de cultura previamente distribuído em placas de Petri estéreis (semeadura em superfície) ou, então, o meio de cultura pode ser adicionado após a transferência das alíquotas da placa de Petri vazias (semeadura em profundidade). Embora o método da contagem-padrão em placas (CPP) seja mais frequentemente realizado pela técnica do pour plate, resultados comparativos podem ser obtidos por plaquamento em superfície (JAMES M. JAY, 2005).
As tabelas abaixo apresentam os valores respectivos de crescimento bacteriano nas técnicas de profundidade e superfície, após 72 horas, apresentados na amostra de biscoito.
TABELA 01- Crescimento bacteriano em amostra de biscoito na técnica pour plate. Teresina- PI, 2014.
	PROFUNDIDADE
	Diluição
	10-1
	10-2
	10-3
	Resultado
	0
	0
	0
Fonte: Laboratório de Microbiologia.
Após 72 horas de incubação, fez-se a contagem de colônias em cada placa. Os resultados analisados pelo método de semeadura em profundidade demonstram que nenhuma das diluições apresentou crescimento de colônias.
O resultado obtido encontra-se em acordo com o objetivo da semeadura e contagem de microrganismos em placas, que é de verificar se há presença ou ausência em determinado alimento. Nesse caso, em semeadura por pour plate, o desenvolvimento de microrganismo não é comum, principalmente se o microrganismo inoculado for aeróbio e necessitar ficar próximo da superfície para que haja crescimento, o que não ocorre no método de semeadura por profundidade (FORSYTHE, 2002).
Segundo Jay (2005), quando se utiliza a técnica de semeadura em profundidade, inocula-se de 0,1 a 1,0 ml de células. Esta técnica é precisa quando o número de colônias (ou placas de lise, no caso de partículas virais) contadas situa-se entre 30 e 300 e quando as condições culturais e ambientais estão adequadas para os microrganismos analisados. Este tipo de contagem está sujeito a grandes erros, que podem ser minimizados pela realização de triplicatas para cada diluição.
De acordo com Franco e Landgraf (2008), a capacidade de sobrevivência ou multiplicação de microrganismos que estão presentesem um alimento depende de uma série de fatores, como Atividade de água (Aa), acidez e composição química do alimento, assim como também fatores externos, como umidade, composição da atmosfera e temperatura.
TABELA 02- Crescimento bacteriano em amostra de biscoito na técnica spread plate. Teresina- PI, 2014.
	SUPERFÍCIE
	Diluição
	10-1
	10-2
	10-3
	Resultado
	3
	1
	0
Fonte: Laboratório de Microbiologia.
Os resultados obtidos na técnica mencionada pela tabela acima demonstra que nas diluições 10-1 e 10-2 houve crescimento de colônias, sugerindo uma inadequada manipulação no preparo da amostra, já na diluição 10-3 não houve crescimento de colônias, demostrando uma correta manipulação e preparo da amostra.
O plaqueamento por superfície oferece vantagens na determinação do número de psicrotróficos sensíveis ao calor presentes em um alimento, uma vez que os microrganismos não entram em contato com o ágar derretido (JAY, 2005). Pode-se assim dizer, que como uma colônia normalmente é originada a partir de um organismo, o total de colônias que se desenvolvem no meio corresponde ao número de células viáveis presentes na alíquota analisada.
4 CONCLUSÃO
Concluiu-se que de maneira geral, essas técnicas de semeadura e contagem de microrganismos, constituem-se como uma grande ferramenta de detecção e inspeção da qualidade de alimentos, podendo avaliar os riscos que os produtos alimentícios oferecem à população e traduzem-se importantes para a Microbiologia de Alimentos, para verificar se os padrões microbiológicos estão sendo atendidos.
9
REFERÊNCIAS
AYCICEK, H.; OGUZ,U.; KARCI, K. Determination of total aerobic and indicator bacteria on some raw eaten vegetables from wholealers in Ankara, Turkey. International Journal of Hygiene and Environmental Health. v. 209, n. 2, p. 197-201, 2006. 
Brasil, Resolução RDC N º. 12, DE 30/03/1978 da Comissão Nacional de Normas e Padrões para Alimentos - CNNPA. Estabelece normas técnicas especiais relativas a alimentos (e bebidas). Disponível em: <http://elegis.bvs.br/leisref/public/showAct.php?id=16216&mode=PRINT_VERSION>. Acesso em: 28. Maio. 2014. 
FORSYTHE, F. J. Microbiologia da Segurança Alimentar. Porto Alegre: Artmed, 2002.
FRANCO, B. D.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos Alimentos. São Paulo: Atheneu, 2008.
JAY, J. M. Microbiologia dos Alimentos. Porto Alegre: Artmed, 2005.
SILVA, N.; JUNQUEIRA, V. C. A.; SILVEIRA, N. F. A. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos. 2° Ed. São Paulo: Livraria Varela, 1997.
SINGH, R. P. Scientific principles of shelf life evaluation. In: Man, C. M.D.; Jones, A. A. 
(Ed). Shelf life evaluation of foods. 1a ed. London: Blackie Academic and Professional, 1994, p.3-24. 
TORTORA, G. Microbiology. The Benjamín/Cummings Publishing Company Inc., New York, USA, p. 274-278, 2000.